Summary
هذه المادة والفيديو المصاحبة لدينا هذا البروتوكول لتوليد أنسجة الأمعاء الهندسة في الماوس، وذلك باستخدام وحدات عضي على اساس سقالة النهج.
Abstract
وقد تم بنجاح الأنسجة المهندسة الأمعاء الدقيقة (TESI) تستخدم لانقاذ الفئران لويس بعد استئصال الأمعاء الدقيقة ضخمة، مما أدى إلى العودة إلى الأوزان قبل الجراحة في غضون 40 يوما. 1 في البشر، ضخمة استئصال الأمعاء الدقيقة يمكن أن يؤدي إلى متلازمة الأمعاء القصيرة، وmalabsorptive الوظيفية الدولة التي تمنح قسط كبير من المراضة والوفيات وتكاليف الرعاية الصحية بما في ذلك الاعتماد التغذية الوريدية، وفشل الكبد وتليف الكبد، والحاجة إلى زرع الأعضاء multivisceral. 2 في هذه الورقة، ونحن وصف وتوثيق بروتوكول لدينا لخلق نسيج الأمعاء الهندسة في نموذج الفأر مع نهج وحدات متعددة الخلايا على اساس عضوي سقالة. وحدات متعددة الخلايا عضي هي المجاميع المشتقة من الأمعاء التي تحتوي على عناصر كل من الغشاء المخاطي والوسيطة، 3 العلاقة بين الذي يحافظ على الخلايا الجذعية المعوية المتخصصة. 4 في البحوث الجارية والمستقبلية، والانتقال من أسلوب لدينا فيوسوف تسمح الماوس للتحقيق في العمليات التي ينطوي خلال تشكيل TESI من خلال الاستفادة من أدوات المعدلة وراثيا المتوفرة في هذا النوع. 5 وتوافر سلالات الفئران المناعة ستسمح لنا أيضا لتطبيق هذه التقنية في الأنسجة المعوية البشرية وتحسين تشكيل TESI الإنسان بوصفه طعم أجنبي الماوس قبل انتقاله إلى البشر. أسلوبنا توظف الممارسات التصنيعية الجيدة (GMP) الكواشف والمواد التي تمت الموافقة عليها بالفعل للاستخدام في المرضى من البشر، ولذا فهي توفر تفوقا كبيرا على النهج التي تعتمد على الأنسجة الحيوانية decellularized. الهدف النهائي لهذه الطريقة هو ترجمتها إلى البشر كاستراتيجية الطب التجديدي العلاجية لمتلازمة الأمعاء القصيرة.
Protocol
1. عضي وحدات التحضير
- يجب تعقيم الأدوات المناسبة لتشريح الفأر (مقص وملقط) بواسطة الأوتوكلاف.
- الموت ببطء إنسانية الماوس المانحة وفقا لبروتوكولات IACUC المحلية. تأكد من أن الحيوان قد مات قبل الشروع.
- إجراء شق خط الوسط للوصول إلى التجويف البريتوني. يمكن أن تنعكس اللوحات الجلد حسب الحاجة لتحسين التعرض.
- سلب الأمعاء الدقيقة وتقسيمها القاصي عادل للرباط ترايتس. فصل الأمعاء الدقيقة من مساريق وذلك باستخدام تشريح حادة حادة ورقيقة. تحديد تقاطع اللفائفية وتقسيم الأمعاء الصغيرة 5 مم الأقرب إلى ذلك.
- باستخدام مقص، وفتح الأمعاء بالطول على طول الحدود مقابل المساريق في طبق بتري مع 10 مل 4 ° C، ملحي معقم هانكس "مخزنة (HBSS، إينفيتروجن، كارلسباد CA) / 1X للمضادات الحيوية المضادة للفطريات (المضادة للمكافحة، إينفيتروجن) الحل. مسح البراز من الأمعاء مع فتحالتحريض لطيف ثم نقل إلى الأمعاء فتح أنبوب الطرد المركزي مع 10 مل 15ml من 4 ° C، HBSS العقيمة / 1X المضادة للسامية.
- غسل الأمعاء فتح ثلاث مرات في 10 مل من 4 ° C، HBSS العقيمة / 1X المضادة للسامية في أنبوب اختبار. لا يمكن أن يؤديها كل غسيل مع اهتزاز خفيف من الأنبوب 15 مل لمدة 30 ثانية. بعد اهتزاز، والأنسجة المعوية المصارف إلى أسفل الأنبوب. تجاهل المواد العائمة، والتي هي الوسيطة الحطام. إزالة الحل الغسيل بعناية مع الماصة.
- اللحم المفروم الأمعاء غسلها في طبق بتري مع 10 مل من 4 ° C، HBSS العقيمة / 1X مكافحة المضادة للقطع أقل من 1 ملم مربع باستخدام المقص. جمع المواد المفروم حتى مع الماصة التلقائي ووضعه في أنبوب الاختبار.
- أجهزة الطرد المركزي في أنبوب في 500 دورة في الدقيقة لمدة 8 دقائق. تجاهل طاف، التي تحتوي على الدهون واللحمة المتوسطة.
- هضم المفروم، المواد غسلها مع 10 مل من HBSS العقيمة / 1X المضادة للسامية بالإضافة إلى 0،125 ملغ / مل dispase (إينفيتروجن) وحدات 800 / مL كولاجيناز نوع 1 (ورثينجتون، ليكوود NJ). لإعداد 40 مل من محلول الهضم، وتزن من 5 ملغ من dispase، 142 ملغ من كولاجيناز، وإضافة HBSS العقيمة تصل إلى حجم 40 مل. إعداد هذا الحل الطازجة تعد كل وحدة عضي الوقت، والحفاظ في 4 درجات مئوية حتى جاهزة للاستخدام. إضافة الحل الهضم مباشرة إلى بيليه من الخطوة 1.8.
- احتضان أنبوب اختبار يحتوي على المفروم، المواد غسلها مع الحل في الهضم C ° 37 لمدة 20 دقيقة.
- استرداد أنبوب اختبار وتعطيل المزيد من الأنسجة هضمها من قبل سحن مع الماصة 10 مل. تكرار ما بين 20 إلى 50 مرة حتى يتم الحصول على مظهر موحد.
- أجهزة الطرد المركزي في أنبوب الاختبار لمدة 5 دقائق في 800 دورة في الدقيقة. تجاهل طاف، التي تحتوي على خلايا واحد.
- وقف رد فعل الهضم مع 10 مل من 4 ° C، عقيمة في Dulbecco معدلة النسر متوسطة (DMEM، إينفيتروجن)، بالإضافة إلى 10٪ V / V للحرارة المعطل مصل بقري جنيني (FBS-مرحبا، إينفيتروجن). إعادة تعليق على بيلير ويهز الأنبوب.
- أجهزة الطرد المركزي في أنبوب الاختبار لمدة 5 دقائق في 800 دورة في الدقيقة. إزالة بعناية طاف مع الماصة التلقائي حتى قطرات القليلة الماضية. استخدام الماصة البلاستيكية للقطرات القليلة الماضية لتجنب resuspending بيليه.
2. التحميل من حمض Polyglycolic سقالة
- نموذج 2-مم، 5 مم القطر الخارجي السقالات أسطواني من حمض polyglycolic محبوكة (2-مم سمك ورقة، 60 ملغ الكثافة الظاهرية-3 سم؛ المسامية> 95٪، ألياف كونكورديا، كوفنتري RI) كما هو موضح في المرجع. 4.
- تقليم القاصي 2 مم من الماصة المتاح ميكروليتر 1000 ترجيح مع مقص أعدت مع الايثانول 70٪ في الماء المقطر.
- وضع سقالة في لوحة الثقافة 4-أيضا. تحميل وحدات عضي على السقالة مع الماصة ميكروليتر 1،000، لأول مرة في التجويف ومن ثم إلى السطح الخارجي. استخدام ملقط لضمان طلاء من التجويف. لا تعطيل أو كسر مفتوح على شكل أسطواني من البوليمر.
3. غرس في الماوس المضيف
- استخدام الماوس المضيف مسانج على خلفية نفس الجهة المانحة إذا كانت متوفرة. خلاف ذلك، وتوظيف والسكري nonobese المناعة / شديدة العوز المناعي مجتمعة أو NOD / SCID الحيوانية (جاكسون المختبرات، سكرامنتو CA).
- حمل التخدير العام مع isoflurane. حلاقة والإعدادية وثنى البطن الفأر.
- إجراء شق خط الوسط 5 مم للحصول على مدخل التجويف البريتوني. تحديد وسلب بعناية أكبر الثرب. وضع البوليمر تحميلها على الثرب والتفاف عليه مع الأنسجة. لا المسيل للدموع الثرب.
- تأمين البوليمر إلى الثرب مع خياطة monocryl 5-0. استبدال بلطف الثرب مع البوليمر ملفوفة في موقفها التشريحية.
- إغلاق شق البطن في طبقات باستخدام الخيوط الجراحية vicryl 4-0. إغلاق تشغيل العضلات والحرص على عدم إصابة الأحشاء في البطن دون شق. استخدام الخيوط الجراحية توقف للبشرة.
- إدارة تسكين بعد العملية الجراحية مع كيتوبروفين ملغ / كغ 2 (Ketofen، وفورت دودج صحة الحيوان) في الماء المعقم الانتفاخ تحت الجلد باعتبارها المتاخمة للشق. وينبغي تقييم الحيوانات اليومية وإذا كان الحيوان مما يدل علامات الألم أو الضيق، يمكن إعطاء جرعة إضافية من كيتوبروفين في يوم آخر المنطوق 2. بعد يوم ما بعد الجراحة الثالثة، ينبغي الحيوان تعافى تماما دون وجود أدلة من الألم أو الضيق. إذا كان الألم أو الضيق يستمر في يوم آخر المنطوق 3، ويعتبر هذا غير طبيعي وينبغي أن تعالج وفقا لبروتوكولات مرفق الرعاية IACUC والحيوانية.
- السماح الماوس لفترة نقاهة والأمعاء الأنسجة المهندسة في النمو لمدة أربعة أسابيع. إعطاء libitum الإعلانية وصول الحيوانات إلى طعام القوارض (معمل حمية 5001، PMI التغذية، وسانت لويس MO) والمياه مع 200 ملغ ملغ / 40 مل لكل 5 Septra (مرحبا التكنولوجيا صيدلي، NY Amityville) التخفيف 1:100 في.
4. حصاد
- هوماالموت ببطء nely الحيوان المضيف أربعة أسابيع بعد الزرع.
- رأسيا إعادة فتح شق الأصلي وتعكس الجلد لتسهيل الوصول إلى التجويف البريتوني.
- فتح طبقة العضلات والأنسجة تحديد بناء الهندسة العالم باعتبارها من الأنسجة.
- إنزال الالتصاقات إلى بناء الأحشاء داخل البطن باستخدام من تشريح حادة.
- إصلاح بناء في الفورمالين لالبارافين في وقت لاحق المتصاعدة، أو استخدام الأنسجة جديدة للفحوصات البيوكيميائية مثل في الوقت الحقيقي PCR أو العزلة البروتين.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
ويظهر الشكل 1 مخطط العام لبروتوكول توثيقها هنا. النتيجة النهائية لهذا البروتوكول هو بنية كروية أو العالم من الأنسجة المهندسة الأمعاء الفئران مع التجويف، الغشاء المخاطي، مخاطية، والعضلية المحيطة. الشكل 2A يظهر العالم نموذجي بالمقارنة مع بداية 2B سقالة البوليمر الشكل. يعرض نفسه بناء ثنائي الصمام بشدة للكشف عن تجويف في الشكل 3 يوضح الهيماتوكسيلين / يوزين البارافين ملطخة محمولة على قطاع عريض من بناء نموذجي ناجح بعد 4 أسابيع من الحضانة. في المرجع. 4، تمكنا من إنتاج أنسجة الأمعاء الهندسة بنجاح 89٪ من الوقت (39 من أصل 44 عملية زرع).
وبناء فاشلة هي واحدة في الغشاء المخاطي الذي لا أشكال. فمن المستحيل الحكم على أساس المظهر الإجمالي عند الحصاد ما إذا كان العالم سوف يكون الغشاء المخاطي في التحليل النهائي نسيجية. إذا لذا المقايسات الكيميائية الحيوية هي performeد على النسيج بناء جديدة، ينبغي أن تكون ثابتة نصف كل العالم وشنت البارافين لتحليل نسيجية للتأكد من وجود الغشاء المخاطي في كل عينة. ومن شأن بناء ناجحة تثبت سدى فقط والتليف على الهيماتوكسيلين / يوزين تلطيخ.
الشكل 1. مخطط لإنتاج أنسجة الأمعاء الهندسة في الماوس. وباختصار، هو المقطوع الأنسجة المانحة ومعالجتها في وحدات عضي. يتم تحميل وحدات عضي على سقالة polyglycolic حمض يسهل اختراقها، والذي زرع بعد ذلك إلى مجموعة وسمح لاحتضان لمدة 4 أسابيع. يتم استرداد ثم بناء هندسيا ويمكن وصفها عن طريق الأنسجة أو المقايسات الكيميائية الحيوية.
بناء تحصد الشكل 2. مثال من الأمعاء الأنسجة المهندسة في 4 أسابيع. A: بناء في المقارنةRison للبدء البوليمر سقالة. B: وبناء نفسه، ثنائي الصمام لكشف التجويف والخمسين.
الشكل 3. الطاقة المنخفضة الهيماتوكسيلين / يوزين صورة مجهرية من الأمعاء نموذجية ناجحة بناء الأنسجة الهندسة. التسميات وتبين الأسهم التجويف مع مخاطية الأمعاء، البنكرياس وتمسكا المضيف.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
نقدم بروتوكول لإنتاج أنسجة الأمعاء الهندسة في الماوس باستخدام وحدات عضي على اساس سقالة النهج. الخطوات الأكثر أهمية هي تلك الوحدات من إعداد عضوي. يجب توخي الحذر بشكل كاف لتنظيف ومعالجة الأنسجة ميكانيكيا، ولكن يجب توخي الحذر بعدم المساواة overdigest أو overtriturate الوحدات عضي بعد إجراء عملية الهضم (الخطوة 1.11). إذا تم ذلك، يمكن تخفيض وحدات عضي إلى الخلايا واحدة، والتي يمكن أن تضيع في طاف من الخطوة 1.12، وليس من المرجح أن البقاء على قيد الحياة لإنتاج أنسجة الأمعاء الهندسة، إذ ان الخلايا الجذعية المعوية مكانة لا يمكن الحفاظ عليها في هذا القضية.
صغر حجم الماوس يجعل من تحدي ليفاغر مباشرة بناء الأنسجة إلى الأمعاء الهندسة الحيوان المضيف لاختبار وظيفتها في الجسم الحي. بدلا من ذلك، الفأر يمثل أكبر نموذج للنمو TESI التي تسهل في الجسم الحي ومفاغرةوقد تم بالفعل تنفيذ لهذا السبب 1. ومع ذلك، فإن حجم الماوس ليست عقبة لا يمكن التغلب عليها، كما تمكنت دول أخرى لأداء استئصال الأمعاء الصغيرة ومفاغرة، 6 أو الجراحة الشرجية، و 7 في هذه الحيوانات. لمعالجة هذه القضايا، والتجارب لتحديد خصائص وظيفة يبني أنسجة الأمعاء الهندسة لدينا في المختبر بطريقة مستمرة. قيود إضافية لهذه التقنية تشمل نسبة نجاح 89٪ في توليد TESI 4. وهذا هو، وسوف 89٪ من السقالات تحميل OU توليد بنجاح TESI. قد تطبيق هذه التقنية من قبل الآخرين تساعد صقل وتحسين هذه التقنية زيادة الناتج الإجمالي إلى 100٪. وبالإضافة إلى ذلك، يمكن تحسين هذه التقنية إذا يمكن زيادة كتلة الأنسجة مجموع إنشاؤها. حاليا، وقد أثبتت التدفق الخلوي أن العدد الإجمالي للخلايا الموجودة في بناء TESI المقطوع هو 3 أضعاف أكبر من عدد المتواجدين في غرس(3.07 × 10 6 ± 0.5 × 10 6) 4. تحسين حجم الإنتاج TESI خطوة هامة نحو ترجمة للعلاج.
ونلاحظ أيضا أن الأمعاء الماوس، ويجري جدا رقيقة الجدران وذات العيار الصغير، من السهل خاصة لمعالجة بالمقارنة مع الأنواع الأخرى من أن مثل الفئران أو الخنازير ل. في البشر، ونحن نتوقع أن بعض تفاصيل الخطوات عضي إعداد وحدات يتعين تعديلها لكلا هضم كاف الأنسجة والخلايا لتجنب overdigestion واحد، ولا سيما تركيزات dispase وكولاجيناز في حل الهضم ووقت الهضم في 37 ° C.
الهدف النهائي لهذه التقنية هو الانتقال إلى علاج البشر. يمكن أن هندسة الأنسجة من الأمعاء البشرية من أنسجة المريض نفسه تقدم يحتمل دائم وطويل الأمد لعلاج متلازمة الأمعاء القصيرة (SBS) مع أي من عيوب العلاجات الحالية. قصيرة الأمعاء SYNدروم هو حالة مرضية سببها استئصال جزء كبير من إجمالي طول الأمعاء الدقيقة، وزيادة عادة من 50-75 في المئة، بحيث يتم تقليل قدرتها الاستيعابية بشدة والمريض لا يستطيع الحصول على ما يكفي من الغذاء من التغذية المعوية. 2 في الأطفال، وأكثر الأسباب شيوعا للSBS هائلة استئصال الأمعاء الصغيرة الأمعاء الناخر الثانوية لسوء الاستدارة أو مع انفتال المعي المتوسط. 8،9 أيضا، رغم أنه أقل شيوعا، يمكن أن تحدث في SBS البالغين بسبب استئصال متعددة في تحديد مرض كرون، أو مع نقص التروية المساريقي الثانوية لأمراض الأوعية الدموية. 10،11 لأن المرضى SBS لا يمكن الحفاظ على التغذية الكافية مع تناول المعوية، فإنها قد تتطلب على المدى الطويل التغذية الوريدية الكاملة، والتي يمكن أن يكون معقدا في حد ذاته الأطفال من قبل فشل الكبد وتليف الكبد. SBS 12 مريضا يعانون بالتالي كبيرة تكاليف الرعاية الصحية، قدر مؤخرا أن يكون في حدود 1.6 مليون دولار لكل مريضأكثر من 5 سنوات. (13) المعيار الحالي لرعاية الفشل المعوية الثانوية إلى SBS هو زرع multivisceral الأمعاء، الكبد / المعوية، أو غيرها، ولكن هذا يضفي سوى 60٪ لمدة 5 سنوات البقاء على قيد الحياة وأن يلقي المريض لدورة من العلاج مدى الحياة مناعة 14 علاوة على ذلك، محدودة النتائج توافر تبرع بالأعضاء في عدم تطابق حتمي في العرض والطلب وأوقات الانتظار الطويل 15 ولذا فإن هندسة الأنسجة من النسيج المريض ذاتي يكون بديلا جذابا.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الإعلان عن أي تضارب في المصالح.
Acknowledgments
ويدعم تريسي C. Grikscheit، إريك R. بارثيل، وفريدريك سالا G. من معهد كاليفورنيا للطب التجديدي (CIRM)، وأرقام المنح RN2-00946-1 (TCG)، وTG2 01168-(إرب، FGS). أليسون L. سبير هو جمعية علماء جامعة Ethicon جراحي. ويتم تمويل Yashuhiro Torashima من قبل مستشفى الأطفال في لوس أنجلوس معهد بحوث سابان زمالة التطوير الوظيفي.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| HBSS | Gibco | 114170-112 | |
| Antibiotic-Antimycotic 100X | Invitrogen | 15240-062 | |
| Dispase | Gibco | 17105-041 | |
| Collagenase Type 1 | Worthington | LS004194 | |
| DMEM High Glucose 1X | Gibco | 11995-065 | |
| Heat inactivated FBS | Invitrogen | 16140-071 | |
| Biofelt 100% PGA | Concordia Medical | FELT01-1005 | For polymer preparation as in Ref. 4 |
| Poly-L-lactic acid | Durect | B6002-1 | For polymer preparation as in Ref. 4 |
| Type I Collagen, rat tail | Sigma-Aldrich | C3867-1VL | For polymer preparation as in Ref. 4 |
| Ketoprofen 100 mg/ml | Fort Dodge Animal Health | 71-KETOI-100-50 | |
| LabDiet 5001 rodent chow | LabDiet | 5001 | |
| Septra 200 mg / 40 mg per 5 ml, USP | Hi-Tech Pharmacal | 50383-824-16 | |
| Isoflurane, USP | Phoenix Pharmaceuticals | 57319-507-06 |
References
- Grikscheit, T. C., Siddique, A., Ochoa, E. R., et al. Tissue-engineered small intestine improves recovery after massive small bowel resection. Ann. Surg. 240, 748-754 (2004).
- Wales, P. W., Christison-Lagay, E. R. Short bowel syndrome: epidemiology and etiology. Sem. Ped. Surg. 19, 3-9 (2010).
- Evans, G. S., Flint, N., Somers, A. S., et al. The development of a method for the preparation of rat intestinal epithelial cell primary cultures. J. Cell Sci. 101, 219-231 (1992).
- Sala, F. G., Matthews, J. A., Speer, A. L., et al. A multicellular approach forms a significant amount of tissue-engineered small intestine in the mouse. Tiss. Eng. Part A. 17, 1841-1850 (2011).
- Speer, A. L., Sala, F. G., Matthews, J. A., Grikscheit, T. C. Murine tissue-engineered stomach demonstrates epithelial differentiation. J. Surg. Res. 171, 6-14 (2011).
- Haxhija, E. Q., Yang, H., Spencer, A. U., et al. Intestinal epithelial cell proliferation is dependent on the site of massive small bowel resection. Pediatr. Surg. Int. 23, 379-390 (2007).
- Zhao, L., Cheng, Z., Dhall, D., et al. A novel corrective pullthrough surgery in a mouse model of Hirschsprung's disease. J. Pediatr. Surg. 44, 759-766 (2009).
- Petrosyan, M., Guner, Y. S., Williams, M., et al. Current concepts regarding the pathogenesis of necrotizing enterocolitis. Ped. Surg. Int. 25, 309-318 (2009).
- Shew, S. B. Surgical concerns in malrotation and midgut volvulus. Ped. Radiol. 39, S167-S171 (2009).
- Sampietro, G. M., Corsi, F., Maconi, G., et al. Prospective study of long-term results and prognostic factors after conservative surgery for small bowel Crohn's disease. Clin. Gastroenterol. Hepatol. 7, 183-191 (2009).
- Klempnauer, J., Grothues, F., Bektas, H., Pichlmayr, R. Long-term results after surgery for acute mesenteric ischemia. Surgery. , 121-239 (1997).
- Fitzgibbons, S. C., Jones, B. A., Hull, M. A., et al. Relationship between biopsy-proven parenteral nutrition-associated liver fibrosis and biochemical cholestasis in children with short bowel syndrome. J. Ped. Surg. 45, 95-99 (2010).
- Spencer, A. U., Kovacevich, D., McKinney-Barnett, M., et al. Pediatric short bowel syndrome: the cost of comprehensive care. Am. J. Clin. Nutr. 88, 1552-1559 (2008).
- Kato, T., Tzakis, A. G., Selvaggi, G., et al. Intestinal and multivisceral transplantation in children. Ann. Surg. 243, 756-766 (2006).
- Reyes, J., Bueno, J., Kocoshis, S., et al. Current status of intestinal transplantation in children. J. Ped. Surg. 33, 243-254 (1998).
