Summary
यह लेख एक विधि है जिसके द्वारा एक नकल कर सकते हैं का वर्णन
Protocol
ए मीडिया की तैयारी
- फिल्टर स्टरलाइज़ Schneider ड्रोसोफिला मीडिया 10% भ्रूण गोजातीय सीरम और 1% पेनिसिलिन / स्ट्रेप्टोमाइसिन के साथ पूरक पूरी मीडिया की तैयारी.
- मीडिया हर बार नए सिरे से तैयार किया जाना चाहिए. वैकल्पिक रूप से, पूर्व जमी मीडिया के एक ताजा अशेष भाजक प्रत्येक का उपयोग करने से पहले, thawed जा सकता है.
- संवर्धन के लिए पहले, 10 μg / मिलीलीटर इंसुलिन और 2 / μg मिलीलीटर मीडिया ecdysone जोड़ें. दवाओं केंद्रित स्टॉक के रूप में तैयार किए गए और छोटे aliquots में जमे हुए. Thawed है aliquots refrozen नहीं थे.
- सभी काम कर रहे समाधान 25 डिग्री सेल्सियस पर रखा जाना चाहिए
लारवल दिमाग का संवर्धन
1. चयन और लारवल दिमाग के विच्छेदन
- एक 12 मिमी Millicell सेल संस्कृति डालने के लिए मीडिया के 500 μl जोड़ें. विच्छेदित दिमाग इन आवेषण में रखा जाएगा लिए आसान Immunostaining की सुविधा.
- एक विच्छेदन घड़ी का शीशा तैयार मीडिया की एक छोटी राशि जोड़ें.
- यूएक छोटा सा रंग गाते हैं, भटक 3 instar लार्वा लेने और घड़ी गिलास में उन्हें जगह है. (हम अनुमान है कि पूर्व vivo संस्कृति विधि समान रूप से अच्छी तरह से पहले या दूसरे instar लार्वा को लागू होता है, लेकिन हम यह परीक्षण नहीं किया है.)
- संदंश की एक जोड़ी के साथ लार्वा के पीछे छोर पकड़े, ध्यान से # 5 संदंश की दूसरी जोड़ी के साथ पूर्वकाल अंत खुला.
- जल्दी से बाहर मस्तिष्क काटना, उदर तंत्रिका कॉर्ड बरकरार रखते हुए.
2. विच्छेदित लारवल दिमाग की पूर्व vivo में संवर्धन
- पूर्व गीला विंदुक युक्तियाँ का प्रयोग, मस्तिष्क ध्यान हस्तांतरण सेल संस्कृति आवेषण, मीडिया के साथ पूर्व भर में.
- स्थानांतरण दिमाग, मीडिया में, 25 में एक मशीन के लिए डिग्री सेल्सियस तक समय बिंदु वांछित तक पहुँच जाता है. इस विधि संस्कृति में 48 घंटे के लिए कुशलता से काम करता है.
- 8 घंटे में मीडिया बदलें. इसके अलावा, हर 5-6 घंटे मीडिया के आधे की जगह.
3. के औषधीय हेरफेरकीड़े के बच्चे का दिमाग
पूर्व vivo संवर्धन की यह विधि pharmacologically आनुवंशिक पहले हमारे एक प्रयोगशाला में प्रदर्शन बातचीत की पुष्टि इस्तेमाल किया जा सकता है.
- 100 माइक्रोन roscovitine और 100 माइक्रोन तैयार मीडिया के लिए olomoucine जोड़ें.
- इस मीडिया को विच्छेदित दिमाग स्थानांतरण.
- 25 में संस्कृति दिमाग ° सी 24 घंटे के लिए.
- 8 घंटे में मीडिया बदलें. से परे है कि मीडिया के आधे (ड्रग्स) के साथ हर 5-6 घंटे की जगह.
Pupal दिमाग का संवर्धन
1. विच्छेदन के लिए pupae का चयन
- मार्क बोतलें / शीशियों पर सफेद pupae.
- केवल pupae है कि पूरी तरह से सफेद होते हैं चुनें. रंगाई के किसी भी प्रकार के साथ pupae शामिल नहीं किया जाना चाहिए.
- इस चरण Puparium गठन के बाद (APF) के 0 घंटे है.
- इन pupae विच्छेदन के लिए तैयार अंकन के बाद 1.5 घंटे होगा. यह कदम करने के लिए सुनिश्चित करें कि विकास छंटाई पूर्व vivo में होता है के लिए महत्वपूर्ण है
2. Pupae के विच्छेदन
- एक 12 मिमी Millicell सेल संस्कृति डालने के लिए मीडिया के 500 μl जोड़ें. (विच्छेदित दिमाग इन आवेषण में रखा जाएगा लिए आसान Immunostaining की सुविधा है).
- एक बार वांछित समय के बिंदु पर पहुँच गया है, एक विच्छेदन घड़ी का शीशा तैयार मीडिया की एक छोटी राशि जोड़ें.
- एक छोटे से, गीला रंग का प्रयोग, उठाओ pupae पहले विच्छेदन के लिए चिह्नित और घड़ी गिलास में उन्हें जगह है.
- संदंश की एक जोड़ी के साथ pupae के पीछे अंत होल्डिंग, ध्यान से # 5 संदंश की दूसरी जोड़ी के साथ कोषस्थ कीट मामले के पूर्वकाल अंत खोलें.
- जल्दी से बाहर मस्तिष्क काटना, उदर तंत्रिका कॉर्ड बरकरार रखने और संलग्न.
3. विच्छेदित pupal दिमाग की पूर्व vivo में संवर्धन
- सेल संस्कृति आवेषण, मीडिया के साथ पूर्व भर में मस्तिष्क ध्यान से स्थानांतरण.
- मीडिया में स्थानांतरण दिमाग, पी वांछित समय एक मशीन में 25 डिग्री सेल्सियस तकoint तक पहुँच जाता है. हम के लिए इस विधि का इस्तेमाल किया ऊपर दिखाया प्रयोग के लिए संस्कृति में 10 घंटे के लिए, लेकिन यह अवलोकन और उपचार की लंबी अवधि के लिए बढ़ाया जा सकता है, अगर जरूरत है.
- समय अंक 8 घंटे APF से अब के लिए, हर 5-6 घंटे के मीडिया की जगह.
पर इस कदम से, प्रोटोकॉल दोनों लार्वा और pupae के लिए अपरिवर्तित बनी हुई है.
बी विच्छेदित दिमाग फिक्सिंग
- एक बार वांछित समय बिंदु तक पहुँच जाता है, मीडिया को हटाने और 0.5% के साथ 1x पीबीएस में 4% formaldehyde के 500 μl जोड़ने ट्राइटन (PBST) के 30 मिनट के लिए X-100, 15 मिनट के बाद ताजा formaldehyde के साथ की जगह.
- सुनिश्चित करें कि दिमाग जबकि लगानेवाला साथ मीडिया की जगह शुष्क करने की अनुमति नहीं है.
- 0.5% TritonX - 100 (PBST) साथ 1x पीबीएस के चार 10 मिनट washes के साथ बंद formaldehyde धो लें.
सी. धुंधला हो जाना निश्चित दिमाग
- बाद formaldehyde से धोया गया है, सामान्य 1% के साथ 1 घंटे के लिए दिमाग 1x पीबीएस अवरुद्ध समाधान में ब्लॉकबकरी सीरम और 1% गोजातीय सीरम albumin.
- प्राथमिक एंटीबॉडी समाधान को रोकने में जोड़ें.
- अंडों पर बैठना 4 में रात भर दिमाग डिग्री सेल्सियस
- अगली सुबह, 10 PBST की चार मिनट washes के साथ प्राथमिक एंटीबॉडी धोने.
- माध्यमिक एंटीबॉडी समाधान को रोकने में जोड़ें.
- 4 घंटे के लिए कमरे के तापमान पर छोड़ दें.
- 10 PBST की चार मिनट washes के साथ धो माध्यमिक एंटीबॉडी.
डी. बढ़ते माइक्रोस्कोपी के लिए फिक्स्ड और सना हुआ दिमाग
- 1 घंटे के लिए Vectashield बढ़ते मीडिया में दिमाग को संतुलित करना.
- Vectashield बढ़ते मीडिया का उपयोग करते हुए कांच स्लाइड पर दिमाग माउंट.
- दिमाग के दोनों ओर बढ़ते कवर पर्ची से पहले गिलास चिप्स रखें. यह कुचल होने से दिमाग को रोकता है, जबकि नमूना काफी पतली है एक confocal खुर्दबीन के साथ सभी फोकल विमानों स्कैन रखते हुए. दिमाग करने के लिए ब्याज की सुविधाओं को देखने की सुविधा बढ़ते पर लगभग उन्मुख थे. जब आवश्यक हो,मस्तिष्क छवियों Imaris सॉफ्टवेयर के साथ घुमाया प्रलेखन और माप के लिए एक इष्टतम दृश्य प्रदान करते थे.
- सील स्पष्ट नेल पॉलिश के साथ निकल जाता है कवर.
- स्टोर प्रकाश से दूर स्लाइड.
ई. प्रतिनिधि परिणाम
चित्रा 1 (ए) प्रकार के जंगली मक्खियों के तीसरे - instar के लार्वा दिमाग के एक पैनल से पता चलता है और (ख) मक्खियों कि Cdk5 के एक प्रमुख नकारात्मक व्युत्पन्न (Cdk5DN) (Connell - Crowley एट अल, 2000) व्यक्त. दोनों actin GFP MB गामा न्यूरॉन्स में व्यक्त (हरा). जैसा कि पहले बताया गया (Trunova एट अल, 2011), वहाँ जंगली प्रकार गामा न्यूरॉन्स कि actin GFP जमा करने में विफल रहता है की समीपस्थ axons में एक क्षेत्र है, इस प्रकार एक स्पष्ट क्षेत्र "(एक, वर्ग) के रूप में दिखा रहा है, और fasciclin 2 प्रोटीन (लाल) axons में केवल इस क्षेत्र के उदर सीमा (सफेद क्षैतिज रेखा) तक जम जाता है. चित्रा 1 (ए) के तीसरे पैनल में बिंदीदार रेखा एमबी की स्थिति को इंगित करता है, कार्य पर प्रकाश डाला"स्पष्ट" क्षेत्र और अपने उदर सीमा में. में Cdk5DN व्यक्त मक्खियों, actin के स्पष्ट क्षेत्र अनुपस्थित है (बी) और 2 Fasciclin (FasII) immunoreactivity कि क्षेत्र के माध्यम से पीछे की ओर से फैलता है. (ध्यान दें कि एमबी में क्षैतिज FasII सकारात्मक axons परियोजना के चर संख्या, इन phenotype के लिए प्रासंगिक नहीं हैं). स्केल बार 20 माइक्रोन का प्रतिनिधित्व करता है.
पूर्व vivo संवर्धन के बारे में हमारी पद्धति का उपयोग करके, हम roscovitine और olomoucine, Cdk5 गतिविधि के औषधीय inhibitors का एक संयोजन के साथ जंगली प्रकार मक्खियों इलाज चित्रा 2 नियंत्रण के तीसरे instar लार्वा दिमाग (ए) के एक पैनल है और दवा इलाज (बी से पता चलता है. ) जंगली प्रकार मक्खियों. एक प्रमुख नकारात्मक Cdk5 निर्माण को व्यक्त करने, Cdk5 inhibitors के साथ 24 घंटे के लिए इलाज दिमाग मक्खियों के लिए इसी प्रकार, actin के स्पष्ट क्षेत्र की विशेषता नुकसान और FasII सीमा में बदलाव (वर्ग कोष्ठक) दिखाते हैं. सफेद लाइनें जंगली प्रकार FasII सीमा की स्थिति दिखाने के. स्केल बार 20 माइक्रोन का प्रतिनिधित्व करता है.
Figu3 फिर से 0-10 APF घंटे से ड्रोसोफिला मशरूम शरीर के एक प्रतिनिधि श्रृंखला, झिल्ली में लक्षित mCD8 - GFP (हरा) के साथ लेबल से पता चलता है. कोष्ठक पुष्पकोश एमबी के वृक्ष के समान अनुमानों से संकेत मिलता है कि,. कायापलट करने से पहले, एक एमबी मोटी बंडलों के रूप में के रूप में अच्छी तरह से फ्लोरोसेंट घने वृक्ष के समान कुंज (कोष्ठक) से उत्पन्न होने वाले संकेत के एक 'धुंध' में dorso पेट के बल दौड़ axons देख सकते हैं. पैनल एक शो के समय में विच्छेदित दिमाग संकेत दिया. नोट छंटाई क्षेत्र में dendrites के कोष्ठक द्वारा संकेत दिया है, जैसे कि APF, वृक्ष के समान संकेत की धुन्ध 6-8 बजे तक चला गया है (हालांकि axonal संकेत अप्रभावित है). पैनल बी में दिमाग 0 घंटे APF में विच्छेदित किया गया, के आंतरिक ecdysone (ट्रूमैन और Riddiford, 2002) के कील, और सुसंस्कृत पूर्व vivo के रूप में संकेत से पहले. इन dendrites के विकास छंटाई नहीं दिखा, बल्कि वृक्ष के समान संकेत 10 APF बजे से बनी हुई है. इस दरकिनार, pupae 0 घंटे APF में चिह्नित कर रहे हैं, लेकिन 15 घंटे APF और सुसंस्कृत विच्छेदित. फलकएल सी 0-10 घंटे APF से इन ड्रोसोफिला मशरूम शरीर के एक प्रतिनिधि श्रृंखला को दर्शाता है. गैर सुसंस्कृत नमूने के रूप में वृक्ष के समान संकेत 8 घंटा APF द्वारा undetectable है. स्केल बार 20 माइक्रोन का प्रतिनिधित्व करता है.
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Discussion
ऊतक संरचना और समारोह म्यूटेशनों और transgenes की अभिव्यक्ति सहित, की पुरानी आनुवंशिक जोड़तोड़, आम तौर पर तत्काल प्रभाव और देर से अप्रत्यक्ष परिणाम है कि अलग करने के लिए बहुत मुश्किल हो सकता है की एक संयोजन का उत्पादन. औषध विज्ञान के साथ आनुवंशिक तरीकों पूरक phenotype के पीछे समय पाठ्यक्रम की पूछताछ की सुविधा कर सकते हैं. उदाहरण के लिए, यह 10 ड्रोसोफिला में शुक्राणुजनन के दौरान विभिन्न घटकों के cytoskeletal योगदान विदारक के लिए एक शक्तिशाली दृष्टिकोण किया गया है. मौजूदा उदाहरण में, यह हमें दिखाने के लिए कि Cdk5 के लिए एक लगातार आवश्यकता है ड्रोसोफिला में एआईएस की संरचना को बनाए रखने की अनुमति दी गई है. अन्य प्रयोगों में हम भी दवाओं का उपयोग कर सफलता मिली है कि लक्ष्य प्रोटीन (imatinib), kinases actin (cytochalasin, latrunculin और jasplakinolide) के polymerization और सूक्ष्मनलिकाएं (vinblastine और taxol) के सहित अन्य सेलुलर घटकों,.
"> पूर्व vivo में संस्कृति के तरीकों का भी विकास की प्रक्रिया की गतिशीलता के उच्च संकल्प विश्लेषण की अनुमति पिछले अध्ययनों अल्पकालिक केंद्रीय 11, मस्तिष्क या तंत्रिका तंत्र के अन्य भागों की लंबी अवधि के इमेजिंग के रहते इमेजिंग वर्णित है, इस तरह के रूप में. वक्ष ganglia 12 और रेटिना / ऑप्टिक पालि कनेक्शन 13 यहाँ है, जब तक हम निश्चित सामग्री की Immunostaining ऊतक के विश्लेषण पर ध्यान केंद्रित किया है, हम वर्णन विधि केंद्रीय मस्तिष्क के लंबे समय तक रहते इमेजिंग के लिए लागू उदाहरण के लिए, उचित छंटाई होना चाहिए. axons और dendrites का ड्रोसोफिला मशरूम शरीर के विकास के दौरान केंद्रीय तंत्रिका तंत्र में सही कनेक्शन और स्फूर्तिदान के पैटर्न की स्थापना के लिए आवश्यक है इसके अतिरिक्त, में neuronal संगठन और remodeling में असामान्यताएं के लिए अल्जाइमर, ए एल एस और पार्किंसंस सहित कई neurodegenerative रोगों, आबाद करने के लिए लगा रहे हैं. यहां वर्णित तकनीक हमें अनुकरण करने के लिए अनुमति देता है ड्रोसोफिला मशरूम शरीर पूर्व vivo में neurites के vivo संस्कृति में, remodeling. अब हम विकास में आनुवंशिक परिवर्तन के जवाब में छवि में परिवर्तन, औषधीय उपचार या वातावरण में परिवर्तन कर सकते हैं.
चित्रा 1 ओवर Cdk5DN की अभिव्यक्ति 'actin स्पष्ट क्षेत्र' और - का ड्रोसोफिला मशरूम शरीर गामा न्यूरॉन्स में FasII सीमा में एक बदलाव के नुकसान का कारण बनता है. एक पैनल (हरा) actin-GFP और FasII के (लाल) के लिए जंगली प्रकार के दाग दिमाग के तीन उदाहरण से पता चलता है, जबकि पैनल बी दिमाग के दो उदाहरण Cdk5DN पर व्यक्त से पता चलता है. 'Actin स्पष्ट क्षेत्र' (कोष्ठक) के नुकसान पर ध्यान दें और (बी) में FasII उदर सीमा (क्षैतिज सफेद रेखा) में बदलाव करें. (ए) में बिंदीदार रेखा मशरूम शरीर की स्थिति को इंगित करता है. स्केल बार 20 माइक्रोन का प्रतिनिधित्व करता है.
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चित्रा 2 के साथ उपचार औषधीय Cdk5 inhibitors के roscovitine और olomoucine ड्रोसोफिला मशरूम शरीर में अधिक अभिव्यक्ति फेनोटाइप Cdk5DN mimics. पैनल दो नियंत्रण जंगली प्रकार के दिमाग से पता चलता है, जबकि पैनल बी दो दवा इलाज दिमाग, 24 घंटे के लिए सभ्य से पता चलता है. नोट: 'actin स्पष्ट क्षेत्र' (कोष्ठक) और FasII सीमा (क्षैतिज सफेद रेखा) (बी) में बदलाव की हानि. स्केल बार 20 माइक्रोन का प्रतिनिधित्व करता है.
3 ड्रोसोफिला मशरूम शरीर dendrites के dendrites के vivo remodeling में चित्रा पूर्व vivo recapitulated जा सकता है. पैनल एक बार झिल्ली ही सीमित GFP (हरा) के लिए संकेत दिया और दाग बिंदुओं पर विच्छेदित दिमाग से पता चलता है. नोट वृक्ष के समान संकेत के 8hr APF से लापता होने (फैलाना, हरी झंडी, ब्रैकेट द्वारा प्रकाश डाला). पैनल बी 0 घंटे APF और सुसंस्कृत पूर्व vivo में विच्छेदित दिमाग से पता चलता है पूर्व vivo संकेत के बाद, दिमाग से पता चलता है. ये दिमाग dendrite vivo में (ए) में देखा है कि इसी तरह की छंटाई दिखा. स्केल बार 20 माइक्रोन का प्रतिनिधित्व करता है.
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Disclosures
ब्याज की कोई संघर्ष की घोषणा की.
Acknowledgments
हम उनकी सलाह उपयोगी पांडुलिपि पर और चर्चा टिप्पणी के लिए हमारी प्रयोगशाला के सभी सदस्यों को धन्यवाद देना चाहूंगा. हम भी विशेष रूप से मार्ता कोच और Bassem हसन उत्कृष्ट सुझाव है कि हम remodeling के प्रयोगों में संवर्धन के लिए दिमाग विदारक से पहले 1.5 घंटे APF जब तक प्रतीक्षा के लिए धन्यवाद देना चाहूंगा. हम भी अपने confocal सूक्ष्मदर्शी का उपयोग NHGRI इमेजिंग सुविधा के लिए धन्यवाद. इस काम NINDS अंदर का रिसर्च प्रोग्राम एनआईएच (NS003106 Z01) के मूल तंत्रिका विज्ञान प्रोग्राम द्वारा समर्थित किया गया.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Schneider's Drosophila Media | Invitrogen | 21720-024 | |
| Fetal Bovine Serum (heat-inactivated) | Invitrogen | 10082-147 | 10% |
| Penicillin/Streptomycin | Invitrogen | 15140-122 | 1% |
| Insulin | Invitrogen | 12585-014 | 10μg/ml |
| Ecdysone | Sigma-Aldrich | H5142 | 2μg/ml |
| Roscovitine | Sigma-Aldrich | R7772 | 100μM |
| Olomoucine | Sigma-Aldrich | O0886 | 100μM |
| Normal Goat Serum | Invitrogen | 50062Z | 1% |
| Bovine Serum Albumin | Fisher Scientific | M9501 | 1% |
| Formaldehyde | Sigma-Aldrich | D4551 | 4% |
| Triton-X 100 | Fisher Scientific | BP151 | 0.5% |
| Phosphate Buffered Saline | Invitrogen | 70011-044 | 1X |
| Vectashield | Vector Laboratories | H1000 | |
| Millicell Cell Culture Inserts | EMD Millipore | PI8P01250 | |
| Multidish, 4 well | Thermo Fisher Scientific, Inc. | 176740 | |
| Dumont #5 Forceps | Fine Science Tools | 11251-20 | |
| Microscope Slides | Fisher Scientific | 12-544-7 | |
| Cover Glass | Fisher Scientific | 12-548-5M |
References
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