Summary
Denna artikel beskriver en metod som man kan efterlikna
Abstract
Vi beskriver ett förfarande för ex vivo-odling av hela hjärnor Drosophila. Detta kan användas som en motvikt till kroniska genetiska manipulationer för att undersöka cellbiologi och utveckling av centrala hjärnstrukturer genom att akuta farmakologiska interventioner och levande avbildning av cellulära processer. Som ett exempel på den teknik, före arbeta från vårt laboratorium 1 har visat att en tidigare ej subcellulär avdelning ligger mellan de axonala och somatodendritiska fack axoner av Drosophila centrala hjärnan. Utvecklingen av denna kammare, benämnd axonet initiala segmentet (AIS) 2, visade genetiskt att bero på den nervcellsspecifika cyklinberoende kinas, CDK5. Vi visar här att ex vivo-behandling av vildtyp Drosophila larver hjärnor med CDK5-specifika farmakologiska hämmare roskovitin och olomoucin 3 orsakar akuta förändringar i aktin organisation, ochi lokalisering av det cellytebindande proteinet fasciclin 2, som efterliknar de förändringar som ses i mutanter som saknar aktivitet Cdk5 genetiskt.
Ett andra exempel på ex vivo kulturen tekniken finns för ombyggnad av anslutningar av embryonal svamp kroppen (MB) gamma neuroner under metamorfos från larv till vuxen. Svamp kroppen är centrum för lukt inlärning och minne i gylfen 4, och dessa gamma nervceller beskära sina axonala och dendritiska grenar under puppa utveckling och sedan åter sträcker grenar vid ett senare tidpunkt för att fastställa den vuxna innervation mönstret 5. Beskärning av dessa neuroner i MB har visat sig ske via lokal nedbrytning av neurit grenar 6 genom en mekanism som utlöses av ekdyson, en steroid hormon som agerar på kommissionens ekdysonreceptor B1 7, och som är beroende av aktiviteten hos ubiquitin-proteasom-systemet 6. Vår metod för ex vivo odling kan bE som används för att förhöra ytterligare mekanism utvecklande ombyggnad. Vi fann att i ex vivo-odling inställning rekapitulerade gamma neuroner i MB processen för utvecklande beskärning med ett tidsförlopp liknande det som in vivo. Det var dock viktigt att vänta tills 1,5 timmar efter puparium bildandet före explantation vävnaden för att cellerna att begå irreversibelt till metamorfos, dissektion av djur i början av pupariation ledde till liten eller ingen metamorfos i kultur. Således, med lämplig modifiering kan ex vivo kulturen metod användas för att studera dynamiska och steady state aspekter av centrala hjärnan biologi.
Protocol
A. Beredning av medier
- Framställa komplett medium genom filtret-sterilisering Schneiders Drosophila-medium kompletterat med 10% fetalt bovint serum och 1% penicillin / streptomycin.
- Media bör beredas på nytt varje gång. Alternativt kan en färsk alikvot av pre-frysta mediet tinas före varje användning.
- Före odling, tillsätt 10 | ig / ml insulin och 2 | ig / ml ekdyson till mediet. Läkemedlen framställdes i form av koncentrerade lager och frystes i små alikvoter. Upptinade portioner inte frysas om.
- Alla som arbetar lösningar bör hållas vid 25 ° C.
Odling av Larvernas Hjärnor
1. Urval och Dissektion av Larvernas Brains
- Tillsätt 500 pl av media till en 12 mm Millicell cellodling insats. De dissekerade hjärnor kommer att placeras i dessa insatser för att underlätta enkel immunfärgning.
- Tillsätt en liten mängd av färdiga mediet till en dissektion urglas.
- Usjunger en liten spatel, plocka upp vandrande tredje stadiet larver och placera dem i urglas. (Vi antar att ex vivo kulturen metod skulle tillämpas lika väl första eller andra stadiets larver, men vi har inte testat detta.)
- Håller den bakre änden av larven med en pincett, noggrant öppna den främre änden med ett andra par av # 5 pincett.
- Snabbt dissekera ut hjärnan, hålla den ventrala nerven sladden intakt.
2. Ex vivo odling av de dissekerade hjärnor Larvernas
- Med pre-våta pipettspetsar, överföra hjärnan försiktigt i insatserna cellodling, pre-fyllda med media.
- Transfer hjärnor, i media, till en inkubator vid 25 ° C tills önskad tid-punkten nås. Denna metod fungerar effektivt under upp till 48 h i kultur.
- Byt media på 8 timmar. Utöver detta ersätta hälften av medierna var 5-6 timmar.
3. Farmakologisk Manipulering avLarver Hjärnor
Denna metod för ex vivo-odling kan användas för att bekräfta farmakologiskt genetisk interaktion tidigare visats i vårt laboratorium 1.
- Tillsätt 100 iM roskovitin och 100 M olomoucin till förberedda media.
- Överföring dissekerade hjärnor till detta media.
- Kultur hjärnor vid 25 ° C under 24 timmar.
- Byt media på 8 timmar. Utöver detta, byt hälften av medier (med läkemedel) var 5-6 timmar.
Odling av puppa Brains
1. Valet av puppor för Dissektion
- Mark White puppor på flaskor / flaskor.
- Endast välja puppor som är helt vit. Puppor med någon form av färg bör inte inkluderas.
- Detta steg är 0 timmar Efter Puparium Formation (APF).
- Dessa puppor kommer att vara redo för dissektion 1,5 timmar efter märkning. Detta steg är avgörande att se till att utvecklingsarbete beskärning sker i ex vivo
2. Dissektion av puppor
- Tillsätt 500 pl av media till en 12 mm Millicell cellodling insats. (De dissekerade hjärnor kommer att placeras i dessa insatser för att underlätta enkel immunfärgning).
- När väl den önskade tid-punkt har nåtts, tillsätt en liten mängd av färdiga mediet till en dissektion urglas.
- Använd en liten, våt spatel, plocka upp puppor som tidigare markerats för dissektion och placera dem i urglas.
- Håll bakre änden av puppor med en pincett, öppna försiktigt den främre änden av puppan fallet med ett andra par # 5 pincett.
- Snabbt dissekera ut hjärnan, hålla den ventrala nerven sladden intakt och bifogas.
3. Ex vivo Odling av de dissekerade puppa Brains
- Överför hjärnan försiktigt i insatserna cellodling, pre-fyllda med media.
- Transfer hjärnor, i media, till en inkubator vid 25 ° C tills den önskade tiden-pØi uppnås. Vi använde detta förfarande för upp till 10 timmar i odling för det visade experimentet, men det kan förlängas till längre perioder av observation och behandling om så behövs.
- För tidpunkter längre än 8 timmar APF, ersätta Media var 5-6 timmar.
Från detta steg på, är protokollet oförändrad för både larver och puppor.
B. Fastställande Dissekerade Hjärnor
- När väl den önskade tid-punkt nås, avlägsnas media och tillsätt 500 pl av 4% formaldehyd i 1 x PBS med 0,5% Triton X-100 (PBST) under 30 minuter, ersätt med färskt formaldehyd efter 15 minuter.
- Se till att inte låta hjärnor att torka medan ersätta media med fixativ.
- Tvätta bort formaldehyd med fyra 10 minuters tvättar i 1 x PBS med 0,5% TritonX-100 (PBST).
C. Färgning Fasta Hjärnor
- Efter formaldehyd har tvättats bort, block hjärnor under 1 timme i en blockerande lösning av 1 x PBS med 1% normaltGetserum och 1% bovint serumalbumin.
- Tillsätt primära antikroppar som framställts i blockerande lösning.
- Inkubera hjärnor över natten vid 4 ° C.
- Nästa morgon, tvätta primära antikroppar med fyra 10 minuters tvättar med PBST.
- Tillsätt sekundära antikroppar som framställts i blockerande lösning.
- Låt stå i rumstemperatur under 4 timmar.
- Tvätta sekundära antikroppar med fyra 10 minuters tvättar med PBST.
D. Montering fixeras och färgas Brains för mikroskopi
- Jämvikt hjärnor i Vectashield montering media för 1 timme.
- Montera hjärnor på glasskivor med hjälp av Vectashield montering media.
- Placera glas marker på båda sidor av hjärnan innan montering av täckglas. Detta förhindrar hjärnorna från att klämmas, medan prov tillräckligt tunt för att avsöka alla fokalplan med ett konfokalt mikroskop. Brains var ungefär orienterade vid montering för att underlätta att titta på funktioner av intresse. Vid behov,hjärnan bilder roterades med Imaris programvara för att ge en optimal sikt för dokumentation och mätning.
- Täta täckglas med tydlig nagellack.
- Förvaras glider bort från ljus.
E. Representativa resultat
Figur 1 visar en panel av tredje instar larver hjärnan hos (A) av vildtyp flugor och (B) flugor som uttrycker en dominant-negativ derivat av Cdk5 (Cdk5DN) (Connell-Crowley et al., 2000). Både express aktin-GFP (grön) i MB gamma nervceller. Som beskrivits tidigare (Trunova et al., 2011), finns det en region i de proximala axoner av vildtyp gamma nervceller som misslyckas med att samla aktin-GFP, vilket visar sig som en "klar zon" (A, fäste), och fasciclin 2 protein (röd) ackumuleras i axoner bara upp till den ventrala kanten av detta område (vit horisontell linje). Den streckade linjen i den tredje panelen i figur 1 (A) indikerar positionen för MB, belyser den handlingi "klar zon" och dess ventrala gränsen. I flugor som uttrycker Cdk5DN är aktin klar zon frånvarande (B) och fasciclin 2 (FasII) immunoreaktivitet sprider dorsalt genom denna region. (Observera att varierande antal FasII-positiva axoner projektet horisontellt över MB, dessa är inte relevanta för fenotypen). Skalstrecket betecknar 20 | am.
Med vårt sätt att ex vivo odling behandlade vi vildtyp flugor med en kombination av roskovitin och olomoucin, farmakologiska hämmare av Cdk5 aktivitet. Figur 2 visar en panel av tredje stadiet larver hjärnor of Control (A) och läkemedels-behandlade (B ) vildtyp flugor. I likhet med flugor som uttrycker en dominant negativ Cdk5 konstruktion, hjärnor som behandlats med Cdk5 hämmare under 24 timmar, visar den karakteristiska förlusten av aktin klara zon och förskjutning i FasII gränsen (hakparenteser). Vita linjer visar läget för vildtyp FasII gränsen. Skalstrecket betecknar 20 | am.
FIGUre 3 visar en representativ serie av Drosophila svamp organ från 0-10 timmar APF, märkt med membran-riktad mCD8-GFP (grönt). Parentes anger blomfoder, det vill säga de dendritiska projektioner av MB. Före metamorfos, kan man se MB axoner strömmande dorso-ventralt i tjocka buntar, såväl som en "haze" av fluorescerande signal som härrör från den täta dendritiska spindeln (hållare). Panel A visar hjärnor dissekerades vid den angivna tiden. Notera beskärning av dendriter i regionen anges med parentes, så att 6-8 timmar APF, diset av dendritiska signalen är borta (även om axonal signalen är opåverkad). Hjärnorna i panel B dissekerades vid 0 timmar APF, innan den inre ekdyson spetsen (Truman och Riddiford, 2002), och odlas ex vivo såsom anges. Dessa visar ingen utvecklande beskärning av dendriter, utan den dendritiska signalen kvarstår vid 10 timmar APF. För att kringgå detta är puppor märkta vid 0 timmar APF, men dissekerades vid 1,5 timmar APF och odlas. Panel C visar ett representativt antal av dessa Drosophila svamp organ från 0-10 timmar APF. Liksom i de icke-odlade prover, är dendritiska signalen påvisas med 8 h APF. Skalstrecket betecknar 20 | am.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Kroniska genetiska manipulationer av vävnad struktur och funktion, inklusive mutationer och uttryck av transgener, vanligtvis producera en kombination av omedelbara effekter och sena indirekta konsekvenser som kan vara mycket svåra att separera. Komplettera genetiska metoder med farmakologi kan underlätta förhör av tidsförloppet bakom en fenotyp. Till exempel har detta varit en kraftfull strategi för dissekera bidrag från olika cytoskelettala komponenter under spermatogenes hos Drosophila 10. I det aktuella exemplet, har det möjligt för oss att visa att det finns en ihållande krav Cdk5 att bibehålla strukturen hos AIS i Drosophila. I andra experiment har vi också haft framgång hjälp av läkemedel som riktar andra cellulära komponenter, bland annat proteinkinaser (imatinib), aktinpolymerisering (cytochalasin, latrunculin och jasplakinolid) och mikrotubuli (vinblastin och taxol).
"> Ex vivo-odling metoder medger också hög upplösning analys av dynamiken hos utvecklingsprocesser. Tidigare studier har beskrivits kortvarig levande avbildning av den centrala hjärnan 11, eller på längre sikt avbildning av andra delar av nervsystemet, såsom bröstkorg ganglier 12 och retina / optiska lob anslutningar 13. Här, medan vi har fokuserat på analys av vävnad genom immunfärgning av fast material bör den metod vi beskriver gälla på lång sikt levande avbildning av den centrala hjärnan. Till exempel rätt beskärning av axoner och dendriter under utvecklingen av Drosophila svampen kroppen är viktigt för att fastställa korrekta anslutningar och mönster innervationsområden i det centrala nervsystemet. Dessutom är avvikelser i neuronal organisation och ombyggnad tros ligga bakom flera neurodegenerativa sjukdomar, däribland Alzheimers, ALS och Parkinsons. Den Tekniken beskrivs här ger oss möjlighet att efterlikna i vivo ombyggnad av neuriter i Drosophila svampen kroppen ex vivo, i kultur. Vi kan nu bild förändringar i utvecklingen som svar på genetiska förändringar, farmakologiska behandlingar eller förändringar i miljön.
Figur 1. Överuttryck av Cdk5DN orsakar förlust av aktin "klar zon" och ett skifte i FasII gränsen i gamma-neuroner i Drosophila svampen kroppen. Panel A visar tre exempel på vildtyp hjärnor som färgats för aktin-GFP (grönt) och FasII (röd), medan Panel B visar två exempel på hjärnor över-uttryckande Cdk5DN. Notera förlusten av aktin "klara zon" (fäste) och flytta i FasII ventrala gränsen (horisontella vita linjen) i (B). Den streckade linjen i (A) indikerar positionen för svampen kroppen. Skalstrecket betecknar 20 | am.
2 "/>
Figur 2. Behandling med farmakologisk Cdk5 hämmare roskovitin och olomoucin härmar Cdk5DN överuttryck fenotyp i Drosophila svamp kroppar. Panel A visar två kontroll vildtyp hjärnor medan panel B visar två läkemedels-behandlade hjärnor, odlade under 24 timmar. Notera förlusten av aktin "klara zon" (fäste) och förändring i FasII gränsen (horisontella vita linjen) i (B). Skalstrecket betecknar 20 | am.
Figur 3. In vivo remodellering av dendriter hos Drosophila dendriter svamp kroppen kan rekapitulerade ex vivo. Panel A visar hjärnor dissekeras vid tidpunkterna anges och färgades för membranbundna GFP (grönt). Notera försvinnandet av dendritiska signal (diffus, grön signal, lyfts fram av konsolen) med 8h APF. Panel B visar hjärnor dissekeras vid 0 timmar APF och odlade ex vivo ex vivo för de angivna tiderna. Dessa hjärnor visar Dendrite beskärning liknande den som ses in vivo (A). Skalstrecket betecknar 20 | am.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Inga intressekonflikter deklareras.
Acknowledgments
Vi vill tacka alla medlemmar i vårt labb för sina råd, nyttiga diskussioner och kommentarer på manuskriptet. Vi vill också särskilt tacka Marta Koch och Bassem Hassan för det utmärkta förslaget att vi väntar tills 1,5 timmar APF innan dissekera hjärnor för odling i remodeling experiment. Vi tackar också NHGRI avbildning anläggning för användningen av deras konfokalmikroskop. Detta arbete stöddes av Basic Neuroscience Program för NINDS Interna Research Program, NIH (Z01 NS003106).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Schneider's Drosophila Media | Invitrogen | 21720-024 | |
| Fetal Bovine Serum (heat-inactivated) | Invitrogen | 10082-147 | 10% |
| Penicillin/Streptomycin | Invitrogen | 15140-122 | 1% |
| Insulin | Invitrogen | 12585-014 | 10μg/ml |
| Ecdysone | Sigma-Aldrich | H5142 | 2μg/ml |
| Roscovitine | Sigma-Aldrich | R7772 | 100μM |
| Olomoucine | Sigma-Aldrich | O0886 | 100μM |
| Normal Goat Serum | Invitrogen | 50062Z | 1% |
| Bovine Serum Albumin | Fisher Scientific | M9501 | 1% |
| Formaldehyde | Sigma-Aldrich | D4551 | 4% |
| Triton-X 100 | Fisher Scientific | BP151 | 0.5% |
| Phosphate Buffered Saline | Invitrogen | 70011-044 | 1X |
| Vectashield | Vector Laboratories | H1000 | |
| Millicell Cell Culture Inserts | EMD Millipore | PI8P01250 | |
| Multidish, 4 well | Thermo Fisher Scientific, Inc. | 176740 | |
| Dumont #5 Forceps | Fine Science Tools | 11251-20 | |
| Microscope Slides | Fisher Scientific | 12-544-7 | |
| Cover Glass | Fisher Scientific | 12-548-5M |
References
- Trunova, S., Baek, B., Giniger, E. Cdk5 regulates the size of an axon initial segment-like compartment in mushroom body neurons of the Drosophila central brain. J. Neurosci. 31 (29), 10451-10462 (2011).
- Nakada, C., et al. Accumulation of anchored proteins forms membrane diffusion barriers during neuronal polarization. Nat. Cell Biol. 5 (7), 626-632 (2003).
- Schmid, G., Strosznajder, J. B., Wesierska-Gadek, J. Interplay between the p53 tumor suppressor protein family and Cdk5: novel therapeutic approaches for the treatment of neurodegenerative disease using selective Cdk inhibitors. Mol Neurobiol. 34 (1), 27-50 (2006).
- Kahsai, L., Zars, T. Learning and memory in Drosophila: behavior, genetics, and neural system. Int. Rev. Neurobiol. 99, 139-167 (2011).
- Lee, T., Lee, A., Luo, L. Development of the Drosophila mushroom bodies: sequential generation of three distinct types of neurons from a neuroblast. Development. 126, 4065-4076 (1999).
- Watts, R. J., Hoopfer, E. D., Luo, L. Axon pruning during Drosophila metamorphosis: evidence for local degeneration and requirement of the ubiquitin-proteasome system. Neuron. 38 (6), 871-885 (2003).
- Lee, T., Marticke, S., Sung, C., Robinow, S., Luo, L. Cell-autonomous requirement of the USP/EcR-B ecdysone receptor for mushroom body neuronal remodeling in Drosophila. Neuron. 28 (3), 807-818 (2000).
- Connell-Crowley, L., Le Gall, M., Vo, D. J., Giniger, E. The cyclin-dependent kinase Cdk5 controls multiple aspects of axon patterning in vivo. Curr. Biol. 10 (10), 599-602 (2000).
- Truman, J. W., Riddiford, L. M. Endocrine insights into the evolution of metamorphosis in insects. Annu. Rev. Entomol. 47, 467-500 (2002).
- Noguchi, T., Miller, K. G. A role for actin dynamics in individualization during spermatogenesis in Drosophila melanogaster. Development. 130, 1805-1816 (2003).
- Siller, K. H., Serr, M., Steward, R., Hays, T. S., Doe, C. Q. Live imaging of Drosophila brain neuroblasts reveals a role for Lis1/dynactin in spindle assembly and mitotic checkpoint control. Mol. Biol. Cell. 16 (11), 5127-5140 (2005).
- Brown, H. L. D., Cherbas, L., Cherbas, P., Truman, J. W. Use of time-lapse imaging and dominant negative receptors to dissect the steroid receptor control of neuronal remodeling in Drosophila. Development. 133, 275-288 (2006).
- Williamson, W. R., Hiesinger, P. R. Preparation of Developing and Adult Drosophila Brains and Retinae for Live Imaging. J. Vis. Exp. (37), e1936 (2010).
