Summary
CRISPR / Cas systemen bemiddelen adaptieve immuniteit in Bacteria en Archaea. Veel Cas eiwitten worden voorgesteld om op te treden als endoribonucleases handelen crRNA voorlopers van verschillende lengte. Hier illustreren we drie verschillende benaderingen voor uw crRNA substraten voor de biochemische analyse van Cas endonuclease activiteit te genereren.
Abstract
De interactie van virussen en hun prokaryote gastheren stempel op de evolutie van bacterien en archaea leven. Prokaryoten ontwikkelde verschillende strategieën om virale aanvallen die beperking wijziging, mislukte infectie en CRISPR / Cas systemen omvatten ontwijken. Deze adaptieve immuunsysteem in veel bacteriën en de meeste Archaea uit lustered c r i egularly nterspaced s hort p alindromic r epeat (CRISPR) sequenties en een aantal C RISPR als associeerd (Cas) genen (Fig. 1) 1-3. Verschillende sets van Cas eiwitten en herhalingen te definiëren ten minste drie grote uiteenlopende soorten CRISPR / Cas systemen 4. De universele eiwitten CAS1 en CAS2 voorgesteld betrokken te zijn bij de opname van viraal DNA datzal een nieuwe afstandhouder tussen twee herhalingen aan het 5'-uiteinde van een uitschuifbare CRISPR cluster 5. De gehele cluster wordt omgezet in een precursor-crRNA met alle spacer en repeat sequenties en vervolgens verwerkt door een enzym van de diverse Cas6 familie in kleinere crRNAs 6-8. Deze crRNAs bestaan uit de spacer sequentie geflankeerd door een 5'-terminale (8 nucleotiden) en een 3'-terminale tag afgeleid van de herhalingssequentie 9. Een herhaalde infectie van het virus kan nu geblokkeerd als de nieuwe crRNA wordt geleid door een eiwitcomplex Cas (Cascade) om het virale DNA en als zodanig identificeren via base complementariteit 10. Tot slot, voor CRISPR / Cas type 1-systemen, zal de nuclease CAS3 vernietigen van de gedetecteerde indringer DNA 11,12.
Deze processen bepalen CRISPR / Cas als adaptieve immuunsysteem van prokaryoten en opende een fascinerende onderzoeksgebied voor de studie van de betrokken Cas eiwitten.De functie van veel Cas eiwitten is nog steeds ongrijpbaar en de oorzaken voor de schijnbare diversiteit van de CRISPR / Cas-systemen nog moeten worden verlicht. Mogelijke activiteiten van de meeste Cas eiwitten werden voorspeld via gedetailleerde computationele analyses. Een belangrijke fractie van Cas eiwitten zijn ofwel getoond of voorgesteld om te functioneren als endonucleasen 4.
Hier geven we methoden crRNAs en precursor-cRNAs voor de studie van Cas endoribonucleases genereren. Verschillende endonuclease tests moeten zowel korte herhalingssequenties die direct kunnen worden gesynthetiseerd als RNA oligonucleotiden of meer crRNA en pre-crRNA sequenties die worden gegenereerd via in vitro T7 RNA polymerase run-off transcriptie. Deze methode maakt de opname van radioactieve nucleotiden voor het genereren van intern gemerkte endonuclease substraten en het creëren van synthetische of mutant crRNAs. Cas6 endonuclease activiteit wordt gebruikt voor uw crRNAs groeien tot crRNAs met 5'-hydroxyl en een 2 ', 3'-cyclische fosfaat termini.
Protocol
1. Generatie van lange pre-crRNA substraten via PCR
- Ontwerp PCR primers gericht op de spacer gebieden van een CRISPR cluster. Voeg de T7 RNA polymerase (T7RNAP) promoter sequentie (5'-taatacgactcactata-3 ') aan de forward primer en restrictieplaatsen voor klonering van de PCR product in een vector beide primers (bijvoorbeeld BamHI en HindIII voor pUC19, Fig. 2A) .
Opmerking: Het is een guanidine T7RNAP rest voor juiste initiatie van transcriptie. - Amplify uw pre-crRNA sequentie van belang uit genomisch DNA door PCR.
- Scheid de PCR producten door agarose gelelektroforese en gel extraheren de gewenste band. Digereren van het PCR product met de restrictie-enzymen sticky ends (bijvoorbeeld BamHI en HindIII, Fig. 2A) te maken. Zuivert PCR product met een PCR zuiveringssamenstel om splitsing elimineren bijproducten.
- Stel een ligatiereactie die T4 DNA ligase bevat, T4 DNA ligase buffer eneen 3:1 molaire verhouding van de gesplitste PCR product en de gedefosforyleerde pUC vector lineaire overeenkomstige sticky ends. Incubeer het mengsel bij 16 ° C geroerd. Transformeer de ligatiemengsel in competente Escherichia coli DH5a-cellen door middel van standaard protocollen en het gebruik van blauw wit screening voor een succesvolle ligatie te identificeren.
- Isoleer plasmiden uit witte kolonies met behulp van een plasmide voorbereiding kit. Identificeren van positieve klonen plasmide sequencing. Een andere mogelijkheid kolonie PCR worden gebruikt voor screening.
2. Generatie van tussenproduct pre-crRNA substraten via gloeien van DNA oligonucleotiden
- Ontwerp voor-en achteruit oligonucleotiden met de gewenste CRISPR herhalen / spacer volgorde. De oligonucleotiden bevatten de sequentie van een T7 RNAP promoter en terminal restrictieplaatsen (bijvoorbeeld BamHI en HindIII voor pUC19). Sluit de oligonucleotiden aan die sticky ends vorm te garanderen na gloeien (zie Fig. 2B
- 5'-fosforyleren van 1 nmol elk oligonucleotide in een afzonderlijke 20 ui reactiemengsel dat 5 pl T4 polynucleotide kinase (PNK), 2 pi T4 PNK 10x buffer, 2 pl ATP (10 mM). Incubeer elk monster gedurende 1 uur bij 37 ° C.
- Hybridiseren de twee gefosforyleerde oligonucleotiden. Combineer 1 pi van het gefosforyleerde voorwaartse oligo mengsel (van 2,2.), 1 pi van de gefosforyleerde reverse oligo mengsel (van 2,2.), 1 pl T4 DNA ligase 10x buffer in een 10 pi reactie. Incubeer de monsters gedurende 5 minuten bij 95 ° C op een verwarmingsblok of in kokend water, zet de warmtebron en laat het mengsel afkoelen tot kamertemperatuur (~ 2-3 uur).
Opmerking: In deze kritieke stap, de langzame afkoeling bevordert het hybridiseren van beide oligonucleotiden in vergelijking met de vorming van structuren binnen elk afzonderlijk oligonucleotide. - Ligeren 4 ui van het hybridisatiemengsel, 1 pi van verteerd en gedefosforyleerd pUC vector (0,1 ug /ul) met T4 DNA ligase, T4 DNA ligase 10x buffer en 10 mM ATP in een 20 pi ligatiemengsel. Incubeer het monster bij 16 ° C geroerd.
- Transformeer de geligeerde plasmiden in competente Escherichia coli DH5a-cellen door middel van standaard protocollen en maken gebruik van blauw wit screening. Plasmiden isoleren en identificeren positieve klonen door digestie (Om te screenen op inserties van de gewenste grootte) en daaropvolgende sequencing plasmide.
3. Generatie van korte Cas RNA substraten via aangepaste RNA-oligonucleotide synthese
Ontwerp korte Cas RNA substraten (bijvoorbeeld enkele herhaling sequenties, Fig. 2C) en maken gebruik van custom-RNA-oligonucleotide synthese faciliteiten.
Opmerking: De opname van een deoxyribonucleotide bij een bepaalde positie van een oligonucleotide RNA (Fig. 2C) kan worden gebruikt om de plaats van RNA splitsing lokaliseren.
4. In vitro T7 RNA polymerase transcriptie
- Isoleer plasmiden met uw ontworpen construct (van 1.9. Of 2.7.) Met behulp van een Maxiprep plasmidezuivering kit.
- Lineariseren van het plasmide met het restrictie-enzym dat stroomafwaarts van het gekloneerde fragment (bijv. HindIII) splitst. Zorgen voor een volledige spijsvertering.
Opmerking: Als een divergerende gedefinieerd 3'-uiteinde van het RNA transcript is gewenst, de ontworpen construct een extra specifieke restrictieplaats bevatten voor "run-off" transcriptie stroomopwaarts van de sequentie HindIII. - Zuiver het gelineariseerde plasmide door fenol: chloroform (1:1) extractie en ethanol precipitatie. Herstel de nucleïnezuren door resuspenderen de pellet in DEPC behandeld steriel water.
- Maak een in vitro T7 RNAP weglopen transcriptie mengsel dat 40 mM Hepes / KOH (pH 8), 22 mM MgCl2, 5 mM dithiothreitol, 1 mM spermidine, 4 mM van elk nucleoside trifosfaat (ATP, CTP, GTP, UTP bevat ), 40-100 ug / ml gekniptplasmide en 0,1 mg / ml T7 RNAP in DEPC behandeld water. Incubeer 3 uur bij 37 ° C.
- Analyseer de verkregen RNA transcripten op een denaturerende 8 M ureum 12% polyacrylamide gel (Fig. 3A). De RNA transcripten kunnen worden gezuiverd via Mono Q anionenuitwisselingschromatografie 13 en gewonnen door ethanol precipitatie van de RNA fracties en resuspensie van de pellet in DEPC behandeld steriel water. Voor toekomstig gebruik, opslaan RNA bij -80 ° C.
5. Cas6 endonuclease assay
- Het opzetten van een 20 pl in vitro T7 RNAP weglopen transcriptie mengsel (zie 4.4) dat een kleinere hoeveelheid van 2 mM ATP bevat en aangevuld met 2,5 ul α-[32P]-ATP (10 mCi / ml, 5000 Ci / mmol). Zuiver reactieproducten via gel extractie van een denaturerend 8 M ureum 12% polyacrylamide gel. Visualiseer bands door autoradiografie.
- Produceren en zuiveren de gewenste recombinante Cas eiwitten. In dit voorbeeld CAS6 van Clostridium thermocellum werd gezuiverd door warmte neerslag en Ni-NTA chromatografie.
- Maak een endonuclease assay reactie (bijv. Clostridium thermocellum Cas6 het reactiemengsel bevat 20 mM Hepes (pH 8 KOH), 250 mM KCl, 2 mM MgCl2, 1 mM DTT, 12,000 cpm RNA substraat en 1 uM enzym en werd geïncubeerd bij 37 ° C gedurende 30 min).
- Plaats 5 pi van het reactiemengsel (+ 10 pi RNA loading buffer die 95% formamide) op een 8 M ureum 12% polyacrylamide gel. Visualiseer de splitsingsproducten na elektroforese door autoradiografie.
6. Representatieve resultaten
Een voorbeeld van RNA substraten voor de analyse van Cas endonuclease activiteit wordt getoond in figuur 3A. Een hoeveelheid van 5 ul van een analytische 100 ui in vitro transcriptiereactie waren geladen. Let op de efficiëntie van RNA productie varieert tussen verschillende constructen. Sommige factoren that waargenomen om de hoeveelheid verkregen RNA (i) de oorspronkelijke sequentie invloed na +1 G vereist voor transcriptie initiatie, (ii) de mogelijkheid RNA structuurvorming tijdens transcriptie en (iii) de keuze van de restrictieplaats voor het opwekken van de run-off decollete positie.
Het onderzoek RNA endonuclease activiteit vereist zowel sterk gezuiverd recombinant eiwitten Cas (Fig. 3B) en de juiste negatieve controles. Idealiter is dit negatief controlemonster verschilt zo weinig mogelijk uit de onderzochte Cas endonuclease reactie. Dit kan worden bereikt door incubatie van het RNA met reactiebuffer en cel-lysaat zonder Cas expressie (en de identieke zuiveringsprocedure). Een ideale negatieve controle is de toevoeging van een deoxyribonucleotide de voorgestelde splitsingsplaats. In figuur 3C is de splitsing van een 5'-terminale label repeat sequentie weergegeven voor Clostridium thermocellum Cas6. Onder identieke omstandigheden, deze herhaling is niet meer wanneer een substraat wordt geïntroduceerd deoxyribonucleotide op positie -9. Deze methode biedt ook informatie over de splitsingsplaats. Tenslotte wordt een lange intern gemerkte pre-crRNA gesplitst door Cas6 en twee splitsing fragmenten waargenomen.
Figuur 1. Schematisch overzicht van CRISPR / Cas activiteit. Het overzicht volgt de insertie van een virale DNA sequentie (protospacer) in de CRISPR cluster (aanpassing), de transcriptie en verwerking van de CRISPR matrix in kleine crRNAs een Cas6 endonuclease, de opname van crRNAs in de Cascade complex en tussenkomst van een herhaalde virale aanval gebaseerd op de complementariteit tussen crRNA en protospacer. Protospacer aangrenzende motieven (PAM) merk virale protospacer sequenties.
igure 2 "src =" / files/ftp_upload/4277/4277fig2.jpg "/>
Figuur 2. Genereren van RNA substraten voor Cas eiwitten. De regeling geeft de workflow voor het genereren van (A) lange pre-crRNA substraten, (B) intermediaire pre-crRNA substraten en (C) korte Cas RNA substraten voor pre-crRNA productie. Voorbeeld sequenties worden gepresenteerd voor de CRISPR reeks van Clostridium thermocellum. Klik hier om een grotere afbeelding te bekijken .
Figuur 3. Cas6 endonuclease assay. A.) toluidineblauw gekleurde polyacrylamidegel van een speciaal ontworpen RNA oligonucleotide (250 pmol) en twee in vitro RNA-transcripten (5 ul van een typisch 100 pi reactie). B.) SDS-PAGE gel van een Cas6 preparaat (80 pmol) van Clostridium thermocellum na hitteneerslaan bij 50 ° C gedurende 1 uur en Ni-NTA chromatografie. C.) Detectie van endonucleolytische Cas6 activiteit voor 5 'terminale label repeat sequenties en pre-crRNA in vitro transcripten. De invoering van een dNTP op positie -9 schaft Cas6 splitsing gedurende korte Cas RNA substraat (S, Fig. 2C). Een 5 'klem 8 nt tag wordt ook gegenereerd voor crRNA rijping van lange pre-crRNA substraten (L, Fig. 2A). De banden werden gescheiden op een denaturerende 8 M ureum 12% polyacrylamide gel en gevisualiseerd door autoradiografie.
Discussion
De gepresenteerde methode kan de generatie van Cas endonuclease substraten van verschillende grootte varieert en met verschillende vrijheid in de juiste volgorde design. De rechttoe rechtaan aanpak voor het genereren van synthetische RNA oligonucleotide substraten beperkt tot korte RNA ontwerpen door toenemende kosten en technische beperkingen maken meer RNA oligomeren. Hoewel succesvol RNA synthese is gerapporteerd voor ongewijzigde RNA oligomeren van meer dan 100 nucleotiden lang, de praktische en economische maximum voor aangepaste RNA synthese ligt dan 40 nucleotiden. Maar elk gegeven sequentie worden gesynthetiseerd en gericht introductie van gemodificeerde nucleotiden (bv. deoxyribonucleotiden) kan worden gebruikt om knipplaatsen in detail te analyseren. Langere pre-cRNAs worden gegenereerd via in vitro transcriptie.
Het hybridiseren van oligonucleotiden die een T7 RNA polymerase promoter maakt de productie van tussenliggende lengte pre-crRNAs. De maximale lengte van routinematig en economisch gesynthetiseerde DNA oligonucleotiden boven 150 nucleotiden en de maximale synthetische pre-crRNAs via deze methode. De samenvoeging van verscheidene DNA gehybridiseerde oligonucleotide paren die sticky ends met elkaar vormen kunnen verlengen maximumlengte maar vereist toenemende problemen bij het klonen van het construct. Het belangrijkste voordeel van deze methode is de mogelijkheid om pre-crRNA constructen (en dus Cas endonuclease substraten) te genereren met elke gewenste volgorde. Dit maakt het testen van synthetische crRNA ontwerpen.
Tenslotte kunnen grotere pre-crRNAs worden verkregen amplificaten PCR van genomisch gehele CRISPR elementen of delen daarvan. Wijzigingen in de in vitro transcriptie template plasmide kan worden ingebracht via plaatsgerichte mutagenese voor het genereren van pre-crRNA varianten. Deze constructen kunnen worden gebruikt om het algemene endonucleolytische splitsing patroon binnen een volledige analysepre-crRNA.
Het pionierswerk voor de productie van niet-gemodificeerd RNA via T7 RNA polymerase in vitro transcriptie was gebaseerd op overdracht RNAs 14 en brome mosaic virus RNA 15. De consensus T7 RNA polymerase promoter bestaat uit een herkenningsdomein (-17 tot -5) en een initiatie domein (-4 tot +6) met transcriptie initiatie in een essentieel guanosine +1 16. Posities stroomafwaarts van +1 worden gevarieerd waardoor voor de transcriptie van iedere gewenste RNA sequentie. De gepresenteerde methoden voor het genereren van in vitro run-off transcriptie templates in vitro synthese van volledige pre-crRNAs dat genomische regio CRISPR of synthetische pre-crRNA varianten passen. De transcripten gegenereerd met een 5'-trifosfaat terminal aanwezig tenzij de transcriptiereactie is gemaakt met GMP naar 5 'monofosfaat termini 14 verkrijgen. Dergelijke termini zijn vereist indien de transcripten worden geëtiketteerdmet T4 polynucleotide kinase en γ-[32P]-ATP. Klievingsactiviteit van Cas6 en Cas6-achtige enzymen genereert crRNA die 5'-hydroxyl en 2 ', 3'-cyclische fosfaat termini bevatten. Deze RNA's kunnen dan worden geanalyseerd voor herkenning door de Cascade complex.
Disclosures
Geen belangenconflicten verklaard.
Acknowledgments
De auteurs willen graag Schermuly bedanken Jeanette voor de voorbereiding van recombinant T7 RNA-polymerase en Norman Ebelt voor hulp bij het opstellen van figuur 1. Dit werk werd gefinancierd door fondsen van de Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG FOR1680) en het Max Planck Instituut.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Antarctic Phosphatase | NEB | M0289L | |
| in vitro Transcription Grade Ultrapure Nucleotide Triphosphates | Jena Bioscience | NU-1010 - NU-1013 | |
| Liquid chromatography, ktapurifier 100 | GE Healthcare | ||
| DNA oligonucleotides | MWG Operon | ||
| RNA oligonucleotides | MWG Operon | ||
| Gel Extraction Kit | QIAGEN | 28704 | |
| PCR purification Kit | QIAGEN | 28104 | |
| Spin Miniprep Kit | QIAGEN | 27106 | |
| Plasmid Maxi Kit | QIAGEN | 12163 | |
| BamHI | NEB | R0136L | |
| HindIII | NEB | R0104L | |
| T4 DNA Ligase | NEB | M0202S | |
| T4 Polynucleotide Kinase | Ambion | AM2310 | |
| T7 RNA Polymerase | own preparation | ||
| Deoxynucleotide Solution Mix | NEB | N0447L | |
| Mini-PROTEAN Tetra Electrophoresis System | Bio-Rad | 165-8001 | |
| Storm 840 Scanner | GE Healthcare | 163723 | |
| Storage Phosphorscreen | Molecular Dynamics | 63-0034-81 | |
| Mono Q 5/50 GL | GE Healthcare | 17-5166-01 | |
| Phusion High-Fidelity DNA Polymerase | NEB | M0530L | use the GC buffer |
| Toluidine Blue | Sigma | T3260 | |
| pUC19 | NEB | N3041S | |
| γ-[32P]-ATP, α-[32P]-ATP | Hartmann Analytic | SRP-401, SRP-307 |
References
- Barrangou, R. CRISPR provides acquired resistance against viruses in prokaryotes. Science. 315, 1709-1712 (2007).
- Makarova, K. S., Grishin, N. V., Shabalina, S. A., Wolf, Y. I., Koonin, E. V. A putative RNA-interference-based immune system in prokaryotes: computational analysis of the predicted enzymatic machinery, functional analogies with eukaryotic RNAi, and hypothetical mechanisms of action. Biol. Direct. 1, 7 (2006).
- Lillestøl, R. K., Redder, P., Garrett, R. A., Brugger, K. A putative viral defence mechanism in archaeal cells. Archaea. 2, 59-72 (2006).
- Makarova, K. S. Evolution and classification of the CRISPR-Cas systems. Nat. Rev. Microbiol. 9, 467-477 (2011).
- Brouns, S. J. Small CRISPR RNAs guide antiviral defense in prokaryotes. Science. 321, 960-964 (2008).
- Carte, J., Pfister, N. T., Compton, M. M., Terns, R. M., Terns, M. P. Binding and cleavage of CRISPR RNA by Cas6. RNA. 16, 2181-2188 (2010).
- Haurwitz, R. E., Jinek, M., Wiedenheft, B., Zhou, K., Doudna, J. A. Sequence- and structure-specific RNA processing by a CRISPR endonuclease. Science. 329, 1355-1358 (2010).
- Gesner, E. M., Schellenberg, M. J., Garside, E. L., George, M. M., Macmillan, A. M. Recognition and maturation of effector RNAs in a CRISPR interference pathway. Nat. Struct. Mol. Biol. 18, 688-692 (2011).
- Carte, J., Wang, R., Li, H., Terns, R. M., Terns, M. P. Cas6 is an endoribonuclease that generates guide RNAs for invader defense in prokaryotes. Genes Dev. 22, 3489-3496 (2008).
- Wiedenheft, B. Structures of the RNA-guided surveillance complex from a bacterial immune system. Nature. 477, 486-489 (2011).
- Garneau, J. E. The CRISPR/Cas bacterial immune system cleaves bacteriophage and plasmid DNA. Nature. 468, 67-71 (2010).
- Sinkunas, T. Cas3 is a single-stranded DNA nuclease and ATP-dependent helicase in the CRISPR/Cas immune system. EMBO J. 30, 1335-1342 (2011).
- Jahn, M. J., Jahn, D., Kumar, A. M., Söll, D. Mono Q chromatography permits recycling of DNA template and purification of RNA transcripts after T7 RNA polymerase reaction. Nucleic Acids Res. 19, 2786-2787 (1991).
- Sampson, J. R., Uhlenbeck, O. C. Biochemical and physical characterization of an unmodified yeast phenylalanine transfer RNA transcribed in vitro. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 85, 1033-1037 (1988).
- Dreher, T. W., Bujarski, J. J., Hall, T. C. Mutant viral RNAs synthesized in vitro show altered aminoacylation and replicase template activities. Nature. 311, 171-175 (1984).
- McGinness, K. E., Joyce, G. F. Substitution of ribonucleotides in the T7 RNA polymerase promoter element. J. Biol. Chem. 277, 2987-2991 (2002).
