Summary
Questo articolo descrive un metodo con il quale si può imitare
Abstract
Noi descriviamo un metodo per la coltura ex vivo di interi cervelli Drosophila. Questo può essere usato come un contrappunto al croniche manipolazioni genetiche per lo studio della biologia cellulare e dello sviluppo delle strutture cerebrali centrali, consentendo acuti interventi farmacologici e immagini dal vivo di processi cellulari. Come esempio della tecnica, prima lavorare dal nostro laboratorio 1 ha dimostrato che un vano precedentemente non subcellulare compreso tra i vani assonale e somatodendritic di assoni del cervello Drosophila centrale. Lo sviluppo di questo vano, indicato come il segmento assone iniziale (AIS) 2, è stato dimostrato geneticamente dipendere dalla chinasi neurone-specifica ciclina-dipendente, Cdk5. Mostriamo qui che il trattamento ex vivo delle wild-type cervelli larvali di Drosophila con la Cdk5-inibitori farmacologici specifici roscovitine e olomoucine 3 produce modifiche acute nell'organizzazione actina enella localizzazione della proteina Fasciclin superficie cellulare 2, che imitano i cambiamenti visti in mutanti che mancano Cdk5 attività geneticamente.
Un secondo esempio di tecnica di coltura ex vivo è previsto per il rimodellamento dei collegamenti del corpo fungo embrionale (MB) neuroni gamma durante la metamorfosi da larva ad adulto. Il corpo fungo è il centro di apprendimento e la memoria olfattiva in volo 4, e questi neuroni gamma potare i rami assonali e dendritiche durante lo sviluppo pupale e poi ri-rami si estendono in un timepoint tardi per stabilire il modello di adulto innervazione 5. Potatura di questi neuroni del MB è stato verificato tramite degenerazione locale di rami neuriti 6, da un meccanismo che viene attivato da ecdisone, un ormone steroideo, agendo sul recettore B1 ecdisone 7, e che dipende dall'attività del sistema ubiquitina-proteasoma 6. Il nostro metodo di coltura ex vivo possono be utilizzato per interrogare ulteriormente il meccanismo di rimodellamento sviluppo. Abbiamo trovato che l'impostazione in coltura ex vivo, neuroni gamma di MB ricapitolato il processo di potatura di sviluppo con un percorso simile a quello che in vivo. È essenziale, tuttavia, attendere 1,5 ore dopo la formazione pupario prima espianto il tessuto affinché le cellule ad impegnarsi irreversibilmente a metamorfosi; dissezione degli animali durante l'insorgenza di pupariation portato a metamorfosi poco o nessun in coltura. Così, con opportune modifiche, l'approccio coltura ex vivo può essere applicato allo studio dinamico così come aspetti allo stato stazionario di biologia cervello centrale.
Protocol
A. Preparazione di Media
- Preparare mezzi completi da filtro sterilizzante Schneider Drosophila mezzo supplementato con 10% siero fetale bovino e 1% di penicillina / streptomicina.
- Supporto deve essere preparato fresco ogni volta. In alternativa, una nuova aliquota di pre-congelati i media possono essere scongelati prima di ogni utilizzo.
- Prima di coltura, aggiungere 10 mg / ml di insulina e 2 mg / ml ecdisone ai media. I farmaci sono stati preparati come scorte concentrati e congelata in piccole aliquote. Aliquote non erano scongelati ricongelato.
- Tutte le soluzioni di lavoro deve essere mantenuta a 25 ° C.
La coltivazione di cervelli larvali
1. Selezione e dissezione di cervelli larvali
- Aggiungere 500 microlitri di media per un inserto di 12 millimetri coltura cellulare Millicell. I cervelli sezionati saranno inseriti in questi inserti per facilitare immunostaining facile.
- Aggiungere una piccola quantità di supporti preparati per un vetro da orologio dissezione.
- Ucantare una piccola spatola, raccogliere vagare larve terzo stadio e metterli in vetro di orologio. (Si presume che il metodo di coltura ex vivo si applica altrettanto bene al primo o al secondo stadio le larve, ma non abbiamo testato questo.)
- Tenendo l'estremità posteriore della larva con una coppia di pinze, accuratamente aprire l'estremità anteriore con una seconda coppia di pinze # 5.
- Rapidamente sezionare il cervello, mantenendo il cordone nervoso ventrale intatta.
2. Ex vivo di coltura sezionati cervelli larvali
- Utilizzando pre-bagnato puntali, trasferire il cervello con cura in inserti di coltura cellulare, le pre-riempite con i media.
- Cervelli di trasferimento, in media, a un incubatore a 25 ° C fino al punto temporale desiderato viene raggiunto. Questo metodo funziona in modo efficiente per un massimo di 48 ore nella cultura.
- Sostituire il supporto a 8 ore. Oltre a ciò, sostituire la metà dei mezzi di ogni 5-6 ore.
3. La manipolazione farmacologica dellaBrains larvali
Questo metodo di coltura ex vivo può essere utilizzato per corroborare farmacologicamente interazioni genetiche precedentemente dimostrato nel nostro laboratorio 1.
- Aggiungere 100 roscovitine uM e 100 micron a olomoucine supporti preparati.
- Trasferimento cervelli sezionati a questo media.
- Cervelli cultura a 25 ° C per 24 ore.
- Sostituire il supporto a 8 ore. Oltre a questo, sostituire la metà dei media (con farmaci) ogni 5-6 ore.
La coltivazione di Brains pupa
1. Selezione di Pupae per dissezione
- Segna pupe bianco su bottiglie / flaconi.
- Scegliere solo pupe che sono completamente bianchi. Pupe con qualsiasi tipo di colorazione non dovrebbe essere incluso.
- Questa fase è 0 ore dopo la formazione pupario (APF).
- Questi pupe sarà pronto per dissezione 1,5 ore dopo la marcatura. Questo passo è fondamentale per assicurare che la potatura di sviluppo avviene in ex vivo
2. Dissezione di Pupae
- Aggiungere 500 microlitri di media per un inserto di 12 millimetri coltura cellulare Millicell. (I cervelli sezionati saranno inseriti in questi inserti per facilitare immunostaining facile).
- Una volta che il desiderato punto temporale è stato raggiunto, aggiungere una piccola quantità di supporti preparati per un vetro da orologio dissezione.
- Utilizzando una piccola spatola bagnata, pick up pupe precedentemente segnato per la dissezione e metterli in vetro di orologio.
- Tenendo l'estremità posteriore del pupe con una coppia di pinze, accuratamente aprire l'estremità anteriore del caso pupa con una seconda coppia di pinze # 5.
- Rapidamente sezionare il cervello, mantenendo il cordone nervoso ventrale intatta e allegato.
3. Coltura ex vivo di sezionati Brains pupa
- Trasferire il cervello con cura in inserti di coltura cellulare, le pre-riempite con i media.
- Cervelli di trasferimento, in media, ad un incubatore a 25 ° C fino alla desiderata time-point viene raggiunto. Abbiamo usato questo metodo per un massimo di 10 ore in coltura per l'esperimento illustrato, ma può essere esteso a lunghi periodi di osservazione e di trattamento, se necessario.
- Per i punti temporali più di 8 ore APF, sostituire i supporti ogni 5-6 ore.
Da questo passo, il protocollo rimane invariato sia per larve e pupe.
B. Fissaggio Brains sezionati
- Una volta che il desiderato punto temporale viene raggiunto, rimuovere i supporti e aggiungere 500 microlitri del 4% formaldeide in PBS 1x con 0,5% Triton X-100 (PBST) per 30 minuti, sostituendo con formaldeide fresco dopo 15 minuti.
- Assicurarsi di non permettere il cervello per asciugare durante la sostituzione media con fissativo.
- Lavare formaldeide con quattro lavaggi 10 minuti di 1x PBS con 0,5% Triton X-100 (PBST).
C. colorazione Brains fissi
- Dopo formaldeide è stato lavato via, blocco cervello per 1 ora in una soluzione bloccante di 1x PBS con 1% normaleSiero di capra e l'1% albumina di siero bovino.
- Aggiungi anticorpi primari realizzati con la stessa soluzione bloccante.
- Cervelli Incubare per una notte a 4 ° C.
- La mattina dopo, lavare gli anticorpi primari con quattro lavaggi 10 minuti di PBST.
- Aggiungere anticorpi secondari costituiti in soluzione bloccante.
- Lasciare a temperatura ambiente per 4 ore.
- Lavare anticorpi secondari con quattro lavaggi 10 minuti di PBST.
D. Montaggio Brains fissate e colorate per la microscopia
- Equilibrare il cervello nei media Vectashield di montaggio per 1 ora.
- Montare il cervello su vetrini utilizzando i mezzi di comunicazione Vectashield di montaggio.
- Posizionare chip vetro su entrambi i lati del cervello prima di montare il vetrino coprioggetto. Ciò impedisce ai cervelli di essere schiacciato, mantenendo campione abbastanza sottile per analizzare tutti i piani focali con un microscopio confocale. Cervelli sono stati circa orientati su di montaggio per facilitare la visualizzazione delle caratteristiche di interesse. Se necessario,immagini del cervello erano alternate con il software Imaris per fornire una visione ottimale per la documentazione e la misurazione.
- Guarnizione del coperchio scivola con smalto trasparente.
- Conservare scivola al riparo dalla luce.
E. rappresentativi Risultati
La figura 1 mostra un pannello di cervelli larvali terzo instar di (A) wild-type mosche e (B) mosche che esprimono una posizione dominante-negativo derivato del Cdk5 (Cdk5DN) (Connell-Crowley et al., 2000). Entrambi esprimono actina-GFP (green) nei neuroni gamma MB. Come descritto in precedenza (Trunova et al., 2011), c'è una regione negli assoni prossimali di wild-type neuroni gamma che non riesce ad accumulare actina-GFP, mostrando quindi come una "zona chiara" (A, staffa), e fasciclin due proteine (rosso) si accumula nelle assoni solo fino al confine di questa zona ventrale (linea bianca orizzontale). La linea tratteggiata nel terzo pannello di figura 1 (A) indica la posizione del MB, evidenziando l'attoin "zona chiara" e il suo margine ventrale. In mosche esprimono Cdk5DN, la zona chiara actina è assente (B) e Fasciclin 2 (FasII) immunoreattività dorsalmente diffonde attraverso quella regione. (Si noti che un numero variabile di FasII positivo progetto di assoni in orizzontale tutta la MB, queste non sono rilevanti per il fenotipo). Barra della scala rappresenta 20 micron.
Utilizzando il nostro metodo di coltura ex vivo, abbiamo trattato wild-type mosche con una combinazione di roscovitine e olomoucine, inibitori farmacologici di Cdk5 attività. La figura 2 mostra un pannello di cittadini di instar cervelli larvali di controllo (A) e farmaco-trattata (B wild-type) mosche. Simile a mosche che esprimono un dominante negativo Cdk5 costrutto, cervelli trattati con inibitori Cdk5 per 24 ore, mostrano la perdita caratteristica della zona di actina chiaro e spostamento di confine FasII (parentesi quadre). Linee bianche indicano la posizione di wild-type confine FasII. Barra della scala rappresenta 20 micron.
Figusull'articolo 3, mostra una serie rappresentante degli enti di funghi Drosophila da 0-10 ore APF, etichettati con membrana mirati mCD8-GFP (verde). Parentesi indicano il calice, cioè, le proiezioni dendritiche del MB. Prima della metamorfosi, si possono vedere gli assoni MB scorrono dorso-ventrale in grossi fasci, così come una 'nebbia' del segnale fluorescente derivante dalla dendritica arbor densa (staffa). Un pannello spettacoli cervelli sezionati al momento indicato. Si noti la potatura dei dendriti nella regione indicata dalle parentesi, in modo tale che entro 6-8 ore APF, la foschia del segnale dendritica è andato (anche se il segnale assonale è invariato). Brains nel pannello B sono stati sezionati a 0 ore APF, prima interna ecdisone spike (Truman e Riddiford, 2002), e coltivate ex vivo come indicato. Questi mostrano nessuna potatura di sviluppo dei dendriti, ma piuttosto il segnale dendritica persiste a 10 ore APF. Per ovviare a questo, le pupe sono contrassegnati APF a 0 ore, ma sezionato a 1,5 ore APF e colta. Vetrol C mostra una serie rappresentante degli enti di funghi queste Drosophila APF da 0-10 ore. Come nei non-coltura di campioni, il segnale dendritica non è rilevabile da 8 ore APF. Barra della scala rappresenta 20 micron.
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Discussion
Croniche manipolazioni genetiche di struttura del tessuto e funzione, tra cui le mutazioni ed espressione dei transgeni, in genere producono una combinazione di effetti immediati e tardivi conseguenze indirette che possono essere molto difficili da separare. Integrare i metodi genetici con la farmacologia può facilitare l'interrogatorio del corso tempo dietro un fenotipo. Ad esempio, questo è un approccio efficace per sezionare i contributi dei vari componenti citoscheletrici durante la spermatogenesi in Drosophila 10. Nell'esempio attuale, ci ha permesso di dimostrare che esiste un requisito persistente per Cdk5 per mantenere la struttura del AIS in Drosophila. In altri esperimenti abbiamo anche avuto successo con farmaci che agiscono su altre componenti cellulari, tra cui proteine chinasi (imatinib), actina polimerizzazione (citocalasina, Latrunculina e jasplakinolide) e microtubuli (vinblastina e taxolo).
"> Ex vivo anche metodi di coltura consentono analisi ad alta risoluzione della dinamica dei processi di sviluppo. Studi precedenti hanno descritto breve termine immagini in diretta del cervello centrale 11, o lungo termine imaging di altre porzioni del sistema nervoso, come l' 12 gangli del torace e retina / connessioni del lobo ottica 13. Qui, mentre ci siamo concentrati sull'analisi del tessuto mediante immunocolorazione di materiale fisso, il metodo che abbiamo descritto dovrebbe essere applicabile a lungo termine di imaging dal vivo del cervello centrale. Ad esempio, la potatura corretta degli assoni e dendriti durante lo sviluppo del corpo fungo Drosophila è essenziale per stabilire connessioni corrette e modelli di innervazione del sistema nervoso centrale. Inoltre, anomalie nell'organizzazione neuronale e il rimodellamento si ritiene alla base di diverse malattie neurodegenerative, tra cui il morbo di Alzheimer, sclerosi laterale amiotrofica e il Parkinson. L' tecnica qui descritta ci permette di emulare in rimodellamento vivo dei neuriti nella ex vivo fungo Drosophila corpo, nella cultura. Possiamo ora l'immagine cambia in via di sviluppo in risposta alle alterazioni genetiche, trattamenti farmacologici o cambiamenti nell'ambiente.
Figura 1. Over-espressione di Cdk5DN provoca la perdita della 'zona libera' l'actina e uno spostamento del confine FasII in gamma-neuroni del corpo funghi Drosophila. Panel A presenta tre esempi di wild-type cervelli colorati per actina-GFP (verde) e FasII (rosso) mentre il pannello B mostra due esempi di cervelli over-esprimono Cdk5DN. Si noti la perdita della 'zona libera' l'actina (staffa) e spostare il confine in FasII ventrale (linea orizzontale bianca) in (B). La linea tratteggiata in (A) indica la posizione del corpo fungo. Barra della scala rappresenta 20 micron.
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Figura 2. Trattamento con inibitori farmacologici Cdk5 roscovitine e olomoucine Cdk5DN imita l'iper-espressione fenotipo nei corpi funghi Drosophila. Panel A presenta due wild-type di controllo cervello mentre il pannello B mostra due farmaci trattati con cervello, in coltura per 24 ore. Si noti la perdita della 'zona libera' l'actina (staffa) e gli spostamenti di confine FasII (linea orizzontale bianca) in (B). Barra della scala rappresenta 20 micron.
Figura 3. In vivo rimodellamento dei dendriti dei dendriti fungo del corpo di Drosophila può essere riassunta ex vivo. Panel A presenta cervelli sezionati nei punti indicati tempi e colorate per legato alla membrana GFP (verde). Nota: la scomparsa del segnale dendritiche (diffusa, segnale verde, evidenziato da staffa) di 8 ore APF. Panel B mostra cervelli sezionati a 0 ore APF ed ex vivo colta ex vivo per i tempi indicati. Questi cervelli mostrano potatura dendrite simile a quella osservata in vivo (A). Barra della scala rappresenta 20 micron.
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Disclosures
Non ci sono conflitti di interesse dichiarati.
Acknowledgments
Vorremmo ringraziare tutti i membri del nostro laboratorio per i loro consigli, utili discussioni e commenti sul manoscritto. Vorremmo inoltre particolarmente ringraziare Marta Koch e Bassem Hassan per il suggerimento eccellente che aspettiamo fino a 1,5 ore APF prima sezionare il cervello per la coltura in esperimenti di rimodellamento. Ringraziamo anche la possibilità di imaging NHGRI per l'utilizzo del loro microscopio confocale. Questo lavoro è stato sostenuto dal Programma Neuroscienze di base del Programma di NINDS ricerca intramurale, NIH (NS003106 Z01).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Schneider's Drosophila Media | Invitrogen | 21720-024 | |
| Fetal Bovine Serum (heat-inactivated) | Invitrogen | 10082-147 | 10% |
| Penicillin/Streptomycin | Invitrogen | 15140-122 | 1% |
| Insulin | Invitrogen | 12585-014 | 10μg/ml |
| Ecdysone | Sigma-Aldrich | H5142 | 2μg/ml |
| Roscovitine | Sigma-Aldrich | R7772 | 100μM |
| Olomoucine | Sigma-Aldrich | O0886 | 100μM |
| Normal Goat Serum | Invitrogen | 50062Z | 1% |
| Bovine Serum Albumin | Fisher Scientific | M9501 | 1% |
| Formaldehyde | Sigma-Aldrich | D4551 | 4% |
| Triton-X 100 | Fisher Scientific | BP151 | 0.5% |
| Phosphate Buffered Saline | Invitrogen | 70011-044 | 1X |
| Vectashield | Vector Laboratories | H1000 | |
| Millicell Cell Culture Inserts | EMD Millipore | PI8P01250 | |
| Multidish, 4 well | Thermo Fisher Scientific, Inc. | 176740 | |
| Dumont #5 Forceps | Fine Science Tools | 11251-20 | |
| Microscope Slides | Fisher Scientific | 12-544-7 | |
| Cover Glass | Fisher Scientific | 12-548-5M |
References
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