Summary
박테리아와 Archaea의 CRISPR / 카스 시스템 중재 적응 면역. 많은 카스 단백질은 길이를 변화의 crRNA의 전구체에 작용 endoribonucleases 역할을 제안하고 있습니다. 여기 카스의 endonuclease 활동의 생화학 분석을위한 사전 crRNA 기판을 생성하는 세 가지 방법을 설명합니다.
Abstract
바이러스와 prokaryotic 호스트의 상호 작용이 박테리아와 archaeal 삶의 진화를 형성. Prokaryotes이 제한 수정, 불임 감염과 CRISPR / 카스 시스템이 포함되어 바이러스 공격을 피하기 위해 여러 전략을 개발했습니다. C는 내가 S hort P alindromic 연구 epeat (CRISPR) 시퀀스 및 sociated (카스) 유전자와 같은 C RISPR의 수 (그림 1) 1-3을 nterspaced egularly r을 lustered의 많은 박테리아 대부분의 Archaea에서 발견 된 이러한 적응 면역 시스템으로 구성되어 있습니다. 카스 단백질과 반복의 다른 세트 CRISPR / 카스 시스템 (4)의 적어도 세 가지 주요 발산 유형을 정의합니다. 보편적 인 단백질 Cas1 및 Cas2은 바이러스 DNA의 이해에 참여하는 제안됩니다연장 CRISPR 클러스터 (5)의 5 '말단에서 두 반복 사이에 새로운 스페이서 요소를 생성합니다. 전체 클러스터는 모든 공백 및 반복 시퀀스를 포함하는 전구체 - crRNA로 베꼈되어 이후 작은 crRNAs 6-8로 다양한 Cas6 가족의 효소에 의해 처리됩니다. 이 crRNAs은 5 '터미널 (8 세포핵)과 3'반복 순서 9에서 파생 터미널 태그가 옆에있는 스페이서 순서로 구성되어 있습니다. 새로운 crRNA이 바이러스 DNA에 카스 단백질 단지 (캐스케이드) 감독의 기본 complementarity 10을 통해 사용자로 식별 될 것 같은 바이러스의 반복 감염은 이제 차단 될 수 있습니다. 마지막으로, CRISPR / 카스에 1을 입력 한 시스템을위한, nuclease Cas3이 검출 된 침입자 DNA 11,12을 파괴합니다.
이러한 프로세스는 prokaryotes의 적응 면역 시스템으로 CRISPR / 카스를 정의하고 관련자 카스 단백질 연구에 대한 흥미로운 연구 분야를 열었습니다.많은 카스 단백질의 기능은 여전히 어려운이며, CRISPR / 카스 시스템의 명백한 다양성의 원인은 조명 할 수 남아 있습니다. 대부분의 카스 단백질의 잠재적 인 활동은 자세한 계산 분석을 통해 예측했다. 카스 단백질의 단수가 하나 표시하거나 4 endonucleases으로 작동하도록 제안하고 있습니다.
여기, 우리는 카스의 endoribonucleases의 연구 crRNAs 및 전구체-cRNAs를 생성하는 방법을 제시한다. 다른 endonuclease의 assays 직접 RNA의 oligonucleotides 또는 실행 - 오프 스크립트 체외 T7 RNA 중합 효소의의를 통해 생성되는 이상 crRNA 및 사전 crRNA 시퀀스로 합성 할 수 있습니다 중 짧은 반복 시퀀스가 필요합니다. 이 방법론은 내부적으로 표시된 endonuclease 기판 및 합성 또는 돌연변이 crRNAs의 창조의 세대를위한 방사성 세포핵의 결합이 가능합니다. Cas6 endonuclease 활동이 5'-hydr와 crRNAs에 사전 crRNAs를 성숙하기 위해 사용된다oxyl과 2 ', 3'-순환 인산염 테르 미니 (Termini).
Protocol
1. PCR을 통해 긴 사전 crRNA 기판의 생성
- CRISPR 클러스터의 공백 지역을 대상으로 디자인 PCR의 프리 머. T7 RNA의 효소를 추가 복제에 대한 기대 입문서 및 제한 사이트 (T7RNAP) 발기인 순서 (5 '-taatacgactcactata-3') 모두 프리 머 (pUC19에 대한 예를 BamHI과 뒷다리 III, 그림. 2A)에 벡터로 PCR 제품 .
참고 : T7RNAP는 전사의 적절한 개시를위한 구아니딘 잔여 물이 필요합니다. - PCR에 의해 게놈 DNA에서 관심의 사전 crRNA 순서를 증폭.
- 아가로 오스 겔 전기 영동하여 PCR 제품을 분리하고 젤 원하는 대역의 압축을 풉니 다. 끈적 끝 (예를 들면 BamHI 및 HindIII, 그림. 2A)을 만들 제한 효소로 PCR 제품을 소화. - 제품에 의해 절단을 제거하기 위해 PCR 정화 키트를 사용하여 PCR 제품을 정화.
- T4 DNA ligase에 포함되어 있습니다 결합 반응, T4 DNA ligase의 버퍼와 설정흘리고 PCR 제품 및 해당 끈적 끝으로 dephosphorylated 선형 pUC 벡터의 3시 1분 몰 비율입니다. 16 ° C 하룻밤에 혼합물을 품다. 표준 프로토콜에 의해 관할 대장균 DH5α 세포에 결합 혼합물을 변환하고 성공적인 결합을 식별하는 파란색 흰색 검사를 사용합니다.
- 플라스미드 준비 키트를 사용하여 흰색 식민지에서 plasmids를 분리합니다. 플라스미드 시퀀싱에 의해 긍정적 인 클론을 확인합니다. 또한 식민지 PCR은 검사에 활용 될 수 있습니다.
2. DNA의 oligonucleotides의 어닐링을 통해 중간 사전 crRNA 기판의 생성
- 앞으로 디자인하고 원하는 CRISPR 반복 / 스페이서 순서로 oligonucleotides를 반대로. oligonucleotides는 T7 RNAP 프로모터뿐만 아니라 터미널 제한 사이트 (pUC19에 대한 예를 BamHI과 뒷다리 III)의 순서가 포함되어 있습니다. (그림을 참조하십시오. 2B 어닐링 후에 끈적 끝 양식을 보장하기 위해 oligonucleotides를 종료
- T4 폴리 뉴클레오타이드의 키나제의 5 μl (PNK), T4 PNK 10 배 버퍼, 2 μl ATP (10 ㎜)의 2 μl를 포함하는 별도의 20μl 반응의 각 oligonucleotide의 5'-phosphorylate 1 nmol. 37에서 1 시간 동안 각각의 샘플을 품다 ° C.
- 두 phosphorylated oligonucleotides를 잡종을 만들다. phosphorylated 앞으로 oligo의 혼합물 (2.2.), phosphorylated 역 oligo의 혼합물 (2.2.), 10 μl 반응의 T4 DNA ligase의 10 배 버퍼 1 μl 1 μl의 1μl 조화를 이루고 있습니다. 95시 5 분에 대한 샘플을 배양 ° 가열 블록 또는 끓는 물에 C, 열원을 끄고 실내 온도 (~ 2-3시간)에 아래 혼합물이 멋진 보자.
참고 :이 중요한 단계에서 속도가 느린 냉각 과정은 각 단일 oligonucleotide 내 구조의 형성에 비해 두 oligonucleotides의 어닐링을 좋아 하시 더군요. - 소화와 dephosphorylated pUC 벡터의 1μl 하이브리드 믹스 4 μl를, (Ligate 0.1 μg /T4 DNA ligase에, T4 DNA ligase의 10 배 버퍼와 20 μl 결합 혼합 10 MM ATP 포함) μl. 16 ° C 하룻밤에 샘플을 품다.
- 표준 프로토콜에 의해 관할 대장균 DH5α 세포에 출혈도 잡았 plasmids를 변환과 파란색 흰색 검사를 사용합니다. plasmids를 분리하고 소화 (원하는 크기의 삽입물에 대한 화면)과 이후의 플라스미드 시퀀싱에 의해 긍정적 인 클론을 확인합니다.
3. 사용자 정의 RNA의 합성 oligonucleotide를 통해 짧은 카스 RNA 기판의 생성
디자인 짧은 카스 RNA 기판 (예 : 하나의 반복 시퀀스, 그림. 2C) 및 사용자 지정 RNA의 합성 oligonucleotide 시설을 사용합니다.
참고 : RNA의 oligonucleotide의 지정된 위치 (그림 2C)에 deoxyribonucleotide의 포함은 RNA의 절단의 사이트를 정확하게하는 데 사용할 수 있습니다.
4.에서 체외 T7 RNA 중합 효소의 전사
- 귀하의 설계 구조 (1.9. 또는 2.7에서.) maxiprep 플라스미드 정제 키트를 사용하여 plasmids를 분리합니다.
- 복제 조각 (예 : HindIII)의 하류를 cleaves 제한 효소로 플라스미드를 Linearize. 완전한 소화를 확인합니다.
참고 : RNA의 성적 증명서를 발산 정의 3 '말단이 원하는 경우, 설계 구조가 HindIII 시퀀스의 상류 "실행 - 오프"스크립트에 대한 추가 특정 제한 사이트를 포함해야합니다. - 클로로포름 (1:1) 추출 및 에탄올 강수량 : 선형화 된 페놀의 플라스미드를 정화. DEPC 처리 멸균 물에 펠렛을 resuspending하여 핵산을 복구 할 수 있습니다.
- 체외 T7 RNAP의 40 MM Hepes / 코 (산도 8), 22 MM MgCl 2, 5 MM dithiothreitol, 1 밀리미터 spermidine, 각 뉴 클레오 사이드의 삼인산 4 ㎜ (ATP, CTP, GTP, UTP이 포함되어 전사 혼합을 실행 설정 ), 40-100 μg / 소화의 ML플라스미드와 DEPC 처리 물에 0.1 MG / ML T7 RNAP. 37 3 시간 동안 품다 ° C.
- 8 M의 요소를 denaturing 12 % polyacrylamide 젤 (그림 3A)에 얻은 RNA 기록을 분석합니다. RNA의 성적은 모노 Q 음이온 교환 크로마토 그래피 13을 통해 정화되고 DEPC 처리 멸균 물에 RNA의 분수와 펠렛의 resuspension의 에탄올 침전으로 복구 할 수 있습니다. 나중에 사용하기 위해, -80에서 RNA를 저장 ° C.
5. Cas6 endonuclease 분석
- 설정 체외 T7 RNAP 20 μl 2 MM ATP의 감소 금액을 포함하고 구비되는 (4.4 참조) 전사 혼합을 실행하는 2.5 μl α-[32 P]-ATP (10 MCI / ML, 5000 CI / mmol). denaturing 8 M의 우레아 12 % polyacrylamide 젤에서 젤 추출을 통해 반응 제품을 정화. autoradiography에 의해 밴드를 표시합니다.
- 원하는 재조합 카스 단백질을 생산하고 정화. 이 예에서는, C클로스 트리 디움 thermocellum에서 as6는 열 강수량과 니켈 NTA 크로마토 그래피를 통해 정화되었습니다.
- 클로스 트리 디움 thermocellum Cas6에 대한 endonuclease 분석 반응 (예를 설정, 반응 혼합물은 20 MM Hepes (코 pH8), 250 MM KCl, 2 MM MgCl 2, 1 MM DTT 12,000 노출 당 비용 (CPM) RNA 기판 및 1 μM 효소를 포함하고에 incubated되었습니다 37 ° C 30 분 용).
- 8 M의 우레아 12 % polyacrylamide 젤에서 반응 혼합물 (포름 아미드 95 % 포함 + 10 μl RNA로드 버퍼)의 5 μl를로드합니다. autoradiography에 의한 전기 영동 후 절단 제품을 표시합니다.
6. 대표 결과
카스의 endonuclease 활동의 분석을위한 RNA 기판의 예는도 3a에 표시됩니다. 체외 전사 반응에 분석 100 μl의 5 μl의 나누어지는이로드되었습니다. RNA 생산의 효율성이 다른 구조 사이에 차이가 있습니다. 일부 요인 t모자는 전사 개시에 필요한 +1 G, 전사시 RNA 구조 형성 (II) 가능성과 세대에 대한 제한 사이트 (III)의 선택에 따라 아르 얻은 RNA의 양은 (i) 초기 순서에 영향을 관찰했다 실행 - 오프 절단 위치의.
RNA의 endonuclease 활동의 조사는 모두 높은 정화 재조합 카스 단백질 (그림 3B)와 적절한 부정적인 컨트롤을 필요로합니다. 이상적으로,이 부정적인 컨트롤 샘플 조사 카스의 endonuclease 반응에서 가능한 한 조금 다릅니다. 이것은 카스 표현 (및 동일 정화 절차에 따라)없이 반응 버퍼와 세포 lysate와 RNA의 부화에 의해 달성 될 수있다. 이상적인 부정적인 컨트롤은 제안 절단 사이트에서 deoxyribonucleotide 추가 된 것입니다. 그림 3C에서 5 '터미널이라는 반복 시퀀스의 절단은 클로스 트리 디움 thermocellum Cas6에 표시됩니다. 아래의 동일한 조건이 반복 deoxyribonucleotide이 위치 -9에 도입 할 때 더 이상 기판 없습니다. 이 방법은 또한 절단 사이트에 대한 정보를 제공합니다. 마지막으로, 오랜 내부적으로 표시된 사전 crRNA는 Cas6에 의해 흘리고있다 두 개의 절단 조각을 준수하고 있습니다.
CRISPR / 카스 활동의 그림 1. 개략도. 개요 CRISPR 클러스터 (적응), Cas6 endonuclease에 의해 작은 crRNAs에 CRISPR 배열의 전사와 가공, 캐스케이드 단지에 crRNAs의 이해와의 간섭에 바이러스 DNA 시퀀스 (protospacer)의 삽입을 다음과 crRNA와 protospacer 사이 complementarity에 따라 바이러스 공격을 반복했다. Protospacer 인접 모티프 (PAM) 마르크 바이러스 protospacer 시퀀스.
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그림 2. 카스 단백질에 대한 RNA 기판의 세대. 제도는 (A) 긴 사전 crRNA 기판, (B) 중간 사전 crRNA 기판 및 사전 crRNA 생산을위한 (C) 짧은 카스 RNA 기판 창출을위한 워크 플로우를 보여줍니다. 예를 들어 시퀀스는 클로스 트리 디움 thermocellum의 CRISPR 배열에 제공됩니다. 더 큰 그림을 보려면 여기를 클릭하십시오 .
그림 3. Cas6 endonuclease 분석. A.) Toluidine 푸른 스테인드 polyacrylamide의 맞춤 디자인 RNA의 oligonucleotide (250 pmol)의 젤과 체외 RNA 성적 (일반 100 μl 반응의 5 μl)에 둘. 열 후 클로 스트 리듐 thermocellum에서 Cas6 준비 (80 pmol)의 B.) SDS-PAGE 젤1 시간 니켈 NTA 크로마토 그래피에 대한 ° C 50 강수량. 5 '터미널이라는 반복 시퀀스 및 체외 성적에 사전 crRNA에 대한 endonucleolytic Cas6 활동 C.) 감지. 위치 -9에서 dNTP의 도입은 짧은 카스 RNA 기판 (S, 그림. 2C)에 대한 Cas6 절단 시킨다는. 5 '터미널 8 NT 태그는 오래 전 crRNA 기판 (L, 그림. 2A)에서 crRNA의 성숙을 위해 생성됩니다. 밴드는 denaturing 8 M의 우레아 12 % polyacrylamide 젤에서 분리 autoradiography으로 시각화했다.
Discussion
제시 방법은 서로 다른 크기의 범위 카스 endonuclease 기판의 생성을 활성화하고 시퀀스 디자인의 자유를 변화와 함께. 합성 RNA의 oligonucleotide 기판의 생성을위한 가장 스트레이트 포워드 접근 방식은 더 이상 RNA의 oligomers을 만드는 증가 비용과 기술적 한계로 인해 짧은 RNA 디자인으로 제한됩니다. 성공적인 RNA 합성은 100 세포핵 길이의 수정되지 않은 RNA의 oligomers에 대해보고 된 반면, 사용자 정의 RNA 합성을위한 실용적이고 경제적 인 최대 아래 40 세포핵에 자리 잡고 있습니다. 그러나, 주어진 시퀀스는 합성 할 수 있으며 수정 세포핵 (예 : deoxyribonucleotides)의 대상으로 소개 자세히 절단 사이트를 분석하기 위해 이용 될 수 있습니다. 긴 사전 cRNAs는 체외 스크립트에 통해 생성해야합니다.
T7 RNA 중합 효소의 프로모터를 포함 oligonucleotides의 어닐링은 중간 길이 미리 crRN의 생산을 허용있습니다. 정기적으로 그리고 경제적으로 합성 DNA의 oligonucleotides의 최대 길이는 불과 150 세포핵 위에 있으며,이 방법으로 합성 사전 crRNAs의 최대를 나타냅니다. 서로 끈적 끝을 형성 여러 annealed의 DNA oligonucleotide 쌍의 조립이 최대 길이를 연장하지만 구조의 복제에 증가 도전을 필요로 할 수 있습니다. 이 방법의 가장 큰 장점은 원하는 순서로 사전 crRNA 구조 (그리고 그에 카스 endonuclease 기판)를 생성 할 수있는 기능입니다. 이 합성 crRNA 디자인의 테스트를 할 수 있습니다.
마지막으로, 큰 사전 crRNAs는 그 전체 게놈의 CRISPR 요소 또는 분수의 PCR의 amplificates에서 얻을 수 있습니다. 플라스미드 체외 전사 템플릿에 대한 변경은 사전 crRNA 변종의 생성을위한 사이트 이동 mutagenesis를 통해 소개 할 수 있습니다. 이러한 구조는 전체 내에 글로벌 endonucleolytic 절단 패턴을 분석하는 데 사용할 수 있습니다사전 crRNA.
체외 스크립트에서 T7 RNA 중합 효소의를 통해 수정되지 않은 RNA의 생산을위한 선구자 작업은 전송 RNAs 14 brome 모자이크 바이러스 RNA 15 일 기준으로했습니다. 합의 T7 RNA 중합 효소의 프로모터는 인식 도메인 (-5 통해 -17)과 필수 구아노 신 일 16 전사 개시와 개시 도메인 (6를 통해 -4)로 구성되어 있습니다. 하나의 순위 하류는 거의 모든 원하는 RNA 시퀀스의 해독을 허용하는 가변 될 수 있습니다. 체외 실행 - 오프 전사 템플릿에서 생성 제시 방법은 게놈 CRISPR 지역 또는 합성 사전 crRNA 변종과 일치하는 완전한 사전 crRNAs의 체외 합성에 대한 수 있습니다. 전사 반응은 5 '모노 포스페이트 테르 미니 (Termini) 14 얻기 위해 GMP와 중이오하지 않는 한 성적 증명서는 5'-터미널 삼인산 존재와 생성됩니다. 성적표가 표시 될 경우 이러한 테르 미니 (Termini)가 필요합니다T4 폴리 뉴클레오타이드 키나제와 γ-[32 P]-ATP.로 Cas6 및 Cas6 같은 효소의 절단 활동은 5'-수산기와 2 ', 3'-순환 인산염 테르 미니 (Termini)를 포함 crRNA를 생성합니다. 이러한 RNAs는 다음 캐스케이드 복잡한에 의해 인식 분석 할 수 있습니다.
Disclosures
관심 없음 충돌이 선언 없습니다.
Acknowledgments
저자는 재조합 T7 RNA 중합 효소의와 그림 1을 준비에 도움 노르만 Ebelt의 준비를 위해 Schermuly 지넷 감사드립니다. 이 작품은 독일 Forschungsgemeinschaft (DFG FOR1680)과 최대 플랑크 협회에서 기금의 지원을받는되었다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Antarctic Phosphatase | NEB | M0289L | |
| in vitro Transcription Grade Ultrapure Nucleotide Triphosphates | Jena Bioscience | NU-1010 - NU-1013 | |
| Liquid chromatography, ktapurifier 100 | GE Healthcare | ||
| DNA oligonucleotides | MWG Operon | ||
| RNA oligonucleotides | MWG Operon | ||
| Gel Extraction Kit | QIAGEN | 28704 | |
| PCR purification Kit | QIAGEN | 28104 | |
| Spin Miniprep Kit | QIAGEN | 27106 | |
| Plasmid Maxi Kit | QIAGEN | 12163 | |
| BamHI | NEB | R0136L | |
| HindIII | NEB | R0104L | |
| T4 DNA Ligase | NEB | M0202S | |
| T4 Polynucleotide Kinase | Ambion | AM2310 | |
| T7 RNA Polymerase | own preparation | ||
| Deoxynucleotide Solution Mix | NEB | N0447L | |
| Mini-PROTEAN Tetra Electrophoresis System | Bio-Rad | 165-8001 | |
| Storm 840 Scanner | GE Healthcare | 163723 | |
| Storage Phosphorscreen | Molecular Dynamics | 63-0034-81 | |
| Mono Q 5/50 GL | GE Healthcare | 17-5166-01 | |
| Phusion High-Fidelity DNA Polymerase | NEB | M0530L | use the GC buffer |
| Toluidine Blue | Sigma | T3260 | |
| pUC19 | NEB | N3041S | |
| γ-[32P]-ATP, α-[32P]-ATP | Hartmann Analytic | SRP-401, SRP-307 |
References
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