Summary
Nous présentons une cytométrie de flux basé sur la méthode pour examiner le développement des cellules T
Abstract
Un système immunitaire sain nécessite que les cellules T répondent aux antigènes étrangers tout en restant tolérant aux antigènes du soi. Réarrangement aléatoire du récepteur des cellules T (TCR) α et β loci génère un répertoire de lymphocytes T avec la grande diversité dans la spécificité d'antigènes, à la fois pour soi et étranger. Sélection du répertoire au cours du développement dans le thymus est essentiel pour générer sûrs et utiles lymphocytes T. Les défauts de la sélection thymique contribuer au développement de maladies auto-immunes et de l'immunodéficience 1-4.
Progéniteurs des cellules T entrez le thymus que double négatifs (DN) thymocytes qui n'expriment pas CD4 ou CD8 co-récepteurs. L'expression de la αβTCR et les deux co-récepteurs se produit à la double positif (DP) scène. L'interaction de la αβTCR avec l'auto-peptide-CMH (pMHC) présenté par les cellules thymiques détermine le sort de la thymocytes DP. Interactions de haute affinité conduire à une sélection négative et éliminationtion des matières autoréactives thymocytes. Faible affinité des interactions se traduisent par une sélection positive et le développement de CD4 ou CD8 simples positives (SP) des lymphocytes T capables de reconnaître des antigènes étrangers présentés par CMH du soi 5.
La sélection positive peut être étudiée chez la souris avec un anticorps polyclonal (type sauvage) répertoire de TCR en observant la génération de cellules T matures. Cependant, ils ne sont pas idéales pour l'étude de la sélection négative, ce qui implique la suppression de petites populations spécifiques de l'antigène. De nombreux systèmes modèles ont été utilisés pour étudier la sélection négative, mais varient dans leur capacité de récapituler les événements physiologiques 6. Par exemple, la stimulation in vitro des thymocytes manque de l'environnement thymique qui est intimement impliqué dans la sélection, tandis que l'administration de l'antigène exogène peut conduire à la non-spécifique suppression des thymocytes 7-9. À l'heure actuelle, les meilleurs outils pour l'étude de la sélection négative vivo sont des souris qui expriment une transgenic TCR spécifique pour endogène auto-antigène. Toutefois, de nombreux modèles classiques TCR transgéniques sont caractérisées par prématurée expression transgénique de la chaîne TCRα au stade DN, entraînant prématuré de sélection négative. Notre laboratoire a mis au point le modèle HY cd4, dans lequel le transgénique HY TCRα est conditionnellement exprimé au stade DP, permettant la sélection négative se produire lors de la DP à la transition SP comme c'est le cas chez les souris de type sauvage 10.
Ici, nous décrivons une cytométrie de flux à base de protocole pour examiner thymique sélection positive et négative dans le modèle HY souris CD4. Bien que la sélection négative chez la souris cd4 HY est très physiologique, ces méthodes peuvent également être appliquées à d'autres modèles transgéniques TCR. Nous présenterons également les stratégies générales pour l'analyse de la sélection positive dans un répertoire polyclonal applicable à toutes les souris manipulées génétiquement.
Protocol
Reportez-vous à la figure 1 pour un schéma d'ensemble du protocole expérimental.
1. Dissection
- Lieu écran stérile en maille d'acier plat 60 x 15 mm Petri. Une unité est nécessaire pour chaque échantillon de tissu.
- Ajouter 5 ml de solution saline équilibrée de Hank (HBSS) à chaque plat. Garder les plats sur la glace.
- Euthanasier les souris avec du CO 2.
- Souris fixe sur une surface de dissection, face ventrale vers le haut. Souris de pulvérisation avec de l'éthanol 70% pour la stérilisation et à faire en sorte que la fourrure est emmêlée vers le bas.
- Avec des ciseaux chirurgicaux, commencer la dissection en faisant une incision ventrale dans la peau de l'abdomen juste au-dessus des organes génitaux. Étendre vers le haut incision sous le menton.
- De la ligne médiane, de prolonger l'incision le long de tous les membres. Tirez la peau lâche et épingler à la surface de dissection.
- Récolter le thymus:
- Relever l'extrémité inférieure du sternum pour faire une incision.
- Éviter le foie, couper la membrane de détacher la cage thoracique, puis couper la cage thoracique de chaque côté. Couper vers le haut la cage thoracique de chaque côté, en prenant soin d'éviter les poumons et le cœur.
- Tirez doucement sur le dos cage thoracique avec une pince. Le thymus est un blanc, un organe bilobé situé au-dessus du cœur. En utilisant le côté plat de la pince pour saisir le fond des lobes, tirez doucement sur le thymus et le poser sur le tamis.
- Récolter la rate:
- La rate est un rouge, en forme de planche de surf organe situé sur le côté gauche de la cavité abdominale de la souris, en dessous du foie.
- Faire une incision dans la cavité abdominale. Tirez doucement sur la rate avec une paire de pinces, en utilisant la deuxième paire de taquiner l'écart du tissu conjonctif. Placer la rate sur un tamis à mailles séparé.
2. Préparation des cellules
- L'utilisation d'un piston d'une seringue de 3 ml, meulerorganes dans le tamis jusqu'à ce que le tissu conjonctif et les restes de graisse. Rincer avec du HBSS maille de la capsule trois fois. Utilisez un piston neuf pour chaque échantillon de tissu.
- D'autres options pour l'homogénéisation du tissu peut être utilisé à la place de cette méthode.
- Compter les cellules à l'aide d'un hémocytomètre.
- Cellules par centrifugation à 335 xg pendant 5 min à 4 ° C.
- Splénocytes remettre en suspension dans 500 ul de tampon de lyse ACK (0,15 M NH 4 Cl, 10 mM KHC0 3, 0,1 mM Na 2 EDTA, pH 7,2) pendant 10 min à température ambiante. Remettre les thymocytes à 20 x 10 6 cellules / ml dans du tampon FACS (PBS, 1% de FCS, de l'azoture de sodium à 0,02%) et mis de côté sur la glace.
- Retour splénocytes à l'isotonie par addition de 5 ml de HBSS. Splénocytes par centrifugation et remettre en suspension à 20 x 10 6 cellules / ml dans du tampon FACS. Si les cellules ont besoin pour demeurer stérile, vous pouvez utiliser stérile du RPMI + 10% FCS.
3.Les cellules de coloration pour cytométrie en flux
Le but de ce protocole est de définir des stratégies pour l'analyse de la sélection positive et négative à l'aide de type sauvage (WT) et cd4 HY souris. Pour des considérations générales sur la cytométrie en flux expérimental, l'acquisition et l'analyse, nous renvoyons le lecteur à une excellente revue par Tung et al 11.
- Aliquoter 4 x 10 6 thymocytes par échantillon cytométrie en flux à chaque puits d'une plaque de 96 puits, ainsi que 1 x 10 6 splénocytes par WT commande de compensation. Si vous utilisez des souris transgéniques, vous devez inclure une souris WT comme témoin dans votre expérience.
- Bloquer les récepteurs Fc par incubation des cellules avec anti-CD16/32 (clone 2.4G2) pendant 10 min sur la glace.
- Faites tourner la plaque à 335 xg à 4 ° C pendant 5 min. Retirer le couvercle et dissiper liquide des puits en tapotant la plaque une fois, face vers le bas dans un évier. Resuspendre chaque puits dans 200 ul de tampon FACS. Répéter le lavage.
- Préparer des cocktails d'anticorps indiquées ci-dessous, en utilisant la concentration optimale de chaque anticorps en fonction de la dilution dans 200 pi de tampon FACS par puits. La concentration optimale de chaque anticorps est définie comme la concentration minimale nécessaire pour obtenir la plus grande séparation des populations positives et négatives. S'il n'y a pas de population négative pour un anticorps donné, un anticorps isotype doit être inclus. Le volume total par puits peut être réduite (par exemple à 100 l par puits), si désiré.
- WT thymus: anti-TCRβ, anti-CD4, anti-CD8, anti-CD69 ou anti-CD5, anti-CD24
- Cd4 HY thymus: anti-HY TCR (T3.70), anti-CD4, anti-CD8, anti-CD69 ou anti-CD5, anti-CD24
Pour obtenir une meilleure séparation des lo CD69 et CD69 hi populations de thymocytes, il est recommandé un anticorps biotinylé anti-CD69 primaire servir, suivie d'une tache secondaire contenant conjugué à un fluorochrome streptavidine. Nous usoi la même stratégie pour CD5 coloration.
- Incuber les cellules avec 200 pi de cocktail d'anticorps dans un tampon de FACS pendant 30 min sur la glace dans l'obscurité.
- Parallèlement à coloration cocktail d'anticorps, de la teinture chaque commande de compensation avec un seul anticorps conjugué à un fluorochrome. Idéalement, la coloration compensation implique que les mêmes anticorps utilisés dans le cocktail d'anticorps. Cependant, la coloration pour chaque antigène individuel peut ne pas être possible pour les grandes expériences lors de nombreux antigènes sont en cours d'analyse. Par conséquent, la coloration soit pour les anticorps anti-CD4 ou anti-CD8 est recommandé en raison de la forte expression de ces antigènes, ou l'utilisation de billes de rémunération. Colorer dans une mémoire tampon FACS pendant 30 min sur la glace dans l'obscurité. Laissez une commande de compensation non colorées.
- Laver les cellules deux fois avec du tampon FACS.
- Resuspendre les cellules dans du tampon FACS et transfert à tubes FACS.
- Prélever des échantillons sur cytomètre de flux. Comprennent l'acquisition de FSC-A et FSC-W à unllow de discrimination doublet.
4. Analyse des données de cytométrie en flux - Non-souris transgéniques TCR
Nous utilisons FlowJo pour la cytométrie en flux analyse des données. Reportez-vous à la figure 2A de la stratégie de déclenchement pour les souris transgéniques non-TCR.
- Utilisation FSC-A par le SSC, portail électronique sur le "lymphocytes" de la population.
- Dans le cadre du «lymphocytes» de la population, utiliser FSC-A par le FSC-W électroniquement la porte du FSC-W lo population d'exclure doublets cellulaires et aggregrates. Il s'agit de la «singulet» du portail.
- Utilisation des événements dans le "singlet" porte, l'intrigue CD8 par le CD4. Dessinez portes pour DN, DP terne, DP lumineux, CD4 + CD8 populations lo, CD4SP et CD8SP comme le montre la figure 2B.
- Sous les portes CD4SP et CD8SP, créer TCRβ par CD24 parcelles. Utilisez l'outil de déclenchement quadrant de tirer portes tel que représenté sur la figure 2C.
- Créer un new complot de la "singlet" portail: TCRβ par CD69. Tirer portes A, B, C, D comme représenté sur la figure 2D.
- Créer un nouveau complot de la "singlet" portail: TCRβ par CD5. Dessinez portes i, ii, iii, iv comme le montre la figure 2E. C'est une autre stratégie pour l'examen de sélection positive.
- Appliquer DN, DP terne, DP lumineux, int CD4, CD4SP et CD8SP portes à partir de la rubrique «singulet» aux portes i, ii, iii, iv, A, B, C, D (figure 2D, E).
- Calculer le nombre de cellules dans un sous-ensemble particulier en multipliant cellularité orgue de la fréquence de chaque porte subséquente jusqu'à ce que vous atteignez votre population cible. Par exemple, le nombre de TCRβ hi-CD69 CD8SP thymocytes serait déterminée par le thymus cellularité x% TCR bhi CD69-(fraction D) CD8SP% x.
- Compter prend déjà en compte les cellules vivantes et mortes afin de ne pas inclure le lymphoc "YTE «porte dans vos calculs.
5. Analyse des données de cytométrie en flux - TCR des souris transgéniques
Reportez-vous à la figure 3A pour la stratégie de déclenchement pour les souris transgéniques TCR.
- Suivez les étapes 4.1 et 4.2 comme dans la section précédente.
- Dans le cadre du «singulet» porte, créez un T3.70 par parcelle SSC et porte sur le T3.70 + population de cellules à analyser spécifiques de l'antigène des cellules T (figure 3B). Dans certaines circonstances, il peut être intéressant de comparer cette population à la non-specific antigen (T3.70-) population de cellules T.
- Sein de la population T3.70 +, tirage DN, DP, CD4SP et CD8SP portes (figure 3C).
- Pour les échantillons de contrôle WT, dessiner ces portes sous la rubrique "singulet" portail ou créer un T3.70 porte car il y aura très peu de cellules T3.70 +.
- Sous la porte CD8SP, créer unT3.70 par CD24 parcelle. Utilisez l'outil de déclenchement quadrant de diviser les cellules en quatre populations (figure 3F).
- Créer un histogramme représentant superposée expression de CD69 dans le compartiment DP de souris WT et T3.70 + DP compartiment de souris cd4 HY (figure 4A). Répétez l'opération pour examiner CD5 expression (figure 4B).
- Calculer le nombre absolu de cellules dans chaque sous-ensemble d'intérêt que dans 4,8.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
En physiologiques modèles transgéniques TCR et les souris WT, la sélection positive commence à l'étape DP lumineux avant de passer à l'étape DP terne après la rencontre antigène. Thymocytes DP ternes puis entrez un nombre de CD4 + CD8 étape de transition avant de devenir lo CD4SP ou thymocytes CD8SP (figure 2B). Thymocytes matures SP se caractérise par une forte expression du TCR et la perte du CD24 (figure 2C). Alors que le CD8 par CD4 profil peuvent révéler des défauts dans la sélection positive, en examinant TCRβ par CD69 ou CD5 peut donner un meilleur aperçu où le défaut se trouve. Les deux CD69 et CD5 sont régulés à la hausse après stimulation du TCR, avec un renforcement des interactions de conduite plus haute expression de ces marqueurs.
Sur le terrain TCRβ par CD69, porte A (TCRβ lo CD69-) représente une population de thymocytes DP pré-sélection, la porte B (CD69 int TCRβ +) représente un trpopulation ansitional directement après l'engagement du TCR, porte C (TCRβ salut CD69 +) représente la population de cellules directement après sélection positive, et la porte D (TCRβ salut CD69 -) représente une population plus mature des cellules (figure 2D). Dans une souris WT, porte A est constitué de cellules DP vives, tandis que la porte B se compose principalement de DP lumineux avec une sourde DP CD4 + et CD8 lo. Porte C se compose principalement de DP terne, CD4 + CD8 et les cellules lo CD4SP, alors que la porte D se compose principalement de CD4SP et CD8SP. Absence de populations B et C peuvent être le signe d'une sélection positive avec facultés affaiblies. L'évolution du ratio de CD4SP à CD8SP au sein de la population D peut suggérer des modifications à l'engagement de la lignée. La perte de populations C et D peuvent refléter des problèmes de survie suite à une sélection positive.
L'examen TCRβ par CD5 est une autre stratégie de to identifier les populations de sélection pré-et post-positif. Population i (TCRβ lo lo CD5) représente pré-sélection thymocytes DP et de la population ii (TCRβ lo CD5 int) sont des cellules initiant une sélection positive (figure 2E). Ces populations se composent principalement de thymocytes DPbright. Population iii (TCRβ int CD5 salut) représente thymocytes en train de subir une sélection positive et consistent principalement en DP terne et thymocytes CD4 + CD8 lo. Population iv (TCRβ salut salut CD5) se compose principalement de post-thymocytes SP positifs de sélection. Génération des populations affaiblies ii et iii suggère défectueuse sélection positive. L'évolution du ratio de CD4SP à CD8SP au sein de la population, malgré iv populations normales précédents peuvent suggérer des modifications à l'engagement de la lignée. L'absence de la population iv peut indiquer diminution de la survie à la suite positives sélectiontion. Par exemple, dans TOX - / - souris, défectueux différenciation CD4SP conduit à une réduction drastique des populations iv, C et D alors que la sélection positive reste intacte 12. Défauts réels dans la sélection positive peut être vu avec inactivation Bcl11b pendant la phase de DP, ce qui conduit à la perte de populations B, C et D 13,14. RasGRP1 souris déficientes présentent un défaut au début de la sélection positive, ce qui entraîne la présence de la population seulement un. (Données non publiées)
Comme la sélection négative implique la suppression de petites populations spécifiques de l'antigène, les défauts de ce processus sont les mieux observés en utilisant des souris transgéniques TCR. Chez la souris cd4 HY, thymocytes exprimant le TCR transgénique HY peut être détecté avec l'anticorps monoclonal T3.70 (figure 3B). Le TCR reconnaît l'antigène HY HY mâle-spécifique présentée dans le CMH de classe ID b. Ainsi, cd4 HY mâles (M) souris subissent une sélection négative de HY TCR
Une mise en garde de modèles transgéniques TCR est que le TCR transgénique est exprimée fortement au cours du développement des thymocytes. En conséquence, il est difficile de caractériser davantage la sélection positive par l'identification des populations sur la base de TCR et CD69/CD5 expression. Cependant, CD69 et CD5 expression ne corrélation avec la force de signalisation du TCR. Chez les souris WT, la plupart des thymocytes DP ne subissent pas de sélection positive ou négative, ce qui nécessite l'engagement de TCR pMHC, et n'ont donc pas réguler à la hausse ou CD5 CD69. Souris HY F CD4 ont une importante population de thymocytes DP T3.70 + qui subissent une sélection positive, comme l'indique une augmentation de la population CD69 + par rapport au WT (figure 4A). La sélection négative implique une plus grande affinité du TCR relance de sélection positive, ce qui est indiqué par une expression plus élevée de CD69 sur T3.70 thymocytes DP + en HY M cd4 souris, ce qui entraîne un changement of le pic d'histogramme vers la droite. Des tendances similaires sont observées avec CD5 expression (figure 4B). Lorsque l'on analyse la sélection thymique chez les souris manipulées génétiquement, en examinant CD69 ou CD5 expression peut déterminer si le défaut se trouve avec signalisation du TCR ou un résultat en aval de la stimulation du TCR.
Figure 1. Diagramme d'ensemble du protocole expérimental.
Figure 2. Analyser la sélection thymique chez les souris transgéniques non-TCR. Stratégie d'ouverture de porte (A) pour analyser la sélection thymique chez la souris transgénique non-TCR. (B) CD8 par le profil de CD4 d'un thymus WT. (C) L'examen de la maturité des thymocytes SP par TCRβ et CD24 expression. (D) Les étapes de sélection positive se distingue parCD69 par l'expression TCRβ, avec CD8 et CD4 profilage dans chaque sous-ensemble. (E) TCRβ par CD5 est une autre stratégie qui peut être utilisé pour séparer les stades de développement. Cliquez ici pour agrandir la figure .
Figure 3. Analyser la sélection thymique chez la souris cd4 HY. Stratégie d'ouverture de porte (A) pour analyser la sélection thymique chez des souris transgéniques TCR. (B) La fréquence des thymocytes exprimant le TCR HY (T3.70 +) dans WT, HY HY cd4 F et M cd4 souris. (C) CD8 par les profils de la population CD4 + chez la souris T3.70 indiqués. En plus de fréquences, le nombre absolu de T3.70 + DP (D) et surtout T3.70 + CD8SP (E) thymocytes sont des indicateurs importants de sélection négative. (F) L'examen de lamaturité des thymocytes des souris CD8SP indiqués. Cliquez ici pour agrandir la figure .
Figure 4. L'expression de marqueurs d'activation CD69 (A) et CD5 (B) sur les thymocytes DP totales de WT et T3.70 + thymocytes DP de HY cd4 F et M cd4 HY souris.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Le protocole présenté ici peut être utilisé pour examiner sélection positive et négative dans le non-TCR transgénique et TCR des souris transgéniques. Ce protocole décrit la coloration des antigènes de surface. Pour une analyse plus approfondie des mécanismes moléculaires, il est souvent nécessaire d'effectuer une coloration intracellulaire. Nous utilisons la BD Biosciences Cytofix / Cytoperm Kit pour la plupart des protéines intracellulaires et le kit de BD Biosciences coloration pour des facteurs de transcription Foxp3. Nous avons l'habitude d'acquérir nos échantillons immédiatement après la coloration. Cependant, les échantillons peuvent être conservés pendant une nuit dans du tampon FACS avec du formaldéhyde à 1% à 4 ° C dans l'obscurité. Soyez conscient que certains fluorochromes et les anticorps peuvent ne pas être compatibles avec la fixation.
Pour l'analyse de la sélection positive, nous vous recommandons d'utiliser biotinylé anti-CD69 ou anti-CD5 pour assurer une meilleure séparation des populations négatives, intermédiaire et haute expression (Figure 2). Comme décrit dans les résultats représentatifs,cette stratégie de déclenchement permet de distinguer les défauts de la sélection positive de l'engagement de la lignée, car les deux peuvent nécessiter différentes suivi. En plus de produire des thymocytes SP matures, de sélection positif peut être confirmé par la régulation positive de l'IL-7Rα et CCR7. Cependant, ces marqueurs sont exprimés à un niveau bas sur les thymocytes DP après sélection par rapport aux thymocytes SP 15,16. Pour une analyse détaillée des étapes de maturation dans le compartiment DP, intracellulaire ZAP70 expression peut être mesurée 17. Cela peut être particulièrement utile pour démontrer que les populations avec l'expression de marqueurs de maturation similaire, tels que i et ii du TCRβ x CD5 parcelle (figure 2E), représentent différents stades de développement.
Le modèle HY cd4 a l'avantage de représenter à la fois positive et négative de sélection, ainsi que l'expression physiologique de la TCR transgénique. Cependant, ces méthodes peuvent être appliquées àd'autres modèles TCR transgéniques avec certaines considérations. Toujours comporter un anticorps dirigé contre le TCR transgénique de choix pour permettre l'étude de cellules T spécifiques de l'antigène. Pour certaines analyses, il peut être intéressant de comparer la population spécifique de l'antigène à la population non spécifique comme contrôle interne. L'étude de la sélection négative dans d'autres modèles transgéniques TCR nécessite un examen plus approfondi. Le stade de développement des thymocytes au cours de laquelle a lieu la sélection négative varie entre les différents modèles transgéniques TCR. Cd4 HY thymocytes engager pMHC au stade DP, ainsi analyse de la population spécifique HY-CD8SP descendance est correcte pour l'affichage de sélection négative 10,18 (figure 3). Si la sélection négative se produit au cours de la transition à DN DP comme chez les souris classiques HY 19, l'analyse de l'intérêt serait la présence ou l'absence de thymocytes DP spécifiques de l'antigène. La sélection contre l'antigène HY omniprésente se produit dans le thymuscortex 20. En revanche, la sélection négative contre le tissu restriction antigènes se produit dans le thymus moelle 21,22. OT-I-RIP Mova souris récapituler ce type de sélection que l'antigène OVA est exprimée sous le contrôle du promoteur de l'insuline de rat, qui n'est active que dans la moelle du thymus et du pancréas 23. Depuis la sélection positive des thymocytes DP dans le cortex thymique est d'abord nécessaire pour la migration vers la médulla, l'absence de maturité (CD24 lo) OT-I TCR + thymocytes CD8SP indique réussie sélection négative dans OT-I-Rip Mova souris 24.
Tout en utilisant des souris transgéniques TCR a l'avantage d'être en mesure d'étudier une grande population de cellules spécifiques de l'antigène, une mise en garde potentiel est altéré le développement des cellules T par des ligands limitées qui peuvent médier la sélection positive et négative de la TCR transgénique. En cd4 RAG-HY suffisantes souris, une autre mise en garde est que la co-expression de endogènesNOUS chaînes TCRα a le potentiel de moduler la sélection positive et négative sur une minorité de HY TCR + thymocytes. Cette mise en garde n'est pas unique au modèle HY cd4, mais plutôt des modèles transgéniques TCR en général. Les cd4 HY représentatifs présentés sont issus de souris cd4 HY sur un fond Rag-suffisante. Bien que quelque peu plus complexe dans la nature, il ya plusieurs façons d'étudier la sélection des thymocytes dans un cadre plus physiologique de la fréquence de précurseur limitée. Par exemple, TCR transgénique et WT mixtes chimères de moelle osseuse peuvent être générés pour réduire la fréquence spécifique de l'antigène précurseur de thymocytes. En outre, on peut utiliser des souris exprimant seulement une chaîne TCRβ transgénique, tels que la chaîne du TCR VB8 HY 25 ou la chaîne du TCR VB5 OT-26 I de limiter la fréquence des précurseurs. Parce que la chaîne TCRβ transgénique est jumelé avec diverses chaînes TCRα endogènes, le suivi de l'antigène spécifique de re thymocytesrequiert l'utilisation de tétramères pMHC. Une limitation de cette méthode est que l'expression du TCR est trop faible sur les thymocytes DP pour permettre la détection avec des tétramères. Cela limite poursuivre l'étude des mécanismes moléculaires dans les thymocytes DP qui mènent à la sélection positive et négative. Plus récemment, une combinaison de tétramères pMHC et d'enrichissement magnétique bourrelet a été utilisée pour dénombrer de petites populations spécifiques de l'antigène de cellules T CD4 + chez les souris non manipulées 27.
La sélection négative est principalement médiée par délétion clonale des matières autoréactives thymocytes par la voie de l'apoptose intrinsèque. Thymocytes apoptotiques peut être détectée par cytométrie en flux en utilisant une coloration intracellulaire de clivage de la caspase-3. La BH3-only Bcl-2 Bim membre de la famille est essentiel pour l'activation de caspase-3 dans les thymocytes en réponse à la stimulation du TCR 18,28. En croisant Bim souris déficientes pour différents modèles transgéniques TCR, notre laboratoire a constaté que Bim est nécessaire pour le négatif sélectiontion contre les antigènes du soi omniprésents mais pas tissulaire restreinte d'antigènes, ce qui indique l'existence de plusieurs mécanismes de sélection négatifs 18,29. Des approches similaires ont mis en cause la Nur77 récepteur orphelin stéroïdes comme un autre médiateur clé de la sélection négative thymique 30,31. Analyse transcriptionnelle des thymocytes DP de souris cd4 HY a généré une liste de gènes spécifiquement induits lors de la sélection positive et négative 32. En appliquant les méthodes présentées ici pour les souris manipulées dans ces gènes peuvent donner un aperçu des mécanismes moléculaires de la sélection thymique.
Il est idéal pour le suivi de l'examen sélection thymique par une analyse du compartiment périphérique immunitaire. Cependant, il est souvent difficile de séparer la suppression central et périphérique. Sélection négative se traduit finalement par l'absence de l'auto-immunité. Même si elles ont des limites, TCR des souris transgéniques sont un moyen puissant et pratique pourétude physiologique de sélection négative. Traversée du TCR des souris transgéniques à des souris déficientes en gènes particuliers est un moyen efficace pour étudier les mécanismes moléculaires de la sélection négative. Il est important d'être conscient, cependant, que l'inflammation périphérique due à une anomalie génétique peut entraîner non spécifique médiée par la suppression des thymocytes corticostéroïdes et des cytokines 7-9. Dans de tels cas, la stratégie présentée ici peut être appliquée à l'analyse des Thymi de souriceaux nouveau-nés avant l'apparition de l'inflammation. La sélection positive, d'autre part, peuvent être étudiés en soit TCR ou modèles transgéniques non-TCR, sauver les enquêteurs les troubles de croisement. Une meilleure compréhension des molécules impliquées dans la sélection positive et négative conduira à de nouvelles stratégies pour le diagnostic et le traitement des maladies auto-immunes et l'immunodéficience.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Aucun conflit d'intérêt déclaré.
Acknowledgments
Les auteurs tiennent à remercier Bing Zhang pour son aide technique. Ce travail a été financé par les Instituts de recherche en santé (MOP-86595). TAB est un nouveau chercheur des IRSC et chercheur AHFMR. QH est soutenu par une bourse d'études supérieures du Canada des IRSC - Doctorat et une AIHS à temps plein bourse. SAN est soutenu par une bourse de la Reine Elizabeth II d'études supérieures. AYWS est soutenu par une bourse d'études supérieures du CRSNG - Doctorat.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| HyClone Hank's balanced salt solution | Thermo Scientific | SH30030.02 | |
| Metal mesh screens | Cedarlane | CX-0080-E-01 | |
| Petri dishes (60 x 15 mm) | Fisher Scientific | 877221 | |
| Syringes (3 ml) | BD Biosciences | 309657 | |
| Conical tubes (15 ml) | Sarstedt | 62.554.205 | |
| Microscope | Zeiss - Primo Star | 415500-00XX-000 | |
| Hemocytometer | Hausser Scientific | 3110 | |
| 96-well plate | Sarstedt | 82.1582.001 | |
| Multichannel pipette | Fisherbrand | 21-377-829 | |
| Fetal calf serum | PAA | A15-701 | |
| Phosphate buffered saline | Fisher Scientific | SH3025802 | |
| Sodium azide | IT Baker Chemical Co. | V015-05 | |
| FcR blocking reagent | Clone 2.4G2 | ||
| Anti-mouse HY TCR | eBioscience | XX-9930-YY* | Clone T3.70 |
| Anti-mouse CD4 | eBioscience | XX-0042-YY* | Clone RM4-5 |
| Anti-mouse CD8α | eBioscience | XX-0081-YY* | Clone 53-6.7 |
| Anti-mouse CD24 | eBioscience | XX-0242-YY* | Clone M1/69 |
| Anti-mouse TCRβ | eBioscience | XX-5961-YY* | Clone H57-597 |
| Anti-mouse CD69 Biotinylated | eBioscience | 13-0691-YY* | Clone H1.2F3 |
| Anti-mouse CD5 Biotinylated | eBioscience | 13-0051-YY* | Clone 53-7.3 |
| Streptavidin | eBioscience | XX-4217-YY* | |
| Flow cytometer | BD Biosciences - FACS Canto | 338962 | |
| FACS tubes | BD Biosciences | 352052 | |
| Flow cytometry analysis software | TreeStar - Flowjo | FlowJo v7/9 | |
| HyClone RPMI - 1640 medium | Thermo Scientific | SH30027.01 | |
*XX varies by fluorochrome and YY varies by vial size. |
|||
References
- Liston, A., Lesage, S., Wilson, J., Peltonen, L., Goodnow, C. C. Aire regulates negative selection of organ-specific T cells. Nat. Immunol. 4, 350-354 (2003).
- Liston, A. Gene dosage--limiting role of Aire in thymic expression, clonal deletion, and organ-specific autoimmunity. J. Exp. Med. 200, 1015-1026 (2004).
- Hogquist, K. A., Baldwin, T. A., Jameson, S. C. Central tolerance: learning self-control in the thymus. Nat. Rev. Immunol. 5, 772-782 (2005).
- Liston, A., Enders, A., Siggs, O. M. Unravelling the association of partial T-cell immunodeficiency and immune dysregulation. Nat. Rev. Immunol. 8, 545-558 (2008).
- Starr, T. K., Jameson, S. C., Hogquist, K. A. Positive and negative selection of T cells. Annu. Rev. Immunol. 21, 139-176 (2003).
- McCaughtry, T. M., Hogquist, K. A. Central tolerance: what have we learned from mice. Seminars in immunopathology. 30, 399-409 (2008).
- Zhan, Y. Without peripheral interference, thymic deletion is mediated in a cohort of double-positive cells without classical activation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100, 1197-1202 (2003).
- Brewer, J. A., Kanagawa, O., Sleckman, B. P., Muglia, L. J. Thymocyte apoptosis induced by T cell activation is mediated by glucocorticoids in vivo. J. Immunol. 169, 1837-1843 (2002).
- Martin, S., Bevan, M. J. Antigen-specific and nonspecific deletion of immature cortical thymocytes caused by antigen injection. European journal of immunology. 27, 2726-2736 (1997).
- Baldwin, T. A., Sandau, M. M., Jameson, S. C., Hogquist, K. A. The timing of TCR alpha expression critically influences T cell development and selection. J. Exp. Med. 202, 111-121 (2005).
- Tung, J. W. Modern flow cytometry: a practical approach. Clinics in laboratory medicine. 27, 453-468 (2007).
- Aliahmad, P., Kaye, J. Development of all CD4 T lineages requires nuclear factor TOX. J. Exp. Med. 205, 245-256 (2008).
- Kastner, P. Bcl11b represses a mature T-cell gene expression program in immature CD4(+)CD8(+) thymocytes. Eur. J. Immunol. 40, 2143-2154 (2010).
- Albu, D. I. BCL11B is required for positive selection and survival of double-positive thymocytes. J. Exp. Med. 204, 3003-3015 (2007).
- Van De Wiele, C. J. Thymocytes between the beta-selection and positive selection checkpoints are nonresponsive to IL-7 as assessed by STAT-5 phosphorylation. J. Immunol. 172, 4235-4244 (2004).
- Ueno, T. CCR7 signals are essential for cortex-medulla migration of developing thymocytes. J. Exp. Med. 200, 493-505 (2004).
- Saini, M. Regulation of Zap70 expression during thymocyte development enables temporal separation of CD4 and CD8 repertoire selection at different signaling thresholds. Science signaling. 3, ra23 (2010).
- Hu, Q., Sader, A., Parkman, J. C., Baldwin, T. A. Bim-mediated apoptosis is not necessary for thymic negative selection to ubiquitous self-antigens. J. Immunol. 183, 7761-7767 (2009).
- Kisielow, P., Bluthmann, H., Staerz, U. D., Steinmetz, M., von Boehmer, H. Tolerance in T-cell-receptor transgenic mice involves deletion of nonmature CD4+8+ thymocytes. Nature. 333, 742-746 (1988).
- McCaughtry, T. M., Baldwin, T. A., Wilken, M. S., Hogquist, K. A. Clonal deletion of thymocytes can occur in the cortex with no involvement of the medulla. J. Exp. Med. 205, 2575-2584 (2008).
- Derbinski, J., Schulte, A., Kyewski, B., Klein, L. Promiscuous gene expression in medullary thymic epithelial cells mirrors the peripheral self. Nat. Immunol. 2, 1032-1039 (2001).
- Anderson, M. S. Projection of an immunological self shadow within the thymus by the aire protein. Science. 298, 1395-1401 (2002).
- Kurts, C. Constitutive class I-restricted exogenous presentation of self antigens in vivo. J. Exp. Med. 184, 923-930 (1996).
- Nitta, T., Nitta, S., Lei, Y., Lipp, M., Takahama, Y. CCR7-mediated migration of developing thymocytes to the medulla is essential for negative selection to tissue-restricted antigens. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106, 17129-17133 (2009).
- Bouneaud, C., Kourilsky, P., Bousso, P. Impact of negative selection on the T cell repertoire reactive to a self-peptide: a large fraction of T cell clones escapes clonal deletion. Immunity. 13, 829-840 (2000).
- Gallegos, A. M., Bevan, M. J. Central tolerance to tissue-specific antigens mediated by direct and indirect antigen presentation. J. Exp. Med. 200, 1039-1049 (2004).
- Moon, J. J. Naive CD4(+) T cell frequency varies for different epitopes and predicts repertoire diversity and response magnitude. Immunity. 27, 203-213 (2007).
- Bouillet, P. BH3-only Bcl-2 family member Bim is required for apoptosis of autoreactive thymocytes. Nature. 415, 922-926 (2002).
- Suen, A. Y., Baldwin, T. A. Proapoptotic protein Bim is differentially required during thymic clonal deletion to ubiquitous versus tissue-restricted antigens. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. , (2012).
- Calnan, B. J., Szychowski, S., Chan, F. K., Cado, D., Winoto, A. A role for the orphan steroid receptor Nur77 in apoptosis accompanying antigen-induced negative selection. Immunity. 3, 273-282 (1995).
- Zhou, T. Inhibition of Nur77/Nurr1 leads to inefficient clonal deletion of self-reactive T cells. J. Exp. Med. 183, 1879-1892 (1996).
- Baldwin, T. A., Hogquist, K. A. Transcriptional analysis of clonal deletion in vivo. J. Immunol. 179, 837-844 (2007).
