Summary
Dieser Artikel und das dazugehörige Video präsentieren unser Protokoll zur Erzeugung von Tissue-Engineering-Darm der Maus, mit einem organoiden Einheiten-on-Gerüst Ansatz.
Abstract
Tissue-Engineering Dünndarm (TESI) erfolgreich verwendet worden, um Lewis Ratten nach massiven Dünndarmresektion zu retten, was im Gegenzug die präoperative Gewichte innerhalb von 40 Tagen. 1 Bei Menschen, massive Dünndarmresektion in Kurzdarmsyndrom, eine funktionelle malabsorptive führen Staat, der erheblichen Morbidität, Mortalität und Kosten im Gesundheitswesen einschließlich der parenteralen Ernährung abhängig, Leberversagen und Zirrhose, und die Notwendigkeit für multiviszerale Organtransplantation. 2 In diesem Papier verleiht, beschreiben und dokumentieren wir unser Protokoll für die Erstellung von Tissue-Engineering-Darm in einem Mausmodell mit einem vielzelligen organoide Einheiten-on-Gerüst Ansatz. Organoiden Einheiten sind mehrzellige Aggregate aus dem Darm abgeleitet, die sowohl mukosale und mesenchymalen Elemente enthalten, 3 die Beziehung zwischen denen die intestinale Stammzellnische bewahrt. 4 In laufende und zukünftige Forschung, der Übergang der Technik in derMaus zur Untersuchung der Vorgänge während TESI Bildung durch die Nutzung der transgenen Instrumenten in dieser Art beteiligt zu erlauben. 5 Die Verfügbarkeit von immungeschwächten Mausstämmen auch erlauben uns, die Technik für die menschliche Darmgewebe anwenden und optimieren die Bildung des menschlichen TESI als Maus-Xenograft vor dessen Übergang in den Menschen. Unsere Methode beschäftigt Good Manufacturing Practice (GMP)-Reagenzien und Materialien, die bereits für die Verwendung bei menschlichen Patienten zugelassen wurden, und bietet somit einen deutlichen Vorteil gegenüber Ansätzen, die auf dezellularisierten tierischen Geweben verlassen. Das ultimative Ziel dieser Methode ist die Übersetzung für den Menschen als regenerative Medizin therapeutische Strategie für Kurzdarmsyndrom.
Protocol
Ein. Organoid Units Vorbereitung
- Instrumente geeignet für Maus Dissektion (Schere und Pinzette) sollte im Autoklaven sterilisiert werden.
- Menschlich einschläfern den Spender Maus nach lokalen IACUC Protokolle. Stellen Sie sicher, dass das Tier tot ist, bevor Sie fortfahren.
- Einen Mittellinieneinschnitt um Zugang zu dem Peritonealraum gewinnen. Hautlappen können reflektiert je nach Bedarf, um die Exposition zu verbessern.
- Ausweiden des Dünndarms und teilen sie knapp distal des Lig. Treitz. Trennen Sie den Dünndarm von seinem Mesenterium mit scharfen und sanften stumpf. Identifizieren Sie die ileocecal Kreuzung und unterteilen den Dünndarm 5 mm proximal dazu.
- Mit Schere, öffnen Sie den Darm längs der Kraterbildung Grenze in einer Petrischale mit 10 ml 4 ° C, sterile Hanks 'Salzlösung (HBSS, Invitrogen, Carlsbad CA) / 1X Antibiotika-Antimykotika (Anti-Anti, Invitrogen) Lösung. Löschen Fäkalien aus dem geöffneten Darm mitvorsichtiges Schütteln dann übertragen eröffnet Darm zu einem 15ml Zentrifugenröhrchen mit 10 ml 4 ° C, sterile HBSS / 1X Anti-Anti.
- Waschen Sie die geöffneten Darm dreimal in 10 ml 4 ° C, sterile HBSS / 1X anti-anti in einem Reagenzglas. Jede Wäsche kann mit mildem Schütteln der 15 ml Tube für 30 sec durchgeführt werden. Nach Schütteln, sinkt das Darmgewebe dem Boden des Röhrchens. Entsorgen schwimmenden Material, das mesenchymalen Fremdkörpern ist. Entfernen Sie die Waschlösung vorsichtig mit einer Pipette.
- Mince des gewaschenen Darm in einer Petrischale mit 10 ml 4 ° C, sterile HBSS / 1X anti-anti auf weniger als 1 mm quadratische Stücke mit einer Schere. Sammeln Sie die gehackte Material mit einer automatischen Pipette und legen Sie sie in ein Reagenzglas.
- Zentrifugieren bei 500 Upm für 8 min. Überstand verwerfen, die Fett-und Bindegewebes enthält.
- Verdauen zerkleinertem, gewaschenem Material mit 10 ml sterilem HBSS / 1X anti-anti plus 0,125 mg / ml Dispase (Invitrogen) und 800 Einheiten / ml Collagenase Typ 1 (Worthington, Lakewood NJ). Bis 40 ml der Aufschlusslösung vorzubereiten, abwiegen 5 mg Dispase, 142 mg Kollagenase, und fügen Sie sterile HBSS bis zu einem Volumen von 40 ml. Diese Lösung jeweils frisch organoide Einheiten vorbereitet sind, und halten bei 4 ° C bis zum Gebrauch. Fügen Sie die Aufschlusslösung direkt an den Pellet aus Schritt 1.8.
- Inkubieren der Test-Röhrchen mit dem zerkleinerten, gewaschenen Materials mit der Aufschlußlösung bei 37 ° C für 20 min.
- Rufen Sie das Reagenzglas und weiter stören die verdaute Gewebe durch Verreiben mit einer 10 ml Pipette. Wiederholen zwischen 20 bis 50 mal, bis ein einheitliches Erscheinungsbild entsteht.
- Zentrifuge das Reagenzglas 5 min bei 800 UpM. Überstand verwerfen, die einzelne Zellen enthält.
- Stoppen des Verdaureaktion mit 10 ml 4 ° C, steril Dulbeccos modifiziertem Eagle Medium (DMEM, Invitrogen) plus 10% v / v hitzeinaktiviertem fötalem Rinderserum (FBS HALLO-, Invitrogen). Resuspendieren pellet und schütteln Sie die Röhre.
- Zentrifuge das Reagenzglas 5 min bei 800 UpM. Entfernen Sie den Überstand vorsichtig mit einer automatischen Pipette bis zu den letzten paar Tropfen. Verwenden Sie eine Einweg-Kunststoff-Pipette für den letzten Tropfen zu vermeiden Resuspendieren des Pellets.
2. Laden von Polyglykolsäure Scaffold
- Form 2-mm lang, 5-mm Außendurchmesser zylindrischen Gerüste aus Vlies Polyglykolsäure (2-mm Blechdicke, 60 mg cm-3 Schüttdichte; Porosität> 95%, Concordia Fibers, Coventry RI) wie in Lit. beschrieben. 4.
- Schneiden Sie die distalen 2 mm eines Einweg 1.000 Mikroliter Pipette mit einer Schere mit 70% Ethanol in destilliertem Wasser zubereitet kippen.
- Legen Sie das Gerüst in ein 4-Loch-Kulturplatte. Laden der organoiden Einheiten auf das Stützgerüst mit der 1000 Mikroliter-Pipette, zuerst in das Lumen und dann auf die äußere Oberfläche. Verwenden Sie eine Pinzette Beschichtung des Lumen zu gewährleisten. Nicht stören oder Aufbrechen der zylindrischen Form des Polymers.
3. Implantation in Wirt Maus
- Verwenden Sie einen syngenen Host Maus auf dem gleichen Hintergrund wie der Spender, falls verfügbar. Ansonsten beschäftigen einen immungeschwächten nonobese diabetischen / schwere kombinierte Immunschwäche oder NOD / SCID Tier (Jackson Laboratories, Sacramento CA).
- Erbrechen Vollnarkose mit Isofluran. Rasur, prep und drapieren der Maus den Bauch.
- Eine 5 mm Mittellinieneinschnitt zum Eingang in die Bauchhöhle zu gewinnen. Identifizieren und sorgfältig ausweiden das Omentum. Setzen Sie den geladenen Polymers auf das Omentum und wickeln Sie es mit dem Gewebe. Nicht reißen die Omentum.
- Sichern Sie das Polymer auf die Omentum mit einem 5-0 Monocryl Naht. Gently ersetzen Omentum mit dem gewickelt Polymer in seine anatomische Position.
- Schließen Sie den Bauchschnitt in Schichten mit 4-0 Vicryl Nähte. Führen Sie den Muskel-Verschluss und kümmern sich nicht um die Bauchorgane unterhalb des Einschnitts zu verletzen. Verwenden Knopfnähte für die Haut.
- Verwalten postoperative Analgesie mit 2 mg / kg Ketoprofen (Ketofen, Fort Dodge Animal Health) in sterilem Wasser als subkutane Quaddel neben dem Einschnitt. Die Tiere sollten täglich ausgewertet werden, und wenn das Tier zeigt Anzeichen von Schmerzen oder Leiden, eine zusätzliche Dosis von Ketoprofen können auf postoperativen Tag 2 verabreicht werden. Mit dem dritten postoperativen Tag, sollte das Tier komplett ohne Anzeichen von Schmerzen oder Leiden wiederhergestellt werden. Wenn Schmerzen oder Leiden weiter auf postoperativen Tag 3, wird dies als abnormal und sollte in Übereinstimmung mit den IACUC und Tier Betreuungseinrichtung Protokollen angesprochen werden.
- Lassen Sie die Maustaste zu erholen und das Tissue-Engineering-Darm für vier Wochen wachsen. Geben Sie das Tier ad libitum Zugang zu Nagetierfutter (Lab Diet 5001, PMI Nutrition, St. Louis MO) und Wasser mit Septra 200 mg / 40 mg pro 5 ml (Hallo-Tech Pharmacal, Amityville NY) bei einer Verdünnung von 1:100.
4. Ernte
- Humanely euthanize das Wirtstier vier Wochen nach der Implantation.
- Erneuten Öffnen der ursprünglichen Einschnitt und spiegeln die Haut kopfwärts Zugang zur Bauchhöhle erleichtern.
- Öffnen Sie die Muskulatur und Identifizierung der Tissue-Engineering-Konstrukt als eine Kugel von Gewebe.
- Nehmen Sie sich Verwachsungen der Konstrukt aus intraabdominellen Eingeweide mit scharfen Dissektion.
- Befestigen Sie das Konstrukt in Formalin für spätere Paraffin Montage oder Verwendung das Gewebe frisch biochemischen Assays wie real-time PCR-oder Protein-Isolation.
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Representative Results
Abbildung 1 zeigt eine Gesamtansicht Schema für das Protokoll dokumentiert. Das Endergebnis dieses Protokolls ist eine Kugel oder kugelförmige Struktur des Tissue-Engineering murinen Darm mit einem Lumen, Schleimhaut, submucosa, Muscularis und Umgebung. 2A zeigt eine typische Globus im Vergleich zum Ausgangsmaterial Polymergerüst. 2B zeigt dasselbe Konstrukt zweiklappigen scharf zu sein Lumen offenbaren. Abbildung 3 zeigt eine Hämatoxylin / Eosin-gefärbten Paraffin montiert Querschnitt eines typischen erfolgreichen Konstrukt nach 4 Wochen Inkubation. In Ref. 4, konnten wir Tissue-Engineering-Darm erfolgreich 89% der Zeit zu produzieren (39 von 44 Implantate).
Ein erfolgloser Konstrukt ist, bei dem keine Schleimhaut Formen. Es ist unmöglich, auf der Basis grober Erscheinungsbild bei der Ernte, ob der Globus Schleimhaut über den endgültigen histologischen Analyse haben zu beurteilen. Deshalb, wenn biochemische Assays sind performed auf der frische Gewebe Konstrukt sollte Hälfte jeder Kugel fixiert und Paraffin für die histologische Analyse montiert zu bestätigen, dass Schleimhaut in jeder Probe. Ein erfolgloser Konstrukt wird zeigen nur Stroma und Fibrose auf Hämatoxylin / Eosin-Färbung.
Abbildung 1. Schema zur Herstellung von Tissue-Engineering Darmes in der Maus. Kurz gesagt wird Spendergewebe geerntet und in organoiden Einheiten verarbeitet. Die organoiden Einheiten sind auf eine poröse Polyglycolsäure Gerüst, das dann in einen Wirt implantiert wird und man ließ sie für 4 Wochen Inkubation geladen. Das manipulierte Konstrukt wird dann abgerufen und über Histologie oder biochemischen Assays charakterisiert werden.
Abbildung 2. Beispiel Tissue-Engineering-Darm bei 4 Wochen geerntet Konstrukt. A: in Unternehmen ConstructGleich zum Start Polymergerüst. B: Das gleiche Konstrukt, zweiklappigen seine Lumen offenbaren.
Abbildung 3. Low-Power-Hämatoxylin / Eosin-Aufnahme einer typischen erfolgreichen Tissue-Engineering-Darm Konstrukt. Die Beschriftungen und Pfeile zeigen die Lumen mit Darmschleimhaut und Anhänger Host Bauchspeicheldrüse.
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Discussion
Wir präsentieren ein Protokoll zur Herstellung Tissue-Engineering-Darm der Maus über ein organoides Einheiten-on-Gerüst Ansatz. Die wichtigsten Schritte sind solche der organoiden Einheiten Zubereitung. Es ist darauf zu reinigen und ausreichend mechanisch verarbeiten das Gewebe, aber gleich ist darauf nicht overdigest oder overtriturate die organoiden Einheiten werden nach dem Verdau durchgeführt (Schritt 1.11). Wenn dies erledigt ist, die organoiden Einheiten zu Einzelzellen, die in dem Überstand von Schritt 1,12 verloren werden kann, verringert werden, und es ist unwahrscheinlich, um zu überleben Tissue-Engineering Darm produzieren würde als das intestinale Stammzellnische nicht in diese konserviert werden Fall.
Die geringe Größe der Maus macht es schwierig, direkt anastomosieren das Tissue-Engineering-Konstrukt an das Wirtstier den Darm seine Funktion in vivo zu testen. Alternativ stellt die Ratte ein größeres Modell für TESI Wachstum, das in vivo Anastomose erleichtert undbereits aus diesem Grund ein durchgeführt. Trotzdem ist die Größe des Maus keine unüberwindliche Hindernis, wie andere Lage gewesen, Dünndarmresektion und Anastomose, 6 oder anorektalen Chirurgie, 7 in diesen Tieren durchzuführen. Um diese Probleme, Experimente befassen, um die Funktion der Tissue-Engineering-Darm-Konstrukte in einem in vitro Mode prägen sind im Gange. Zusätzliche Einschränkungen dieser Technik umfassen eine 89% ige Erfolgsrate bei der Erzeugung von TESI 4. Das heißt, 89% der OU beladenen Gerüsten erfolgreich erzeugen TESI. Die Anwendung dieser Technik können durch andere zu verfeinern und zu verbessern diese Technik eine Erhöhung der Gesamtausbeute bis 100%. Darüber hinaus könnte diese Technik verbessert werden, wenn die Gesamtmenge Gewebemasse erzeugt könnte erhöht werden. Derzeit hat Durchflusszytometrie zeigte, dass die Gesamtzahl der Zellen in der geernteten TESI Konstrukt 3-fach größer als die Anzahl anwesend Implantation ist(3,07 x 10 6 ± 0,5 x 10 6) 4. Verbesserung des Volumens der TESI Produktion ist ein wichtiger Schritt in Richtung Übersetzung auf die Therapie.
Wir bemerken auch, dass die Maus Darm, sehr dünnwandigen und des kleinen Kalibers, ist besonders einfach im Vergleich zu derjenigen der anderen Arten wie Schweinen oder der Ratte zu verarbeiten. Beim Menschen erwarten wir, dass einige der Details der organoiden Einheiten Vorbereitungsschritte müßte geändert werden sowohl ausreichend verdauen das Gewebe und verhindern overdigestion um einzelne Zellen, insbesondere die Konzentrationen von Collagenase und Dispase in der Aufschlußlösung und die Zeit Verdau bei 37 ° C
Das ultimative Ziel dieser Technik ist ein Übergang zu der Humantherapie. Tissue Engineering von menschlichen Darm des Patienten das eigene Gewebe möglicherweise bieten eine dauerhafte, langfristige Heilung für Kurzdarmsyndrom (SBS) mit keiner der Nachteile der bestehenden Therapien. Short bowel syndrome ist ein Krankheitszustand durch Resektion eines signifikanten Bruchteil der Gesamtlänge des Dünndarms, üblicherweise größer als 50 bis 75 Prozent, so dass seine Absorptionsfähigkeit erheblich reduziert wird und der Patient kann keine ausreichende Nahrung von enteraler Ernährung verursacht wird. 2 Im Kinder, die häufigsten Ursachen von SBS sind massive Dünndarmresektion sekundäre nekrotisierende Enterokolitis oder Malrotation mit Dünndarm volvulus. 8,9 auch, wenn auch weniger häufig, SBS kann bei Erwachsenen, weil von mehreren Resektionen in der Einstellung von Morbus Crohn auftreten, oder mit mesenterialen Ischämie sekundäre Gefäßerkrankungen. 10,11 Da SBS-Patienten kann nicht behaupten, ausreichende Ernährung mit enteraler Aufnahme, können sie verlangen, langfristige totale parenterale Ernährung, die sich bei Kindern durch Leberversagen und Leberzirrhose kann kompliziert sein. 12 SBS-Patienten daher ertragen signifikante Kosten im Gesundheitswesen, die vor kurzem schätzungsweise in der Größenordnung von $ 1,6 Millionen pro Patientüber 5 Jahre. 13 Der aktuelle Standard der Versorgung für Darm als Folge einer SBS ist Darm-, Leber / Darm-, oder andere multiviszerale Transplantation, aber das verleiht nur eine 60% 5-Jahres-Überlebensrate und übergibt den Patienten zu einer lebenslangen Laufe der immunsuppressiven Therapie . 14 Weitere, begrenzte Spenderorgan Verfügbarkeit führt zu einer unvermeidlichen Diskrepanz in Angebot und Nachfrage und lange Wartezeiten. 15 Daher wäre Tissue Engineering aus dem Patienten körpereigenes Gewebe eine attraktive Alternative sein.
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Disclosures
Keine Interessenskonflikte erklärt.
Acknowledgments
Tracy C. Grikscheit, Erik R. Barthel, und Frédéric G. Sala von der California Institute for Regenerative Medicine (CIRM), Gewährung Zahlen RN2-00946-1 (TCG) und TG2-01.168 (ERB, FGS) unterstützt. Allison L. Speer ist eine Gesellschaft der Universität Surgeons Ethicon Gelehrter. Yasuhiro Torashima wird von einem Kinderkrankenhaus in Los Angeles Saban Institut Forschung Career Development Fellowship gefördert.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| HBSS | Gibco | 114170-112 | |
| Antibiotic-Antimycotic 100X | Invitrogen | 15240-062 | |
| Dispase | Gibco | 17105-041 | |
| Collagenase Type 1 | Worthington | LS004194 | |
| DMEM High Glucose 1X | Gibco | 11995-065 | |
| Heat inactivated FBS | Invitrogen | 16140-071 | |
| Biofelt 100% PGA | Concordia Medical | FELT01-1005 | For polymer preparation as in Ref. 4 |
| Poly-L-lactic acid | Durect | B6002-1 | For polymer preparation as in Ref. 4 |
| Type I Collagen, rat tail | Sigma-Aldrich | C3867-1VL | For polymer preparation as in Ref. 4 |
| Ketoprofen 100 mg/ml | Fort Dodge Animal Health | 71-KETOI-100-50 | |
| LabDiet 5001 rodent chow | LabDiet | 5001 | |
| Septra 200 mg / 40 mg per 5 ml, USP | Hi-Tech Pharmacal | 50383-824-16 | |
| Isoflurane, USP | Phoenix Pharmaceuticals | 57319-507-06 |
References
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