Summary
Este artículo describe un método por el cual se puede imitar
Abstract
Se describe un método para el cultivo ex vivo de cerebros completos de Drosophila. Esto puede ser usado como un contrapunto de crónicas manipulaciones genéticas para investigar la biología celular y el desarrollo de estructuras cerebrales centrales al permitir agudas intervenciones farmacológicas y formación de imágenes en vivo de procesos celulares. Como un ejemplo de la técnica, antes de trabajar de nuestro laboratorio 1 ha demostrado que un compartimiento subcelular no reconocido previamente se encuentra entre los compartimentos axonales y somatodendrítica de los axones del cerebro de Drosophila central. El desarrollo de este compartimiento, referido como el segmento inicial del axón (AIS) 2, se muestra genéticamente a depender de la quinasa neuronal específica dependiente de ciclina, Cdk5. Mostramos aquí que el tratamiento ex vivo de tipo salvaje cerebro de Drosophila larvas con la roscovitina Cdk5 específico de los inhibidores farmacológicos y olomoucina 3 se producen cambios agudos en la organización de la actina, yen la localización de la proteína de la superficie celular fasciclin 2, que imitan los cambios observados en los mutantes que carecen de actividad de Cdk5 genéticamente.
Un segundo ejemplo de la técnica in vivo la cultura ex está prevista la remodelación de las conexiones del cuerpo de setas embrionario (MB), las neuronas gamma durante la metamorfosis de larva a adulto. El cuerpo de hongo es el centro de aprendizaje y la memoria olfativa en la mosca de 4, y estas neuronas gamma podar sus ramas dendrítica y axonal durante el desarrollo de la pupa y luego volver a extender las ramas en un punto de tiempo después para establecer el patrón de inervación de adultos 5. La poda de estas neuronas de la MB se ha demostrado que se producen a través de la degeneración local de ramas neuritas 6, por un mecanismo que se activa por la ecdisona, una hormona esteroide, que actúa en el receptor de ecdisona B1 7, y que es dependiente de la actividad del ubiquitina-proteasoma sistema 6. Nuestro método de cultivo ex vivo puede be utilizan para interrogar mejor el mecanismo de la remodelación de desarrollo. Se encontró que en la configuración de la cultura vivo ex, las neuronas gamma de la MB recapituló el proceso de la poda de desarrollo con un tiempo similar al que en vivo. Es esencial, sin embargo, que esperar hasta 1,5 horas después de la formación pupario antes explantar el tejido a fin de que las células de cometer irreversiblemente a la metamorfosis; disección de animales en el inicio de pupariation llevó a metamorfosis poca o ninguna en cultivo. Así, con las modificaciones apropiadas, el método in vivo cultivo ex puede ser aplicado para estudiar dinámica así como los aspectos de estado estacionario de la biología cerebro central.
Protocol
A. Preparación de los medios
- Preparar medios completos por filtración esterilizante Drosophila Schneider medio suplementado con suero fetal bovino al 10% y 1% de penicilina / estreptomicina.
- Medios de comunicación deben estar preparados frescos cada vez. Alternativamente, una parte alícuota de la pre-congelados medios de comunicación pueden ser descongelado antes de cada uso.
- Antes de cultivo, añadir 10 g / ml de insulina y 2 g / ml ecdisona a los medios. Los fármacos se preparó como poblaciones concentradas y se congelaron en alícuotas pequeñas. Alícuotas descongeladas no volver a congelar.
- Todas las soluciones de trabajo debe mantenerse a 25 ° C.
El cultivo de los cerebros de larvas
1. La selección y la disección de los cerebros de larvas
- Añadir 500 l de medios de comunicación para una inserción de 12 mm de la cultura Millicell celular. Los cerebros disecados se coloca en estos insertos para facilitar inmunotinción fácil.
- Añadir una pequeña cantidad de medios preparados para un vidrio de reloj disección.
- Ucantar una pequeña espátula, recoger las larvas de tercer estadio vagando y colocarlos en el vidrio de reloj. (Suponemos que el método in vivo la cultura franco se aplicará igualmente a las larvas primero o segundo, pero no he probado esto.)
- Manteniendo el extremo posterior de la larva con un par de pinzas, cuidadosamente abrir el extremo anterior con un segundo par de pinzas # 5.
- Rápidamente diseccionar el cerebro, manteniendo el cordón nervioso ventral intacto.
2. Ex cultivo in vivo de los cerebros disecados larvarias
- Uso de pre-húmedas puntas de pipeta, transferir el cerebro con cuidado en los insertos de cultivo celular, pre-llenado con los medios de comunicación.
- Cerebros de transferencia, en los medios, a una incubadora a 25 ° C hasta el deseado punto de tiempo que se alcanza. Este método funciona de manera eficiente para un máximo de 48 horas en la cultura.
- Vuelva a colocar los medios de comunicación a las 8 horas. Más allá de eso, reemplazar la mitad de los medios de comunicación cada 5-6 horas.
3. La manipulación farmacológica deLos cerebros de larvas
Este método de cultivo ex vivo puede ser utilizado para corroborar farmacológicamente interacciones genéticas demostrado previamente en nuestro laboratorio 1.
- Añadir 100 roscovitina mM y 100 mM olomoucina a los medios preparados.
- Transferencia de cerebros disecados a este medio.
- Los cerebros de Cultura a 25 ° C durante 24 horas.
- Vuelva a colocar los medios de comunicación a las 8 horas. Más allá de eso, reemplazar la mitad de los medios de comunicación (con medicamentos) cada 5-6 horas.
El cultivo de los cerebros de pupas
1. Selección de las pupas de Disección
- Marcar pupas blancas en las botellas y frascos.
- Sólo elija pupas que son completamente blancos. Las pupas con cualquier tipo de color no deben ser incluidos.
- Esta etapa es de 0 horas después de la formación Pupario (APF).
- Estas pupas estará listo para la disección de 1,5 horas después de marcar. Este paso es crucial para garantizar que la poda de desarrollo se produce en ex vivo
2. La disección de las pupas
- Añadir 500 l de medios de comunicación para una inserción de 12 mm de la cultura Millicell celular. (Los cerebros disecados se coloca en estos insertos para facilitar inmunotinción fácil).
- Una vez que el deseado punto de tiempo se ha alcanzado, añadir una pequeña cantidad de medios preparados para un vidrio de reloj disección.
- Usando una espátula pequeña, húmeda, recoger las pupas previamente marcada para la disección y colocarlos en el vidrio de reloj.
- Manteniendo el extremo posterior de las pupas con un par de pinzas, abra cuidadosamente el extremo anterior del caso pupa con un segundo par de pinzas # 5.
- Rápidamente diseccionar el cerebro, manteniendo el cordón nervioso ventral intacto y unido.
3. Ex cultivo in vivo de los cerebros disecados pupas
- Transferir el cerebro con cuidado en los insertos de cultivo celular, pre-llenado con los medios de comunicación.
- Cerebros de transferencia, en los medios, a una incubadora a 25 ° C hasta el deseado tiempo point se alcanza. Se utilizó este método para hasta 10 horas en cultivo para el experimento se muestra, pero puede extenderse a más largos períodos de observación y tratamiento, si es necesario.
- Para los puntos de tiempo de más de 8 horas APF, sustituir los medios de comunicación cada 5-6 horas.
Partir de este paso, el protocolo se mantiene sin cambios, tanto para las larvas y pupas.
B. Fijación de cerebros disecados
- Una vez que el deseado punto de tiempo se alcanza, separa el medio y añadir 500 l de formaldehído al 4% en PBS 1x con 0,5% de Triton X-100 (PBST) durante 30 minutos, reemplazando con formaldehído fresco después de 15 minutos.
- Asegúrese de no permitir que se seque el cerebro al reemplazar los medios de comunicación con el fijador.
- Lavar formaldehído con cuatro lavados de 10 minutos de 1x PBS con 0,5% TritonX-100 (PBST).
C. La tinción cerebros fijos
- Después de formaldehído ha sido lavada, bloquear cerebros durante 1 hora en una solución de bloqueo de 1x PBS con un 1% normalSuero de cabra y 1% de seroalbúmina bovina.
- Añadir anticuerpos primarios formados en solución de bloqueo.
- Los cerebros de incubar durante la noche a 4 ° C.
- A la mañana siguiente, lave los anticuerpos primarios con cuatro lavados de 10 minutos de PBST.
- Añadir secundaria de anticuerpos formados en solución de bloqueo.
- Dejar a temperatura ambiente durante 4 horas.
- Lavar la zona secundaria de anticuerpos con cuatro lavados de 10 minutos de PBST.
D. Montaje de cerebros fijados y teñidos de Microscopía
- Equilibre los cerebros de los medios de comunicación Vectashield montaje durante 1 hora.
- Monte cerebro en portaobjetos de vidrio que utilizan los medios de comunicación Vectashield montaje.
- Coloque los chips de vidrio a cada lado de los cerebros antes de montar el cubreobjetos. Esto evita que los cerebros de ser aplastado, mientras se mantiene la muestra lo suficientemente delgada como para analizar todos los planos focales con un microscopio confocal. Los cerebros fueron más o menos orientada al montaje para facilitar su lectura las características de interés. Cuando sea necesario,imágenes del cerebro fueron rotados con el software de Imaris para proporcionar una visión óptima de la documentación y la medición.
- Selle cubreobjetos con esmalte de uñas transparente.
- Tienda desliza lejos de la luz.
E. Representante Resultados
La Figura 1 muestra un panel de tercer estadio larval de cerebros (A) de tipo salvaje moscas y (B) las moscas que expresan un derivado dominante negativo de Cdk5 (Cdk5DN) (Connell-Crowley et al., 2000). Ambos expresan la actina-GFP (verde) en las neuronas gamma MB. Como se ha descrito previamente (Trunova et al., 2011), hay una región en los axones proximales de las neuronas gamma de tipo salvaje que falla para acumular actina-GFP, mostrando así como una "zona clara" (A, soporte), y fasciclin dos proteínas (rojo) se acumula en los axones sólo hasta el borde ventral de la zona (línea horizontal blanca). La línea de puntos en el tercer panel de la Figura 1 (A) indica la posición de la MB, destacando el actoen la "zona libre" y su borde ventral. En las moscas que expresan Cdk5DN, la zona de actina claro está ausente (B) y fasciclin 2 (FasII) inmunoreactividad extiende dorsalmente a través de esa región. (Tenga en cuenta que un número variable de FasII positivo del proyecto axones horizontal a través de la MB, estos no son relevantes para el fenotipo). Barra de escala representa a 20 micras.
Utilizando el método de cultivo ex vivo, que tratan de tipo salvaje moscas con una combinación de roscovitina y olomoucina, inhibidores farmacológicos de Cdk5 actividad. Figura 2 muestra un panel de tercer estadio larval cerebros de control (A) y tratados con el fármaco (B ) de tipo salvaje moscas. Al igual que las moscas que expresan una dominante negativa Cdk5 construcción, los cerebros tratados con inhibidores de la Cdk5 durante 24 horas, muestran la pérdida de característica de la zona de actina clara y cambio en los límites FasII (entre corchetes). Las líneas blancas muestran la posición de tipo salvaje frontera FasII. Barra de escala representa a 20 micras.
FiguRe 3 muestra una serie representativa de los organismos de hongos Drosophila de 0-10 horas de la APF, marcado con la membrana objetivo mCD8-GFP (verde). Los paréntesis indican el cáliz, es decir, las proyecciones dendríticas de la MB. Antes de la metamorfosis, se puede ver axones MB cursan dorsoventral en haces gruesos, así como una "neblina 'de señal fluorescente resultante de la dendrítica denso eje (soporte). Panel A muestra cerebros disecados en el momento indicado. Tenga en cuenta la poda de las dendritas en la región indicada por los soportes, de tal manera que por 6-8 hrs APF, la bruma de la señal dendríticas se ha ido (aunque la señal no se ve afectada axonal). Cerebros en el panel B fueron disecados a las 0 horas APF, antes de que el alza interna de la ecdisona (Truman y Riddiford, 2002), y cultivadas ex vivo como se indica. Estos no muestran la poda en el desarrollo de las dendritas, sino la señal dendríticas persiste durante 10 horas APF. Para evitar esto, las pupas se marcan a 0 APF horas, pero disecado de 1,5 horas APF y culta. Panell C muestra una serie representativa de estos cuerpos seta de Drosophila APF 0-10 horas. Al igual que en las muestras no cultivadas, la señal dendrítica es indetectable por 8 horas APF. Barra de escala representa a 20 micras.
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Discussion
Crónicas manipulaciones genéticas de la estructura del tejido y la función, incluyendo las mutaciones y la expresión de los transgenes, por lo general producen una combinación de efectos inmediatos y finales de las consecuencias indirectas que pueden ser muy difíciles de separar. Como complemento de los métodos genéticos con la farmacología puede facilitar el interrogatorio de la evolución en el tiempo detrás de un fenotipo. Por ejemplo, este ha sido un enfoque de gran alcance para la disección de las contribuciones de los diferentes componentes del citoesqueleto durante la espermatogénesis en Drosophila 10. En el ejemplo actual, nos ha permitido para mostrar que no es un requisito para Cdk5 persistente para mantener la estructura de la AIS en Drosophila. En otros experimentos, también hemos tenido éxito el uso de drogas que se dirigen a otros componentes celulares, incluyendo las proteínas quinasas (imatinib), polimerización de la actina (citocalasina, latrunculin y jasplakinolide) y los microtúbulos (vinblastina y taxol).
"> Ex métodos de cultivo in vivo también permiten alta resolución análisis de la dinámica de los procesos de desarrollo. Estudios previos han descrito a corto plazo de imágenes en vivo del cerebro central 11, o más largo plazo de imágenes de otras porciones del sistema nervioso, tales como el 12 ganglios torácicos y de la retina / conexiones de fibra óptica del lóbulo 13. En este caso, al mismo tiempo nos hemos centrado en el análisis del tejido por inmunotinción de material fijo, el método se describe debe ser aplicable a largo plazo de imágenes en vivo del cerebro central. Por ejemplo, la poda correcta de los axones y dendritas durante el desarrollo del cuerpo de hongo Drosophila es esencial para establecer las conexiones correctas y los patrones de inervación en el sistema nervioso central. Además, las anomalías en la organización neuronal y la remodelación se cree que la base de varias enfermedades neurodegenerativas, incluyendo la enfermedad de Alzheimer, esclerosis lateral amiotrófica y el Parkinson. El técnica descrita aquí nos permite emular en remodelación de neuritas in vivo en el vivo de setas Drosophila ex cuerpo, en la cultura. Podemos ahora cambia la imagen en el desarrollo en respuesta a las alteraciones genéticas, tratamientos farmacológicos o cambios en el medio ambiente.
Figura 1. La sobreexpresión de la Cdk5DN causa pérdida de la zona clara 'la actina y un cambio en la frontera FasII en la gamma-las neuronas del cuerpo de hongo Drosophila. El panel A muestra tres ejemplos de tipo salvaje cerebros teñidos por la actina-GFP (verde) y FasII (rojo), mientras que el panel B se muestran dos ejemplos de los cerebros de sobre-expresión de Cdk5DN. Tenga en cuenta la pérdida de la 'zona libre' de la actina (soporte) y cambiar en la frontera FasII ventral (línea blanca horizontal) en (B). La línea punteada en (A) indica la posición del cuerpo seta. Barra de escala representa a 20 micras.
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Figura 2. El tratamiento con inhibidores farmacológicos roscovitina Cdk5 y olomoucina imita la Cdk5DN sobre-expresión en el fenotipo de los cuerpos seta de Drosophila. El panel A muestra dos de control de tipo salvaje cerebros mientras que el panel B muestra dos tratados con fármaco cerebros, cultivados durante 24 horas. Tenga en cuenta la pérdida de la 'zona libre' de la actina (soporte) y el cambio en la frontera con FasII (línea blanca horizontal) en (B). Barra de escala representa a 20 micras.
Figura 3. En la remodelación in vivo de las dendritas de las dendritas del cuerpo de Drosophila setas se pueden recapitular ex vivo. El panel A. Muestra cerebros disecados en los puntos de tiempo indicados y se tiñeron para la membrana, GFP (verde) Tenga en cuenta la desaparición de la señal dendríticas (señal difusa, verde, destaca por el soporte) por 8 h APF. El panel B muestra los cerebros disecados a las 0 horas APF y ex vivo culta ex vivo cultivado durante los tiempos indicados. Estos cerebros muestran poda dendrita similar a la observada en vivo (A). Barra de escala representa a 20 micras.
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Disclosures
No hay conflictos de interés declarado.
Acknowledgments
Nos gustaría dar las gracias a todos los miembros de nuestro laboratorio para sus consejos, las discusiones y comentarios útiles sobre el manuscrito. También nos gusta especialmente dar las gracias a Marta Koch y Hassan Bassem para la excelente sugerencia que esperar hasta 1,5 horas antes de la disección de los cerebros de la APF para el cultivo en los experimentos de remodelación. Agradecemos también a la instalación de imágenes de NHGRI para el uso de su microscopio confocal. Este trabajo fue apoyado por el Programa de Neurociencia Básica del Programa de Investigación Intramural del NINDS, NIH (Z01 NS003106).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Schneider's Drosophila Media | Invitrogen | 21720-024 | |
| Fetal Bovine Serum (heat-inactivated) | Invitrogen | 10082-147 | 10% |
| Penicillin/Streptomycin | Invitrogen | 15140-122 | 1% |
| Insulin | Invitrogen | 12585-014 | 10μg/ml |
| Ecdysone | Sigma-Aldrich | H5142 | 2μg/ml |
| Roscovitine | Sigma-Aldrich | R7772 | 100μM |
| Olomoucine | Sigma-Aldrich | O0886 | 100μM |
| Normal Goat Serum | Invitrogen | 50062Z | 1% |
| Bovine Serum Albumin | Fisher Scientific | M9501 | 1% |
| Formaldehyde | Sigma-Aldrich | D4551 | 4% |
| Triton-X 100 | Fisher Scientific | BP151 | 0.5% |
| Phosphate Buffered Saline | Invitrogen | 70011-044 | 1X |
| Vectashield | Vector Laboratories | H1000 | |
| Millicell Cell Culture Inserts | EMD Millipore | PI8P01250 | |
| Multidish, 4 well | Thermo Fisher Scientific, Inc. | 176740 | |
| Dumont #5 Forceps | Fine Science Tools | 11251-20 | |
| Microscope Slides | Fisher Scientific | 12-544-7 | |
| Cover Glass | Fisher Scientific | 12-548-5M |
References
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