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Bioengineering

एक murine मॉडल में आंत का ऊतक इंजीनियरिंग

Published: December 1, 2012 doi: 10.3791/4279
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 1
1Children's Hospital Los Angeles, Division of Pediatric Surgery, Saban Research Institute, Keck School of Medicine of the University of Southern California

Summary

यह लेख और साथ वीडियो माउस में ऊतक इंजीनियर आंत पैदा करने के लिए हमारे प्रोटोकॉल उपस्थित थे, एक organoid दृष्टिकोण इकाइयों पर पाड़ का उपयोग.

Abstract

ऊतक इंजीनियर छोटी आंत (TESI) सफलतापूर्वक करने के लिए बड़े पैमाने पर छोटे आंत्र लकीर के बाद लुईस चूहों बचाव, preoperative वजन करने के लिए बदले में 40 दिनों के भीतर उत्पन्न करने के लिए इस्तेमाल किया गया है 1 मनुष्यों में, बड़े पैमाने पर छोटे आंत्र लकीर कम आंत्र सिंड्रोम, एक कार्यात्मक malabsorptive में परिणाम कर सकते हैं. राज्य है कि महत्वपूर्ण रुग्णता, मृत्यु दर, और parenteral पोषण निर्भरता, जिगर की विफलता और सिरोसिस, और multivisceral अंग प्रत्यारोपण के लिए की जरूरत है इस पत्र में 2. सहित स्वास्थ्य देखभाल की लागत प्रदान, हम का वर्णन है और एक माउस मॉडल में ऊतक इंजीनियर आंत बनाने के लिए हमारे प्रोटोकॉल दस्तावेज़ एक बहुकोशिकीय organoid दृष्टिकोण इकाइयों पर पाड़ के साथ. Organoid इकाइयों multicellular आंत से प्राप्त समुच्चय है, कि दोनों mucosal और mesenchymal तत्व होते हैं 3 संबंध इन्टेस्टाइनल स्टेम सेल के बीच जो आला बरकरार रखता है में चल रही है और भविष्य के अनुसंधान में हमारी तकनीक का संक्रमण 4.माउस ट्रांसजेनिक इस प्रजाति में उपलब्ध उपकरणों का उपयोग करके TESI गठन के दौरान शामिल प्रक्रियाओं की जांच के लिए अनुमति 5 immunocompromised माउस उपभेदों की उपलब्धता भी हमें मानव आंत्र ऊतक के लिए तकनीक को लागू करने के लिए और एक रूप में मानव TESI के गठन का अनुकूलन की अनुमति देगा. मनुष्यों में इसके संक्रमण से पहले माउस xenograft. हमारा तरीका अच्छा विनिर्माण अभ्यास (जीएमपी) अभिकर्मकों और सामग्री है कि पहले से ही मानव रोगियों में उपयोग के लिए अनुमोदित किया गया है, और इसलिए दृष्टिकोण है कि decellularized पशु ऊतकों पर भरोसा करते हैं पर एक महत्वपूर्ण लाभ प्रदान करता है कार्यरत हैं. इस विधि का अंतिम लक्ष्य एक पुनर्योजी दवा कम आंत्र सिंड्रोम के लिए चिकित्सकीय रणनीति के रूप में मनुष्य के लिए अनुवाद है.

Protocol

1. Organoid इकाइयों तैयारी

  1. माउस विच्छेदन (कैंची और संदंश) के लिए उपयुक्त उपकरण आटोक्लेव द्वारा निष्फल किया जाना चाहिए.
  2. Humanely स्थानीय IACUC प्रोटोकॉल के लिए अनुसार दाता माउस euthanize. सुनिश्चित करें कि आगे बढ़ने से पहले पशु मर चुका है.
  3. Peritoneal गुहा तक पहुंच हासिल करने के लिए एक midline चीरा बनाओ. त्वचा flaps परिलक्षित किया जा सकता है के रूप में करने के लिए जोखिम में सुधार की जरूरत है.
  4. छोटी आंत अंतड़ी निकालना और यह विभाजन सिर्फ Treitz के बंधन को बाहर. अपने के तेज और कोमल कुंद विच्छेदन का उपयोग अन्त्रपेशी से छोटी आंत को अलग करें. Ileocecal जंक्शन पहचानें और छोटी आंत 5 मिमी यह करने के लिए समीपस्थ विभाजित.
  5. कैंची का प्रयोग, आंत लंबाई antimesenteric सीमा के साथ एक पेट्री डिश में 10 मिलीलीटर 4 ° C बाँझ हैंक्स buffered खारा (HbSS, Invitrogen, Carlsbad CA) / 1X एंटीबायोटिक रोधी (एंटी विरोधी Invitrogen) खोलने के लिए समाधान. खोला आंत से fecal बात साफ़कोमल आंदोलन तो 10 मिलीलीटर की 4 डिग्री सेल्सियस, बाँझ HbSS / 1X विरोधी विरोधी के साथ एक 15ml अपकेंद्रित्र ट्यूब खोला आंत हस्तांतरण.
  6. खोला आंत 4 की 10 मिलीलीटर में तीन बार धोएं डिग्री सेल्सियस, बाँझ HbSS / 1X एक टेस्ट ट्यूब में विरोधी विरोधी. प्रत्येक धोने के 30 सेकंड के लिए 15 मिलीलीटर ट्यूब के हल्के झटकों के साथ किया जा सकता है. मिलाने के बाद, आंतों ऊतक ट्यूब के नीचे डूब. अस्थायी सामग्री, जो mesenchymal मलबे है त्यागें. धोने समाधान ध्यान से निकालें एक pipet साथ.
  7. 4 की 10 मिलीलीटर के साथ एक पेट्री डिश में धोया आंत क़ीमा डिग्री सेल्सियस, बाँझ HbSS / 1X कम से कम 1 मिमी वर्ग एक कैंची का उपयोग टुकड़े करने के लिए विरोधी विरोधी. कीमा बनाया हुआ सामग्री इकट्ठा एक स्वचालित pipet के साथ और यह एक टेस्ट ट्यूब में जगह.
  8. 8 मिनट के लिए 500 rpm पर अपकेंद्रित्र ट्यूब. तैरनेवाला, जो वसा और mesenchyme शामिल त्यागें.
  9. बाँझ HbSS / 1X विरोधी विरोधी प्लस 0.125 मिलीग्राम / मिलीलीटर dispase (Invitrogen) और 800 इकाइयों / m 10 मिलीलीटर के साथ कीमा बनाया हुआ, धोया सामग्री को पचानेएल कोलैजिनेज टाइप 1 (Worthington, Lakewood NJ). पाचन समाधान के 40 मिलीलीटर तैयार करने के लिए, बाहर dispase, कोलैजिनेज की 142 मिलीग्राम की 5 मिलीग्राम तौलना, और बाँझ HbSS 40 मिलीलीटर की मात्रा को जोड़ने के. इस समाधान तैयार हौसले हर बार organoid इकाइयों को तैयार कर रहे हैं, और 4 डिग्री पर जब तक सी के लिए उपयोग करने के लिए तैयार रहते हैं. 1.8 कदम से पाचन सीधे गोली का हल जोड़ें.
  10. परीक्षण 37 डिग्री सेल्सियस पर 20 मिनट के लिए पाचन समाधान के साथ कीमा बनाया हुआ, धोया सामग्री युक्त ट्यूब सेते हैं.
  11. टेस्ट ट्यूब निकालें और आगे विचूर्णन द्वारा एक 10 मिलीलीटर pipet के साथ पचा ऊतक को बाधित. 20 से 50 गुना के बीच दोहराएँ जब तक एक समान रूप प्राप्त की है.
  12. 800 rpm पर 5 मिनट के लिए टेस्ट ट्यूब अपकेंद्रित्र. तैरनेवाला, जिसमें एकल कक्षों त्यागें.
  13. 4 ° सी, बाँझ Dulbecco संशोधित ईगल (DMEM, Invitrogen) मध्यम प्लस 10% v / v गर्मी निष्क्रिय भ्रूण गोजातीय सीरम (HI FBS, Invitrogen) के 10 मिलीलीटर के साथ पाचन प्रतिक्रिया रोकें. पेले Resuspendटी और ट्यूब हिला.
  14. 800 rpm पर 5 मिनट के लिए टेस्ट ट्यूब अपकेंद्रित्र. पिछले कुछ बूँदें जब तक एक स्वचालित pipet के साथ सतह पर तैरनेवाला ध्यान निकालें. पिछले कुछ बूंदों के लिए एक डिस्पोजेबल प्लास्टिक pipet प्रयोग गोली resuspending से बचने के.

2. Polyglycolic एसिड पाड़ की लोड हो रहा है

  1. के रूप में रेफरी में वर्णित है, फार्म 2 मिमी लंबे, nonwoven polyglycolic एसिड (porosity> 95%, Concordia फाइबर, कोवेन्ट्रीय आरआई 2 मिमी शीट मोटाई, 60 मिलीग्राम थोक सेमी-3 घनत्व) से 5 मिमी बाहरी व्यास बेलनाकार scaffolds. 4.
  2. एक डिस्पोजेबल 1,000 microliter आसुत जल में 70% इथेनॉल के साथ तैयार कैंची के साथ टिप pipet के बाहर 2 मिमी छाँटो.
  3. एक संस्कृति 4 अच्छी तरह से थाली में पाड़ रखें. 1000 microliter pipet साथ पाड़ पर organoid इकाइयों लुमेन में पहले तो और बाहरी सतह पर लोड. एक संदंश प्रयोग लुमेन की कोटिंग सुनिश्चित. को बाधित खुला बहुलक का बेलनाकार आकार को तोड़ने या नहीं.

    3. मेजबान माउस में आरोपण

    1. दाता यदि उपलब्ध के रूप में एक ही पृष्ठभूमि पर एक syngeneic मेजबान माउस का प्रयोग करें. अन्यथा, एक immunocompromised nonobese / गंभीर immunodeficient संयुक्त या इशारा / SCID जानवर (जैक्सन प्रयोगशालाओं, Sacramento CA) मधुमेह रोजगार.
    2. Isoflurane साथ सामान्य संज्ञाहरण प्रेरित. दाढ़ी, तैयार करने और माउस पेट टांगना.
    3. 5 मिमी midline peritoneal गुहा में प्रवेश हासिल करने चीरा बनाओ. पहचानें और ध्यान से अधिक से अधिक omentum अंतड़ी निकालना. Omentum पर लोड बहुलक प्लेस और यह ऊतक के साथ लपेट. Omentum आँसू नहीं.
    4. Omentum एक 5-0 monocryl सीवन के साथ बहुलक सुरक्षित. धीरे से अपनी शारीरिक स्थिति में लिपटे बहुलक के साथ omentum की जगह.
    5. 4-0 vicryl sutures का उपयोग परतों में पेट चीरा. मांसपेशी बंद करने को चलाने के लिए और देखभाल करने के लिए चीरा नीचे उदरांग घायल नहीं. त्वचा के लिए बाधित sutures का प्रयोग करें.
    6. बाँझ पानी में 2 मिलीग्राम / किग्रा ketoprofen (Ketofen, किले Dodge पशु स्वास्थ्य) के साथ एक चमड़े के नीचे चीरा के निकट खान के रूप में पश्चात analgesia प्रशासन. पशु दैनिक मूल्यांकन किया जाना चाहिए और अगर जानवर दर्द या संकट के लक्षण का प्रदर्शन है, ketoprofen की एक अतिरिक्त खुराक पोस्ट ऑपरेटिव दो दिन दिलाई जा सकती है. पश्चात तीसरे दिन तक, पशु दर्द या संकट के सबूत के बिना पूरी तरह से बरामद किया जा चाहिए. अगर दर्द या संकट पोस्ट ऑपरेटिव 3 दिन पर जारी है, इस असामान्य माना जाता है और IACUC और जानवरों की देखभाल की सुविधा प्रोटोकॉल के अनुसार में संबोधित किया जाना चाहिए.
    7. स्वस्थ हो जाना करने के लिए माउस और ऊतक इंजीनियर आंत चार सप्ताह के लिए विकसित करने के लिए अनुमति दें. पशु यथेच्छ कृंतक चाउ (लैब 5001 आहार, PMI पोषण, सेंट लुइस MO) और प्रति Septra 5 मिलीग्राम (हैटेक Pharmacal, Amityville NY) में 1:100 कमजोर पड़ने 200/40 मिलीग्राम मिलीग्राम के साथ पानी के लिए पहुँच दे.

    4. फसल

    1. ह्यूमाNely आरोपण के बाद चार सप्ताह मेजबान जानवर euthanize.
    2. मूल चीरा फिर से खोलना और त्वचा को प्रतिबिंबित peritoneal गुहा के लिए उपयोग की सुविधा के सिर की ओर.
    3. मांसपेशियों की परत को खोलें और ऊतक के एक दुनिया के रूप में ऊतक इंजीनियर का निर्माण की पहचान.
    4. Intraabdominal आंत से का निर्माण तेज विच्छेदन का उपयोग करने के लिए नीचे adhesions ले लो.
    5. बाद में बढ़ते आयल के लिए formalin में फिक्स का निर्माण, या वास्तविक समय पीसीआर या प्रोटीन अलगाव के रूप में जैव रासायनिक assays के लिए नए सिरे से ऊतक का उपयोग करें.

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Representative Results

चित्रा 1 यहाँ प्रलेखित प्रोटोकॉल के लिए एक समग्र स्कीमा से पता चलता है. इस प्रोटोकॉल के अंत परिणाम ऊतक इंजीनियर murine आंत के लुमेन, mucosa, submucosa, और पेशीकला 2A चित्रा. आसपास शुरू बहुलक पाड़. चित्रा 2B की तुलना में एक ठेठ दुनिया से पता चलता है के साथ दुनिया भर में या गोलाकार संरचना है उसी का निर्माण प्रदर्शित करता है तेजी से करने के लिए अपने लुमेन प्रकट चित्रा 3 bivalved एक आयल घुड़सवार / hematoxylin लाल भामसान रंग से सना हुआ ऊष्मायन के 4 हफ्तों के बाद एक ठेठ सफल निर्माण के पार अनुभाग को दर्शाता है. रेफरी में. 4, हम ऊतक इंजीनियर आंत के सफलतापूर्वक 89% (44 प्रत्यारोपण के बाहर 39) का उत्पादन करने में सक्षम थे.

एक असफल निर्माण में जो कोई mucosa रूपों है. यह फसल पर सकल उपस्थिति है कि दुनिया अंतिम histologic विश्लेषण पर mucosa होगा पर आधारित न्यायाधीश असंभव है. इसलिए अगर जैव रासायनिक assays performe हैंताजा का निर्माण ऊतक पर, प्रत्येक दुनिया के आधे से तय किया जाना चाहिए आयल histologic विश्लेषण के लिए मुहिम शुरू की पुष्टि करने के लिए कि mucosa प्रत्येक नमूने में मौजूद है. एक असफल निर्माण ही और / hematoxylin लाल भामसान रंग धुंधला हो जाना पर stroma फाइब्रोसिस प्रदर्शन करेंगे.

चित्रा 1
चित्रा 1 ऊतक इंजीनियर माउस में आंत के उत्पादन के लिए स्कीमा. संक्षेप में, दाता ऊतक काटा और organoid इकाइयों में संसाधित. एक झरझरा polyglycolic एसिड पाड़, जो फिर एक मेजबान में प्रत्यारोपित किया जाता है और 4 सप्ताह के लिए सेते हैं की अनुमति पर organoid इकाइयों लोड कर रहे हैं. इंजीनियर का निर्माण तो लिया गया है और ऊतक विज्ञान या जैव रासायनिक assays के माध्यम से लक्षण वर्णन किया जा सकता है.

चित्रा 2
चित्रा 2 ऊतक इंजीनियर आंत का उदाहरण. 4 सप्ताह में काटा निर्माण. एक: कंपनियों में निर्माणबहुलक पाड़ शुरू करने के लिए Rison. बी: एक ही निर्माण, अपने लुमेन प्रकट bivalved.

चित्रा 3
चित्रा 3 एक ठेठ सफल आंत ऊतक इंजीनियर निर्माण के कम बिजली / hematoxylin लाल भामसान रंग माइक्रोग्राफ. लेबल और तीर आंत्र mucosa लुमेन और पक्षपाती मेजबान अग्न्याशय का संकेत मिलता है.

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Discussion

हम माउस में ऊतक इंजीनियर आंत का उत्पादन एक organoid दृष्टिकोण इकाइयों पर पाड़ का उपयोग करने के लिए एक प्रोटोकॉल उपस्थित. सबसे महत्वपूर्ण कदम है organoid इकाइयों की तैयारी के उन हैं. देखभाल करने के लिए पर्याप्त रूप से साफ और यंत्रवत् ऊतक की प्रक्रिया के लिए लिया जाना चाहिए, लेकिन बराबर देखभाल करने के लिए नहीं overdigest या organoid इकाइयों overtriturate लिया जाना चाहिए पाचन के बाद किया जाता है (1.11 कदम). यदि ऐसा किया जाता, organoid इकाइयों एकल कक्षों है जो 1.12 कदम की सतह पर तैरनेवाला में खो दिया जा सकता है के लिए कम किया जा सकता है, और जीवित रहने लिए ऊतक इंजीनियर आंत का उत्पादन करने के लिए की संभावना नहीं हैं, इन्टेस्टाइनल स्टेम सेल आला के रूप में इस में संरक्षित नहीं होगा मामले.

माउस के छोटे आकार यह सीधे का निर्माण ऊतक इंजीनियर मेजबान पशु आंत के दो भागों का आपस में मिलाना vivo में समारोह का परीक्षण करने के लिए चुनौतीपूर्ण बनाता है. वैकल्पिक रूप से, चूहे TESI विकास के लिए एक बड़ा मॉडल कि vivo शाखामिलनता में सुविधा का प्रतिनिधित्व करता है औरपहले से ही यह एक कारण के लिए प्रदर्शन किया गया है. फिर भी, माउस के आकार के एक अजेय बाधा नहीं है, के रूप में दूसरों को इन जानवरों में छोटी आंत लकीर और सम्मिलन, 6 या anorectal सर्जरी, 7 प्रदर्शन करने में सक्षम हो गया है. इन मुद्दों प्रयोगों, पता करने के लिए इन विट्रो फैशन में एक में हमारे ऊतक इंजीनियर आंत्र constructs के समारोह विशेषताएँ चल रहे हैं. इस तकनीक के लिए अतिरिक्त सीमाएं 4 TESI की पीढ़ी में एक 89% सफलता दर शामिल हैं. यही कारण है, कहां लोड scaffolds के 89% सफलतापूर्वक TESI उत्पन्न होगा. दूसरों के द्वारा इस तकनीक का आवेदन परिष्कृत करने के लिए और यह 100% करने के लिए कुल उपज में वृद्धि तकनीक में सुधार में मदद मिल सकती है. इसके अलावा, इस तकनीक अगर कुल ऊतक उत्पन्न मास बढ़ा जा सकता है सुधार किया जा सकता है. वर्तमान में, प्रवाह cytometry दिखा दिया है कि harvested TESI निर्माण में मौजूद कोशिकाओं की कुल संख्या 3 गुना संख्या वर्तमान में आरोपण से अधिक है(3.07 10 x 0.5 ± 6 10 x 6) 4. TESI उत्पादन की मात्रा में सुधार उपचार के लिए अनुवाद की ओर एक महत्वपूर्ण कदम है.

हम यह भी ध्यान दें कि माउस आंत, बहुत पतली दीवारों और छोटे कैलिबर के किया जा रहा है, विशेष रूप से सूअर या चूहे के रूप में की है कि अन्य प्रजातियों की तुलना में कार्रवाई करने के लिए आसान है. मनुष्यों में, हम उम्मीद करते हैं कि कुछ organoid इकाइयों तैयारी चरणों का विवरण करने के लिए संशोधित करना होगा दोनों पर्याप्त रूप से ऊतक को पचाने और एकल कक्षों overdigestion विशेष रूप में, से बचने के और पाचन समाधान में dispase कोलैजिनेज की सांद्रता और समय 37 पर पाचन डिग्री सेल्सियस

इस तकनीक का अंतिम लक्ष्य मानव चिकित्सा के लिए एक संक्रमण है. मरीज की अपनी ही ऊतक से मानव आंत का ऊतक इंजीनियरिंग संभवतः एक टिकाऊ, मौजूदा उपचार की कमियां के साथ कोई भी कम आंत्र सिंड्रोम (एसबीएस) के लिए लंबी अवधि के इलाज की पेशकश कर सकता है. लघु आंत्र synDrôme एक रुग्ण छोटी आंत की कुल लंबाई, आमतौर पर अधिक से अधिक 50-75 प्रतिशत है, जैसे कि उसके अवशोषण की क्षमता गंभीर रूप से कम हो जाता है और रोगी enteral पोषण से पर्याप्त पोषण नहीं प्राप्त कर सकते हैं का एक महत्वपूर्ण अंश की लकीर से उत्पन्न स्थिति है 2 में. बच्चों, एसबीएस का सबसे आम कारण बड़े पैमाने पर छोटे आंत्र या आद्यमध्यांत्र volvulus के साथ आंत्रशोथ नेक्रोटाइज़िंग malrotation माध्यमिक लकीर 8,9 इसके अलावा, हालांकि कम आम, एसबीएस Crohn रोग की सेटिंग में कई resections की वजह से वयस्कों में हो सकता है, या के साथ mesenteric संवहनी रोग के लिए माध्यमिक ischemia 10,11. क्योंकि SBS रोगियों enteral सेवन के साथ पर्याप्त पोषण नहीं बनाए रख सकते हैं, वे लंबी अवधि के कुल parenteral पोषण, जो खुद जिगर की विफलता और सिरोसिस के द्वारा बच्चों में जटिल हो सकता है की आवश्यकता 12 SBS रोगियों इसलिए महत्वपूर्ण सहना हो सकती है. स्वास्थ्य देखभाल की लागत, हाल ही में करने के लिए रोगी के प्रति 1.6 मिलियन डॉलर के आदेश पर होने का अनुमान5 साल से अधिक 13. आंतों SBS के लिए माध्यमिक विफलता के लिए देखभाल के मौजूदा मानक आंतों, जिगर / आंतों, या अन्य multivisceral प्रत्यारोपण है, लेकिन यह केवल एक 60% 5 साल की उत्तरजीविता प्रदान और immunosuppressive चिकित्सा के एक आजीवन कोर्स के लिए रोगी consigns 14 इसके अलावा, सीमित मांग और आपूर्ति और लंबे इंतजार के समय में एक अनिवार्य बेमेल में दाता अंग की उपलब्धता का परिणाम है. 15 इसलिए, ऊतक इंजीनियरिंग रोगी ऑटोलॉगस ऊतक से एक आकर्षक विकल्प होगा.

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Disclosures

ब्याज की कोई संघर्ष की घोषणा की.

Acknowledgments

ट्रेसी सी. Grikscheit, एरिक आर बार्देल, और Frédéric जी साला पुनर्योजी चिकित्सा के लिए कैलिफोर्निया इंस्टीट्यूट (सीआईआरएम), अनुदान संख्या RN2 - +००,९४६ 1 (TCG) और TG2 01,168 (ERB, FGS) द्वारा समर्थित हैं. एलीसन एल Speer विश्वविद्यालय सर्जन Ethicon विद्वान की एक सोसायटी है. Yashuhiro Torashima एक बच्चों के अस्पताल के लॉस एंजिल्स Saban संस्थान अनुसंधान कैरियर विकास फैलोशिप द्वारा वित्त पोषित है.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
HBSS Gibco 114170-112
Antibiotic-Antimycotic 100X Invitrogen 15240-062
Dispase Gibco 17105-041
Collagenase Type 1 Worthington LS004194
DMEM High Glucose 1X Gibco 11995-065
Heat inactivated FBS Invitrogen 16140-071
Biofelt 100% PGA Concordia Medical FELT01-1005 For polymer preparation as in Ref. 4
Poly-L-lactic acid Durect B6002-1 For polymer preparation as in Ref. 4
Type I Collagen, rat tail Sigma-Aldrich C3867-1VL For polymer preparation as in Ref. 4
Ketoprofen 100 mg/ml Fort Dodge Animal Health 71-KETOI-100-50
LabDiet 5001 rodent chow LabDiet 5001
Septra 200 mg / 40 mg per 5 ml, USP Hi-Tech Pharmacal 50383-824-16
Isoflurane, USP Phoenix Pharmaceuticals 57319-507-06

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References

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