Summary
Este artículo y el vídeo de acompañamiento presentar nuestro protocolo para la generación de tejido de ingeniería intestino en el ratón, utilizando un organoide unidades-on-andamio enfoque.
Abstract
De tejido de ingeniería intestino delgado (TESI) ha sido utilizado con éxito para rescatar a ratas Lewis después de la resección masiva del intestino delgado, resultando en retorno a pesos preoperatorios en 40 días. 1 En los seres humanos, resección masiva del intestino delgado puede resultar en el síndrome del intestino corto, una malabsorción funcional Estado que confiere una significativa morbilidad, mortalidad y costes sanitarios, incluyendo la dependencia de nutrición parenteral, la insuficiencia hepática y cirrosis, y la necesidad de un trasplante de órganos multivisceral. 2 En este trabajo se describen y documentan nuestro protocolo para la creación de tejido modificado intestino en un modelo de ratón con un organoide multicelular unidades-on-andamio enfoque. Unidades de organoides son agregados multicelulares derivados del intestino que contienen elementos tanto de la mucosa y mesenquimales, 3 la relación entre el que conserva el nicho de células madre intestinal. 4 En la investigación en curso y futuros, la transición de nuestra técnica en laratón permitirá la investigación de los procesos que intervienen durante la formación de TESI mediante la utilización de las herramientas transgénicas disponibles en esta especie. 5 La disponibilidad de las cepas de ratón inmunocomprometidos también nos permitirá aplicar la técnica de tejido intestinal humano y optimizar la formación de TESI humana como un de ratón con xenoinjerto antes de su transición a los seres humanos. Nuestro método utiliza buenas prácticas de fabricación (GMP) reactivos y materiales que ya han sido aprobados para su uso en pacientes humanos, y por lo tanto ofrece una ventaja significativa sobre los enfoques que se basan en los tejidos animales descelularizados. El objetivo final de este método es su traducción a los seres humanos como una estrategia de medicina regenerativa terapéutico para el síndrome de intestino corto.
Protocol
1. Unidades de Preparación organoide
- Instrumentos apropiados para la disección del ratón (tijeras y pinzas) debe ser esterilizado por autoclave.
- Humanamente sacrificar al ratón donante de acuerdo con los protocolos locales IACUC. Asegúrese de que el animal está muerto antes de continuar.
- Hacer una incisión de línea media para tener acceso a la cavidad peritoneal. Los colgajos de piel se puede reflejar como sea necesario para mejorar la exposición.
- Eviscerar el intestino delgado y se divide justo distal al ligamento de Treitz. Separe el intestino delgado de su mesenterio utilizando disección roma fuerte y suave. Identificar la unión ileocecal y dividir el intestino delgado 5 mm proximal a este.
- Usando tijeras, abrir el intestino longitudinalmente a lo largo del borde antimesentérico en una placa de Petri con 10 ml 4 ° C, la solución salina tamponada estéril de Hanks (HBSS, Invitrogen, Carlsbad CA) / 1X antibiótico-antimicótico (anti-anti, Invitrogen) solución. Borrar la materia fecal desde el intestino se abrió conagitación suave a continuación, transferir intestino se abrió a un tubo de centrífuga de 15 ml con 10 ml de 4 ° C, HBSS estéril / 1X anti-anti.
- Se lava el intestino se abrió tres veces en 10 ml de 4 ° C, 1X HBSS estéril / anti anti-en un tubo de ensayo. Cada lavado se puede realizar con agitación suave del tubo de 15 ml por 30 seg. Después de agitar, el tejido intestinal se hunde hasta el fondo del tubo. Deseche el material flotante, que es basura mesenquimal. Quitar la solución de lavado cuidadosamente con una pipeta.
- Picar el intestino lavado en una placa de Petri con 10 ml de 4 ° C, 1X HBSS estéril / anti anti-a menos de piezas de 1 mm cuadrados usando unas tijeras. Reúna el material triturado con una pipeta automática y colocarlo en un tubo de ensayo.
- Centrifugar el tubo a 500 rpm durante 8 min. Eliminar el sobrenadante, que contiene grasa y el mesénquima.
- Se digiere el material triturado, se lavó con 10 ml de HBSS estéril / 1X anti-anti más 0,125 mg / ml de dispasa (Invitrogen) y 800 unidades / ml colagenasa tipo 1 (Worthington, Lakewood NJ). Para preparar 40 ml de la solución de digestión, pesar 5 mg de dispasa, 142 mg de colagenasa, y añadir HBSS estéril hasta un volumen de 40 ml. Preparar esta solución recién cada unidad de tiempo organoides se preparan, y mantener a 4 º C hasta su utilización. Añadir la solución de digestión directamente a la pastilla del paso 1,8.
- Incubar el tubo de ensayo que contiene el material triturado, se lavó con la solución de digestión a 37 ° C durante 20 min.
- Recuperar el tubo de ensayo y además perturbar el tejido digerido por trituración con una pipeta de 10 ml. Repita entre 20 a 50 veces hasta una apariencia uniforme.
- Centrifugar el tubo de ensayo durante 5 min a 800 rpm. Eliminar el sobrenadante, que contiene las células individuales.
- Detener la reacción de digestión con 10 ml de 4 ° C, Modificado de Dulbecco estéril medio Eagle (DMEM, Invitrogen) más 10% v / v inactivado por calor suero fetal bovino (HI-FBS, Invitrogen). Resuspender el pellet y agitar el tubo.
- Centrifugar el tubo de ensayo durante 5 min a 800 rpm. Eliminar el sobrenadante cuidadosamente con una pipeta automática hasta las últimas gotas. Usar una pipeta de plástico desechable para las últimas gotas para evitar resuspendiendo el sedimento.
2. La carga de ácido poliglicólico Andamio
- Formar 2-mm de largo, 5-mm andamios diámetro exterior cilíndrico de ácido poliglicólico no tejido (2 mm de espesor de chapa, 60 mg cm-3 densidad, porosidad> 95%, Fibras Concordia, Coventry RI) como se describe en la ref. 4.
- Recorte el distal 2 mm de una pipeta de microlitro desechable 1.000 inclinar con tijeras preparadas con 70% de etanol en agua destilada.
- Coloque el andamio en una placa de cultivo de 4 pocillos. Cargar las unidades de organoides al andamio con la pipeta de microlitro 1.000, primero en el lumen y, a continuación sobre la superficie exterior. Utilice una pinza para asegurar el revestimiento del lumen. No interrumpir o romper la forma cilíndrica del polímero.
3. Implantación en ratones Host
- Utilice un ratón singénico anfitrión en el mismo fondo que el donante si están disponibles. De lo contrario, emplean un diabéticos no obesos inmunocomprometidos / grave inmunodeficiencia combinada o NOD / SCID animal (Jackson Laboratories, Sacramento CA).
- Inducir la anestesia general con isoflurano. Afeitado, preparación y cubrir el abdomen del ratón.
- Haga una incisión de 5 mm de la línea media para ganar la entrada a la cavidad peritoneal. Identificar y destripar cuidadosamente el epiplón mayor. Coloque el polímero cargado en el epiplón y se envuelve con el tejido. No rompa el epiplón.
- Asegure que el polímero el epiplón con una sutura 5-0 monocryl. Suavemente reemplazar el epiplón con el polímero envuelto en su posición anatómica.
- Cierre la incisión abdominal en capas con suturas de vicryl 4-0. Ejecute el cierre del músculo y tener cuidado de no lesionar las vísceras abdominales por debajo de la incisión. Use suturas interrumpidas para la piel.
- Administrar analgesia postoperatoria con 2 mg / kg de ketoprofeno (Ketofen, Fort Dodge Animal Health) en agua estéril como una pápula subcutánea adyacente a la incisión. Los animales deben ser evaluados diariamente y si el animal está demostrando signos de dolor o angustia, una dosis adicional de ketoprofeno puede ser administrado el día después de la operación 2. En el tercer día postoperatorio, el animal debe estar completamente recuperado sin evidencia de dolor o angustia. Si el dolor o molestia persiste en el día 3 después de la operación, se considera anormal y debería ser tratado de acuerdo con los protocolos del IACUC instalaciones y cuidado de los animales.
- Permitir el ratón para recuperar y el intestino de tejido de ingeniería crecer durante cuatro semanas. Dar acceso a la ad libitum a los animales roedores chow (Lab Diet 5001, PMI Nutrition, St. Louis MO) y el agua con Septra 200 mg / 40 mg por 5 ml (Hi-Tech Pharmacal, Amityville NY) a una dilución 1:100.
4. Cosecha
- Humanely sacrificar al animal huésped cuatro semanas después de la implantación.
- Vuelva a abrir la incisión original y reflejan la piel cefálica a facilitar el acceso a la cavidad peritoneal.
- Abra la capa muscular e identificar el constructo de tejido modificado como un globo de tejido.
- Tome las adherencias a la construcción de las vísceras intraabdominales mediante disección cortante.
- Fijar el constructo en formalina para posterior parafina montaje o el uso del tejido fresco para ensayos bioquímicos tales como la PCR en tiempo real o aislamiento de las proteínas.
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Representative Results
La Figura 1 muestra un esquema general para el protocolo documentado aquí. El resultado final de este protocolo es una estructura de globo esférico o de tejido de ingeniería intestino murino con un lumen, mucosa, submucosa, y rodea muscularis. Figura 2A muestra un globo típico en comparación con un polímero de partida andamio. Figura 2B muestra el mismo constructo bruscamente bivalvo para revelar su lumen. Figura 3 demuestra un hematoxilina / eosina manchado de parafina montado en sección transversal de una construcción típica éxito después de 4 semanas de incubación. En Ref. 4, hemos sido capaces de producir mediante ingeniería tisular intestino con éxito el 89% del tiempo (39 de 44 implantes).
Un constructo de éxito es uno en el cual no se forma la mucosa. Es imposible juzgar en base a aspecto macroscópico durante la cosecha si el mundo tendrán la mucosa en el análisis histológico final. Por lo tanto, si los ensayos bioquímicos son performed en el tejido constructo fresco, medio de cada globo debe ser fijo y montado parafina para su análisis histológico para confirmar que la mucosa está presente en cada muestra. Un constructo de éxito demostrará estroma sólo y fibrosis en hematoxilina / eosina.
Figura 1. Esquema para la producción de tejido de ingeniería en el intestino del ratón. En breve, el tejido donante se recoge y se procesa en unidades de organoides. Las unidades de organoides se cargan en un andamio poroso de ácido poliglicólico, que se implanta en un huésped y se dejó incubar durante 4 semanas. La construcción de ingeniería se recupera después y se pueden caracterizar mediante histología o ensayos bioquímicos.
Figura 2. Ejemplo de tejido de ingeniería intestino constructo cosecharon a 4 semanas. A: Construir en compaRison al polímero de partida andamio. B: La misma construcción, bivalvo para revelar su lumen.
Figura 3. Baja potencia de hematoxilina / eosina micrografía de una típica construcción exitosa intestino de tejido de ingeniería. Las etiquetas y las flechas indican el lumen con la mucosa intestinal, y el páncreas anfitrión adherente.
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Discussion
Se presenta un protocolo para la producción de tejido de ingeniería en el intestino del ratón utilizando un organoide unidades-on-andamio enfoque. Los pasos más importantes son los de la preparación de unidades organoide. Se debe tener cuidado de limpiar adecuadamente y procesar mecánicamente el tejido, pero el mismo cuidado debe ser tomado para no overdigest o overtriturate las unidades de organoides después de la digestión se lleva a cabo (paso 1,11). Si se hace esto, las unidades de organoides se puede reducir a células individuales, que se pueden perder en el sobrenadante del paso 1,12, y es improbable que sobrevivan a producir mediante ingeniería tisular intestino, como el nicho de células madre intestinales, no se conserva en este caso.
El pequeño tamaño del ratón hace que sea difícil para anastomizar directamente el constructo de tejido modificado al intestino del animal hospedador para comprobar su función in vivo. Alternativamente, la rata representa un modelo más grande para el crecimiento TESI que facilita la anastomosis en vivo yya se ha realizado por esta razón 1. Sin embargo, el tamaño del ratón no es un obstáculo insuperable, como otros han sido capaces de realizar la resección del intestino delgado y anastomosis, 6 o cirugía anorectal, 7 en estos animales. Para abordar estos problemas, experimentos para caracterizar la función de nuestras construcciones de ingeniería tisular intestinales en una moda en vitro están en curso. Las limitaciones adicionales a esta técnica incluyen una tasa de éxito del 89% en la generación de TESI 4. Es decir, el 89% de OU andamios cargados con éxito generará TESI. La aplicación de esta técnica por otros puede ayudar a refinar y mejorar esta técnica de aumentar el rendimiento global de 100%. Además, esta técnica podría ser mejorada si la masa de tejido total generada podría ser aumentado. Actualmente, la citometría de flujo ha demostrado que el número total de células presentes en el constructo cosechada TESI es 3-veces mayor que el número presente en la implantación(3,07 x 10 6 ± 0,5 x 10 6) 4. Mejora el volumen de producción TESI es un paso importante hacia la traducción a la terapia.
Observamos también que el intestino del ratón, siendo de pared muy fina y de pequeño calibre, es particularmente fácil de procesar en comparación con la de otras especies tales como cerdos o la rata. En los seres humanos, se espera que algunos de los detalles de los pasos de preparación de unidades de organoides tendría que ser modificada para ambos adecuadamente digerir el tejido y evitar overdigestion a células individuales, en particular las concentraciones de dispasa y colagenasa en la solución de digestión y el tiempo de la digestión a 37 ° C.
El objetivo final de esta técnica es una transición a la terapia humana. La ingeniería de tejidos de intestino humano a partir de tejido del propio paciente podría ofrecer un durable, cura a largo plazo para el síndrome de intestino corto (SBS) con ninguno de los inconvenientes de las terapias existentes. Síndrome del intestino cortodrome es una condición mórbida causada por la resección de una fracción significativa de la longitud total del intestino delgado, por lo general mayor que 50-75 por ciento, de tal manera que su capacidad de absorción se reduce drásticamente y el paciente no puede obtener suficiente alimento de la nutrición enteral. 2 En los niños, las causas más comunes de la SBS son la resección masiva de intestino delgado secundaria a enterocolitis necrotizante o malrotación del intestino medio con vólvulo 8,9. También, aunque menos común, la SBS puede ocurrir en adultos debido a resecciones múltiples en el contexto de la enfermedad de Crohn, o con isquemia mesentérica secundaria a enfermedad vascular 10,11. Dado que los pacientes SBS no puede mantener una nutrición suficiente con una ingesta enteral, que puedan necesitar a largo plazo nutrición parenteral total, que a su vez puede ser complicada en niños por insuficiencia hepática y cirrosis. 12 pacientes con SIC, pues, sufre importantes los costes sanitarios, estimó recientemente a ser del orden de US $ 1,6 millones por pacientemás de 5 años. 13 El actual estándar de tratamiento para la insuficiencia intestinal secundaria a la SBS es intestinal, hígado / intestino u otro trasplante multivisceral, pero esto sólo confiere un 60% de supervivencia a 5 años y relega al paciente a un curso de toda la vida de la terapia inmunosupresora 14. Además, la escasez de donantes de órganos en disponibilidad resultados incoherencias inevitables de la demanda y la oferta y los largos tiempos de espera. 15 Por tanto, la ingeniería de tejidos a partir de tejido autólogo del paciente sería una alternativa atractiva.
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Disclosures
No hay conflictos de interés declarado.
Acknowledgments
Tracy C. Grikscheit, Erik R. Barthel, y Frédéric G. Sala son apoyados por el Instituto de Medicina Regenerativa de California (CIRM), números de concesión RN2-00946-1 (TCG) y TG2-01168 (ERB, FGS). Allison L. Speer es una Sociedad de Cirujanos de la Universidad de Ethicon erudito. Yashuhiro Torashima es financiado por un Hospital de Niños de Los Angeles Fellowship Saban Research Institute de Desarrollo Profesional.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| HBSS | Gibco | 114170-112 | |
| Antibiotic-Antimycotic 100X | Invitrogen | 15240-062 | |
| Dispase | Gibco | 17105-041 | |
| Collagenase Type 1 | Worthington | LS004194 | |
| DMEM High Glucose 1X | Gibco | 11995-065 | |
| Heat inactivated FBS | Invitrogen | 16140-071 | |
| Biofelt 100% PGA | Concordia Medical | FELT01-1005 | For polymer preparation as in Ref. 4 |
| Poly-L-lactic acid | Durect | B6002-1 | For polymer preparation as in Ref. 4 |
| Type I Collagen, rat tail | Sigma-Aldrich | C3867-1VL | For polymer preparation as in Ref. 4 |
| Ketoprofen 100 mg/ml | Fort Dodge Animal Health | 71-KETOI-100-50 | |
| LabDiet 5001 rodent chow | LabDiet | 5001 | |
| Septra 200 mg / 40 mg per 5 ml, USP | Hi-Tech Pharmacal | 50383-824-16 | |
| Isoflurane, USP | Phoenix Pharmaceuticals | 57319-507-06 |
References
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