Summary
CRISPR / Cas systèmes médiate immunité adaptative dans les bactéries et les archées. De nombreuses protéines sont proposées Cas d'agir comme endoribonucléases agissant sur les précurseurs crRNA de longueur variable. Ici, nous illustrons trois approches différentes pour générer des pré-crRNA substrats pour l'analyse biochimique de l'activité endonucléase de Cas.
Abstract
L'interaction des virus et leurs hôtes procaryotes façonné l'évolution de la vie bactérienne et Archaea. Les procaryotes développé plusieurs stratégies pour échapper aux attaques virales qui comprennent la modification restriction, infection abortive et CRISPR / Cas des systèmes. Ces systèmes immunitaires adaptatives trouvés dans de nombreuses bactéries et les archées se composent de plus lustré c r i egularly nterspaced s hort p alindromic r EPEAT (CRISPR) et un certain nombre de séquences de C RISPR que sociated (CAS) gènes (Fig. 1) 1-3. Différents ensembles de protéines Cas et répète définir au moins trois grands types divergents de CRISPR / Cas systèmes 4. Les protéines universelles CAS1 et CAS2 sont proposées pour être impliqués dans l'absorption de l'ADN viral quigénère un nouveau élément d'écartement entre deux répétitions à l'extrémité 5 'd'une grappe CRISPR s'étendant 5. L'ensemble du cluster est transcrit en un précurseur contenant tous crRNA-entretoise et des séquences répétées et est ensuite traité par une enzyme de la famille diversifiée Cas6 en petits crRNAs 6-8. Ces crRNAs constitués de la séquence flanquée par une entretoise 5 'terminale (8 nucléotides) et une région 3' terminale variable dérivée de la séquence répétée 9. Une infection répétée du virus peuvent maintenant être bloqué comme la nouvelle crRNA sera dirigé par un complexe protéique Cas (Cascade) à l'ADN viral et l'identifier comme tel via 10 la complémentarité de base. Enfin, pour CRISPR / Cas des systèmes de type 1, le CAS3 nucléase va détruire l'envahisseur détecté l'ADN 11,12.
Ces processus définissent CRISPR / Cas en tant que système immunitaire adaptatif des procaryotes et a ouvert un domaine de recherche fascinant pour l'étude des protéines impliquées Cas.La fonction d'un grand nombre de protéines Cas est toujours insaisissable et les causes de la diversité apparente des systèmes CRISPR / Cas restent à éclairer. Les activités potentielles de la plupart des protéines ont été prédites par Cas des analyses détaillées de calcul. Une fraction importante de protéines Cas sont soit montré ou proposé à fonctionner comme endonucléases 4.
Ici, nous présentons les méthodes pour générer des précurseurs et crRNAs-ARNc pour l'étude de Cas endoribonucléases. Dosages différents exigent des endonucléases de séquences répétées courtes soit qui peuvent être directement synthétisés comme oligonucléotides d'ARN ou des séquences plus crRNA et pré-crRNA qui sont générés in vitro par l'ARN polymérase T7 de ruissellement de la transcription. Cette méthodologie permet l'incorporation de nucléotides radioactifs pour la production de substrats marqués endonucléase interne et la création de crRNAs synthétiques ou mutant. Cas6 activité endonucléase est utilisé pour mûrir pré-crRNAs en crRNAs avec 5'-hydroxyle et un 2 ', 3'-terminales phosphate cyclique.
Protocol
1. Génération de longue pré-crRNA substrats par PCR
- Conception des amorces de PCR ciblant les régions d'espacement d'un cluster CRISPR. Ajouter l'ARN polymérase T7 séquence promotrice (T7RNAP) (5 '-taatacgactcactata-3') de l'amorce sens et des sites de restriction pour le clonage du produit de PCR dans un vecteur à deux amorces (par exemple BamHI et HindIII pour pUC19, Fig. 2A) .
Remarque: Le T7RNAP nécessite un résidu guanidine pour l'initiation de la transcription correcte. - Amplifier votre pré-crRNA séquence d'intérêt à partir de l'ADN génomique par PCR.
- Séparer les produits de PCR sur gel d'agarose par électrophorèse sur gel et extraire la bande désirée. Digérer le produit de PCR par les enzymes de restriction pour créer des extrémités cohésives (par exemple BamHI et HindIII, Fig. 2A). Purifiez votre produit PCR avec un kit de purification PCR pour éliminer les sous-produits de clivage.
- Mettre en place une réaction de ligature qui contient l'ADN ligase T4, T4 tampon de ligase d'ADN etun rapport molaire de 3:1 du produit clivé par PCR et le vecteur déphosphorylé linéaire correspondant pUC avec des extrémités cohésives. Incuber le mélange à 16 ° C pendant la nuit. Transformer le mélange de ligation dans des cellules compétentes d'Escherichia coli DH5a par des protocoles standard et utiliser le bleu blanc de dépistage pour identifier ligature réussie.
- Isoler plasmides des colonies blanches en utilisant un kit de préparation de plasmide. Identifier les clones positifs par séquençage du plasmide. Alternativement, une PCR sur colonie pourrait être utilisé pour le dépistage.
2. Génération de pré-intermédiaire crRNA substrats par l'intermédiaire d'un recuit d'oligonucléotides d'ADN
- Concevoir avant et arrière oligonucléotides avec le CRISPR répétition / entretoise séquence désirée. Les oligonucléotides contiennent la séquence d'un promoteur T7 RNAP ainsi que des sites de restriction terminaux (par exemple BamHI et HindIII pour pUC19). Terminer les oligonucléotides assurer que le formulaire collant se termine après recuit (voir Fig. 2B
- 5'-phosphoryle 1 nmol de chaque oligonucléotide dans une réaction séparée contenant 5 pi 20 pi de T4 polynucléotide kinase (PNK), 2 pl de tampon T4 PNK 10x, 2 pl ATP (10 mM). Incuber chaque échantillon pendant 1 heure à 37 ° C.
- L'hybridation des deux oligonucléotides phosphorylés. Mélanger 1 ul du mélange oligo phosphorylée avant (de 2,2.), 1 pl du mélange d'oligo inverse phosphorylée (de 2,2.), 1 pl de tampon ligase d'ADN T4 10x dans une réaction de 10 ul. Incuber les échantillons pendant 5 min à 95 ° C sur un bloc chauffant ou dans l'eau bouillante, éteignez la source de chaleur et laisser le mélange refroidir à température ambiante (~ 2-3 heures).
Remarque: Dans cette étape critique, le refroidissement lent favorise le recuit des deux oligonucléotides par rapport à la formation de structures à l'intérieur de chaque oligonucléotide simple. - Ligaturer 4 pl du mélange d'hybridation, 1 microlitre de vecteur pUC digéré et déphosphorylé (0,1 pg /ul) avec l'ADN ligase T4, T4 ADN ligase tampon 10x et 10 mM d'ATP dans un mélange de 20 ligature ul. Incuber l'échantillon à 16 ° C pendant la nuit.
- Transformer les plasmides ligaturés dans des cellules compétentes d'Escherichia coli DH5a par des protocoles standard et utiliser dépistage bleu blanc. Isoler et identifier les plasmides des clones positifs par digestion (pour cribler pour des inserts de la taille désirée) et le séquençage du plasmide ultérieur.
3. Génération de courte substrats ARN Cas via la synthèse à façon d'oligonucléotides ARN
Conception court Cas ARN substrats (par exemple, des séquences répétitives simples, Fig. 2C) et d'utiliser les installations personnalisées d'ARN de synthèse d'oligonucléotides.
Remarque: L'inclusion d'un désoxyribonucléotide à une position spécifiée d'un oligonucléotide d'ARN (Fig. 2C) peut être utilisé pour localiser le site de clivage de l'ARN.
4. T in vitro7 transcription ARN polymérase
- Isoler plasmides avec votre concept conçu (à partir de 1.9. Ou 2.7.) En utilisant un kit de purification de plasmide maxiprep.
- Linéariser le plasmide avec l'enzyme de restriction qui clive en aval du fragment cloné (par exemple HindIII). Assurer une digestion complète.
Remarque: Si un 3 divergent délimité 'de l'ARN transcrit est souhaitée, la construction conçu doit contenir un site de restriction spécifique supplémentaire pour "run-off" de la transcription en amont de la séquence HindIII. - Purifier le plasmide linéarisé par phénol: chloroforme (1:1) et l'extraction de précipitation à l'éthanol. Récupérer les acides nucléiques en remettant en suspension le culot dans de l'eau stérile traitée au DEPC.
- Mettre en place un embryon in vitro T7 ARNP ruissellement mélange de transcription qui contient 40 mM de HEPES / KOH (pH 8), 22 mM MgCl2, 5 mM de dithiothréitol, 1 spermidine mm, 4 mm de chaque nucléoside triphosphate (ATP, CTP, GTP, UTP ), 40-100 pg / ml de digéréPlasmides et 0,1 mg / ml T7 RNAP dans l'eau traitée au DEPC. Incuber pendant 3 heures à 37 ° C.
- Analyser les relevés de notes obtenus ARN sur un gel dénaturant de polyacrylamide 8 M d'urée 12% (figure 3A). Les transcrits d'ARN peut être purifié par Mono Q chromatographie échangeuse d'anions 13 et récupéré par précipitation à l'éthanol des fractions d'ARN et de remise en suspension du culot dans de l'eau DEPC stérile traité. Pour une utilisation ultérieure, conservez l'ARN à -80 ° C.
5. Cas6 test endonucléase
- Mettre en place un 20 ul in vitro T7 ARNP ruissellement mélange de transcription (voir 4.4) qui contient une quantité réduite de 2 mM d'ATP et est complété avec 2,5 ul-α [32 P] ATP (10 mCi / ml, 5000 Ci / mmol). Purifier les produits de réaction par extraction sur gel dénaturant à partir d'un gel d'urée 8 M polyacrylamide à 12%. Visualiser les bandes par autoradiographie.
- Produire et purifier les protéines recombinantes souhaitées Cas. Dans cet exemple, CAS6 de Clostridium thermocellum a été purifié par précipitations et la chaleur Ni-NTA chromatographie.
- Mettre en place une réaction de dosage endonucléase (par exemple pour Clostridium thermocellum Cas6, le mélange réactionnel contient 20 mM de HEPES (pH 8 KOH), 250 mM de KCl, 2 mM MgCl2, 1 mM DTT, 12 000 cpm ARN substrat et 1 uM enzyme et a été incubé à 37 ° C pendant 30 min).
- Chargez 5 ul du mélange réactionnel (+ 10 pl de tampon de chargement ARN contenant 95% de formamide) sur un gel de polyacrylamide 8 M d'urée 12%. Visualisez les produits de clivage après électrophorèse par autoradiographie.
6. Les résultats représentatifs
Un exemple de l'ARN substrats pour l'analyse de l'activité endonucléase Cas est montré sur la figure 3A. Une aliquote de 5 ul d'une analyse 100 pi réaction de transcription in vitro ont été chargés. S'il vous plaît noter que l'efficacité de la production d'ARN varie entre différentes constructions. Certains facteurs tchapeau ont été observés pour influencer la quantité d'ARN obtenus sont (i) la séquence initiale à la suite de la G +1 requis pour l'initiation de la transcription, (ii) la possibilité de formation de structure de l'ARN lors de la transcription et (iii) le choix du site de restriction pour la génération de la position de coupure d'écoulement.
L'enquête sur l'activité endonucléase ARN exige à la fois hautement purifiée de protéines recombinantes Cas (Fig. 3B) et des contrôles appropriés négatifs. Idéalement, cet échantillon de contrôle négatif diffère aussi peu que possible de la réaction endonucléase Cas d'une enquête. Ceci peut être obtenu par incubation de l'ARN avec un tampon de réaction et la cellule-lysat sans Cas expression (et la suite de la procédure de purification identique). Un contrôle négatif idéal est l'ajout d'un désoxyribonucléotide au niveau du site de clivage proposé. La figure 3C, le clivage d'une séquence 5 'terminale de répétition marqué est représenté à Clostridium thermocellum Cas6. Sous des conditions identiques, cette répétition n'est pas un substrat plus quand un désoxyribonucléotide est introduit en position -9. Cette méthode fournit également des informations sur le site de clivage. Enfin, une longue interne étiquetés pré-crRNA est clivée par Cas6 et deux fragments de clivage sont respectées.
Figure 1. Vue d'ensemble schématique de CRISPR / Cas activité. La description ci-après l'insertion d'une séquence d'ADN viral (protospacer) dans le groupe CRISPR (adaptation), la transcription et la transformation de la matrice de petites CRISPR dans crRNAs par une endonucléase de Cas6, l'absorption de crRNAs dans le complexe en cascade et le brouillage d'un répétée attaque virale basée sur la complémentarité entre crRNA et protospacer. Protospacer motifs adjacents (PAM) des séquences virales marque protospacer.
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Figure 2. Génération de l'ARN substrats des protéines Cas. Le schéma montre le flux de travail pour produire (A) de longueur pré-crRNA substrats, (B) intermédiaire de pré-crRNA substrats et (C) Cas court ARN substrats pour pré-crRNA production. Exemple des séquences sont présentés pour l'ensemble CRISPR de Clostridium thermocellum. Cliquez ici pour agrandir la figure .
Figure 3. Cas6 test endonucléase. A.) Toluidine gel de polyacrylamide bleu teinté d'un oligonucléotide conçu sur mesure ARN (250 pmol) et deux ARN in vitro transcriptions (5 pi d'un type de réaction 100 pi). B.) gel SDS-PAGE d'une préparation Cas6 (80 pmol) de Clostridium thermocellum après la chaleurprécipitation à 50 ° C pendant 1 heure et chromatographie Ni-NTA. C) La détection de endonucléolytique Cas6 activité 5 'terminale des séquences répétées étiquetés et pré-crRNA transcrits in vitro. L'introduction d'un dNTP à position -9 abolit Cas6 clivage d'un substrat à court Cas ARN (S, fig. 2C). A 5 'terminal 8 tag nt est également généré pour la maturation crRNA de longue pré-crRNA substrats (L, Fig. 2A). Les bandes ont été séparés sur un gel dénaturant 8 M d'urée 12% de polyacrylamide et visualisés par autoradiographie.
Discussion
Les méthodes présentées permettent la génération de substrats endonucléase SAE de gammes de tailles différentes et avec plus ou moins de liberté dans la conception de séquence. L'approche la plus straight-forward pour la génération de substrats synthétiques d'oligonucléotides d'ARN est limitée à de courtes créations d'ARN en raison de l'augmentation des coûts et des limitations techniques dans la création de plus oligomères d'ARN. Bien réussir la synthèse d'ARN a été rapportée pour les oligomères d'ARN non modifiés de plus de 100 nucléotides de longueur, le maximum pratique et économique pour l'ARN de synthèse sur mesure est inférieure à 40 nucléotides. Cependant, toute séquence donnée peut être synthétisé et l'introduction ciblée de nucléotides modifiés (par exemple désoxyribonucléotides) peut être utilisé pour analyser des sites de clivage dans le détail. Plus pré-ARNc doit être généré par transcription in vitro.
Le recuit d'oligonucléotides qui contiennent un promoteur de T7 ARN polymérase permet la production d'une longueur intermédiaire de pré-CRRNComme. La longueur maximale de routine et économiquement oligonucléotides d'ADN synthétisés se trouve au-dessus de 150 nucléotides et représente le maximum de pré-synthèse crRNAs par cette méthode. L'assemblage de plusieurs paires d'oligonucléotides d'ADN recuit qui forment des extrémités cohésives avec l'autre peut étendre cette durée maximale, mais nécessite des défis croissants dans le clonage de la construction. Le principal avantage de cette méthode est sa capacité à générer des pré-crRNA constructions (et donc Cas endonucléase de substrats) avec un ordre quelconque. Ceci permet à l'essai de prototypes de crRNA synthétiques.
Enfin, les grandes pré-crRNAs peut être obtenu à partir de produits d'amplification PCR des éléments entiers CRISPR génomiques ou en fractions. Des altérations de la transcription in vitro dans le modèle plasmide peut être introduit par mutagénèse dirigée pour la génération de pré-crRNA variantes. Ces constructions peuvent être utilisées pour analyser le motif de clivage mondial endonucléolytique au sein d'un ensemblepré-crRNA.
Le travail de pionnier pour la production d'ARN non modifié par l'ARN polymérase T7 transcription in vitro a été basée sur 14 ARN de transfert et ARN virus de la mosaïque du brome 15. Le promoteur consensus T7 ARN polymérase est constituée d'un domaine de reconnaissance (-17 à travers -5) et un domaine d'initiation (-4 à travers +6) avec initiation de la transcription à une guanosine essentiel +1 16. En aval des postes de +1 peut être variée qui permet la transcription de presque toute séquence d'ARN désiré. Les méthodes présentées pour générer des modèles de transcription in vitro de ruissellement pour permettre la synthèse in vitro de pré-complets qui correspondent à des régions crRNAs CRISPR génomique ou synthétique pré-crRNA variantes. Les transcrits sont générés en présence d'un triphosphate 5'-terminale à moins que la réaction de transcription est amorcée avec GMP pour obtenir 5 'monophosphate extrémités 14. Ces terminaisons sont nécessaires si les relevés de notes doivent être étiquetésla T4 polynucléotide kinase et γ-[32P]-ATP. Activité de clivage de Cas6 et Cas6 enzymes analogues génère crRNA qui contiennent 5'-hydroxyle et un 2 ', 3'-phosphate extrémités cycliques. Ces ARN peuvent ensuite être analysées pour la reconnaissance par le complexe Cascade.
Disclosures
Aucun conflit d'intérêt déclaré.
Acknowledgments
Les auteurs tiennent à remercier Jeanette Schermuly pour la préparation de recombinaison ARN polymérase T7 et Ebelt Norman pour l'assistance dans la préparation de la figure 1. Ce travail a été financé par des fonds de la Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG FOR1680) et la Société Max Planck.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Antarctic Phosphatase | NEB | M0289L | |
| in vitro Transcription Grade Ultrapure Nucleotide Triphosphates | Jena Bioscience | NU-1010 - NU-1013 | |
| Liquid chromatography, ktapurifier 100 | GE Healthcare | ||
| DNA oligonucleotides | MWG Operon | ||
| RNA oligonucleotides | MWG Operon | ||
| Gel Extraction Kit | QIAGEN | 28704 | |
| PCR purification Kit | QIAGEN | 28104 | |
| Spin Miniprep Kit | QIAGEN | 27106 | |
| Plasmid Maxi Kit | QIAGEN | 12163 | |
| BamHI | NEB | R0136L | |
| HindIII | NEB | R0104L | |
| T4 DNA Ligase | NEB | M0202S | |
| T4 Polynucleotide Kinase | Ambion | AM2310 | |
| T7 RNA Polymerase | own preparation | ||
| Deoxynucleotide Solution Mix | NEB | N0447L | |
| Mini-PROTEAN Tetra Electrophoresis System | Bio-Rad | 165-8001 | |
| Storm 840 Scanner | GE Healthcare | 163723 | |
| Storage Phosphorscreen | Molecular Dynamics | 63-0034-81 | |
| Mono Q 5/50 GL | GE Healthcare | 17-5166-01 | |
| Phusion High-Fidelity DNA Polymerase | NEB | M0530L | use the GC buffer |
| Toluidine Blue | Sigma | T3260 | |
| pUC19 | NEB | N3041S | |
| γ-[32P]-ATP, α-[32P]-ATP | Hartmann Analytic | SRP-401, SRP-307 |
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