Summary
Denne artikkelen og den medfølgende videoen presenterer vår protokoll for å generere vev-konstruert tarmen hos mus ved hjelp av en organoid enheter-on-stillas tilnærming.
Abstract
Vev-konstruert tynntarmen (Tesi) har med hell blitt brukt til å redde Lewis rotter etter massive tynntarmen reseksjon, noe som resulterer i retur til preoperativ vekter innen 40 dager. 1 Hos mennesker kan massive tynntarm reseksjon resultere i kort tarm-syndrom, en funksjonell malabsorptive staten som confers betydelig sykelighet, dødelighet og helsekostnader inkludert parenteral ernæring avhengighet, leversvikt og cirrhose, og behovet for multivisceral organtransplantasjon. 2 I denne artikkelen beskriver vi og dokumentere vår protokoll for å skape vev-konstruert tarmen i en mus modell med et flercellet organoid enheter-on-stillaset tilnærming. Organoid enheter er flercellede tilslag som stammer fra tarmen som inneholder både slimhinnene og mesenchymale elementer, 3 forholdet mellom som bevarer intestinal stamcelleforskningen nisje. 4 I pågående og fremtidig forskning, overgangen med teknikken vår imus vil gi rom for undersøkelse av prosessene under Tesi formasjon ved å utnytte de transgene verktøy tilgjengelig i denne arten. 5 Tilgjengeligheten av immunsupprimerte muselinjer vil også tillate oss å bruke teknikken til menneskelig intestinal vev og optimalisere dannelsen av menneskelig Tesi som mus xenograft før sin overgang til mennesker. Vår metode benytter Good Manufacturing Practice (GMP) reagenser og materialer som allerede er godkjent for bruk hos mennesker, og derfor gir en betydelig fordel i forhold tilnærminger som er avhengige decellularized animalsk vev. Det endelige målet med denne metoden er dens oversettelse til mennesker som regenerativ medisin terapeutisk strategi for kort tarm-syndrom.
Protocol
1. Organoid Units Forberedelse
- Instrumenter som passer for mus disseksjon (saks og tang) bør steriliseres ved autoklavering.
- Humant avlive donor mus i henhold til lokale IACUC protokoller. Sørge for at dyret er dødt før du fortsetter.
- Foreta en midtlinjesnitt å få tilgang til bukhulen. Hud flaps kan bli reflektert som nødvendig for å forbedre eksponeringen.
- Eviscerate tynntarmen og dele det bare distalt for ligament av Treitz. Separer tynntarmen fra sin mesentery hjelp skarp og skånsom sløv disseksjon. Identifiser ileocecal kryss og dele tynntarmen 5 mm proksimalt for dette.
- Bruke saks, åpner tarmen lengderetningen langs antimesenteric grensen i en petriskål med 10 ml 4 ° C, steril Hanks 'saltoppløsning (HBSS, Invitrogen, Carlsbad CA) / 1X antibiotika-soppdrepende (Anti-Anti, Invitrogen) løsning. Fjerne avføring fra den åpne tarmen medforsiktig røring og deretter overføre åpnet tarm til en 15ml sentrifugerør med 10 ml av 4 ° C, sterile HBSS / 1X anti-anti.
- Vask den åpnede tarmen tre ganger i 10 ml av 4 ° C, sterile HBSS / 1X anti-anti i et reagensrør. Hver vask kan utføres med mild risting av 15 ml rør i 30 sek. Etter risting, synker tarmvevet til bunnen av røret. Forkast flytende materiale, som er mesenchymale rusk. Fjern vaskevannet forsiktig med en pipette.
- Finhakk vaskede tarmen i en petriskål med 10 ml av 4 ° C, sterile HBSS / 1X anti-anti til mindre enn 1 mm firkantede stykker ved hjelp av en saks. Samle hakket materialet opp med en automatisk pipette og legg den i et reagensrør.
- Sentrifuger røret ved 500 rpm i 8 min. Kast supernatanten, som inneholder fett og mesenchyme.
- Fordøy kvernet, vasket materiale med 10 ml sterile HBSS / 1X anti-anti pluss 0,125 mg / ml dispase (Invitrogen) og 800 enheter / ml collagenase type 1 (Worthington, Lakewood NJ). For å fremstille 40 ml av fordøyelsen løsning, veie ut 5 mg dispase, 142 mg kollagenase, og legge sterile HBSS opptil et volum av 40 ml. Forberede denne løsningen fersk hver gang organoid enheter er forberedt, og holde ved 4 ° C til den er klar til bruk. Legg fordøyelsen løsningen direkte til pellet fra trinn 1.8.
- Inkuber testrør inneholdende kvernet, vasket materiale med fordøyelsen oppløsningen ved 37 ° C i 20 min.
- Hente reagensglasset og ytterligere forstyrre fordøyd vev ved triturering med en 10 ml pipette. Gjenta mellom 20 til 50 ganger før et ensartet utseende er oppnådd.
- Sentrifuger reagensglasset i 5 min ved 800 opm. Kast supernatanten, som inneholder enkeltceller.
- Stoppe fordøyelsen omsetning med 10 ml av 4 ° C, steril Dulbeccos modifiserte Eagle Medium (DMEM, Invitrogen) pluss 10% v / v varmeinaktivert føtalt bovint serum (HI-FBS, Invitrogen). Resuspender pellet og riste røret.
- Sentrifuger reagensglasset i 5 min ved 800 opm. Supernatanten fjernes forsiktig med en automatisk pipette inntil de siste få dråper. Bruk en engangs plast pipette for de siste par dråper for å unngå risting pelleten.
2. Lasting av polyglykolsyre Scaffold
- Form 2-mm lang, 5 mm ytre diameter sylindriske stillasene fra nonwoven polyglykolsyre (2-mm platetykkelse, 60 mg cm-3 volumtetthet; porøsitet> 95%, Concordia Fibers, Coventry RI) som beskrevet i Ref. 4.
- Trim distale 2 mm av en disponibel 1000 mikroliter pipettespiss med saks forberedt med 70% etanol i destillert vann.
- Plasser stillaset til et 4-brønns dyrkingsplate. Laste organoid enhetene bort på stillaset med 1000 mikroliter pipette, først inn i hulrommet, og deretter på den ytre overflate. Bruk en pinsett for å sikre belegg av lumen. Ikke forstyrre eller bryte åpne sylindriske formen av polymeren.
3. Implantasjon i Host Mouse
- Bruk en syngeneic vert mus på den samme bakgrunnen som donor hvis tilgjengelig. Ellers benytter en immunkompromittert nonobese diabetes / alvorlig kombinert immunsupprimert eller NOD / SCID dyr (Jackson Laboratories, Sacramento CA).
- Fremkall generell anestesi med isofluran. Barbering, prep og drapere musens magen.
- Foreta en 5 mm midtlinjesnitt å få adgang til bukhulen. Identifisere og nøye eviscerate større omentum. Plasser den lastede polymer på omentum og pakk den med vev. Ikke rive omentum.
- Fest polymeren til omentet med en 5-0 monocryl sutur. Forsiktig erstatte omentum med innpakket polymer i sin anatomiske posisjon.
- Lukk abdominal snitt i lag med 4-0 vicryl suturer. Kjør muskel nedleggelse og tar seg ikke å skade abdominal viscera under snittet. Bruk avbrutt sting for huden.
- Administrer postoperativ analgesi med 2 mg / kg ketoprofen (Ketofen, Fort Dodge Animal Health) i sterilt vann som subkutan wheal tilstøtende til snittet. Dyr bør evalueres daglig, og hvis dyret demonstrerer tegn til smerte eller ubehag, kan en ekstra dose av ketoprofen gis på postoperativ dag 2. Ved den tredje postoperative dag, bør dyret være fullt restituert uten tegn på smerte eller ubehag. Hvis smerte eller ubehag fortsetter på postoperativ dag 3, regnes dette unormalt og bør behandles i samsvar med IACUC og dyr omsorg anlegget protokoller.
- Lar musen krefter og vevet konstruert tarmen til å vokse i fire uker. Gi dyret ad libitum tilgang til gnager chow (Lab 5001 Diet, PMI Nutrition, St. Louis MO) og vann med Septra 200 mg / 40 mg per 5 ml (Hi-Tech Pharmacal, Amityville NY) ved 1:100 fortynning.
4. Innhøsting
- HumaNely avlive vertsdyret fire uker etter implantasjon.
- Åpne opprinnelige snitt og reflektere huden cephalad å lette tilgangen til bukhulen.
- Åpne muskel lag og identifisere vev-konstruert konstruere som en verden av vev.
- Ta ned sammenvoksninger til konstruksjonen fra intraabdominal viscera hjelp skarp disseksjon.
- Fest konstruere i formalin for senere parafin montering, eller bruke vev frisk for biokjemiske analyser som real-time PCR eller protein isolasjon.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Figur 1 viser en generell skjema for protokollen dokumentert her. Sluttresultatet av denne protokollen er en globus eller sfærisk struktur av vev-konstruert murine tarmen med en lumen, slimhinner, submucosa, og omkringliggende muskularis. Figur 2A viser en typisk verden i forhold til en start polymer stillas. Figur 2B viser samme konstruksjon kraftig bivalved å avsløre dens lumen. Figur 3 viser en hematoxylin / eosin-beiset parafin-montert tverrsnitt av en typisk vellykket konstruksjon etter 4 ukers inkubering. I Ref. 4, var vi i stand til å produsere vev konstruert tarmen hell 89% av tiden (39 av 44 implantater).
Et mislykket konstruksjon er en der ingen mucosa former. Det er umulig å bedømme basert på brutto utseende ved høsting om verden vil ha mucosa på endelig histologisk analyse. Derfor, hvis biokjemiske analyser er performed på den friske konstruere vev, bør halvparten av hver kloden være fast og parafin montert for histologisk analyse for å bekrefte at slimhinnen er tilstede i hver prøve. Et mislykket konstruksjon vil demonstrere bare stroma og fibrose på hematoxylin / eosin farging.
Figur 1. Skjema for produksjon av vev-konstruert tarmen i musen. I korte trekk er donor vev høstet og bearbeidet til organoid enheter. De organoid enhetene er utstyrt på en porøs polyglykolsyre stillaset, som deretter implantert i en vert, og inkuberes i 4 uker. De utviklet konstruere deretter hentes og kan karakteriseres via histologi eller biokjemiske analyser.
Figur 2. Eksempel på vev-konstruert tarmen konstruere høstes på 4 uker. A: Konstruer i selskaperRison å starte polymer stillaset. B: Den samme konstruksjonen, bivalved å avsløre sine lumen.
Figur 3. Low-power hematoxylin / eosin micrograph av en typisk vellykket vev-konstruert tarmen konstruksjon. Etikettene og piler indikerer lumenet med tarmslimhinnen, og vedheftende vert bukspyttkjertelen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Vi presenterer en protokoll for å produsere vev-konstruert tarmen hos mus ved hjelp av en organoid enheter-on-stillas tilnærming. De mest kritiske trinn er de av organoid enheter forberedelse. Care må tas for å tilstrekkelig rent og mekanisk behandle vevet, men like omsorg må tas for ikke å overdigest eller overtriturate de organoid enheter etter fordøyelsen er utført (trinn 1.11). Hvis dette er gjort, kan de organoid enhetene reduseres til enkle celler, som kan gå tapt i supernatanten fra trinn 1,12, og er neppe til å overleve til produsere vev konstruert tarmen, ville som intestinal stamcelle nisje ikke beholdes i dette tilfelle.
Den lille størrelsen på musen gjør det utfordrende å direkte anastomose vevet konstruert konstruere til verten dyrets tarm for å teste sin funksjon in vivo. Alternativt representerer rotte en større modell for Tesi vekst som forenkler i vivo anastomose oghar allerede blitt utført på grunn av dette en. Likevel, er størrelsen av musen ikke en uoverstigelig hindring, som andre har vært i stand til å utføre tynntarmen reseksjon og anastomose, 6 eller anorektal kirurgi, 7 i disse dyrene. Å løse disse problemene, eksperimenter for å karakterisere funksjonen av våre vev-konstruerte intestinal konstruksjoner i en in vitro mote er pågående. Ytterligere begrensninger i denne teknikken inkluderer en 89% suksess rate i generering av Tesi 4. Det vil si 89% av OU lastet stillas vellykket generere Tesi. Anvendelsen av denne teknikken ved andre kan hjelpe avgrense og forbedre denne teknikken øker totalt utbytte på 100%. I tillegg kunne denne teknikken kan forbedres dersom den totale vev masse generert kunne økes. Foreløpig har strømningscytometri viste at det totale antall av celler i innhøstede Tesi konstruere er 3 ganger høyere enn antallet tilstede ved implantering(3,07 x 10 6 ± 0,5 x 10 6) 4. Økt volumet av Tesi produksjon er et viktig skritt mot oversettelse til terapi.
Vi merker oss også at musen tarmen, blir svært tynne vegger og små kaliber, er spesielt lett å behandle i forhold til at andre arter som svin eller rotte. Hos mennesker, forventer vi at noen av detaljene i organoid enheter forberedelse trinn måtte endres både tilstrekkelig fordøye vevet og unngå overdigestion til enkeltceller, særlig konsentrasjonen av dispase og collagenase i fordøyelsen løsning og tidspunktet for fordøyelsen ved 37 ° C.
Det endelige målet med denne teknikken er en overgang til menneskelig behandling. Tissue engineering av menneskelige tarmen fra pasientens eget vev kunne potensielt tilby en holdbar, langsiktig kur for kort tarm-syndrom (SBS) med ingen av ulempene med eksisterende terapier. Kort tarm syndrome er en sykelig tilstand forårsaket av reseksjon av en betydelig brøkdel av den totale lengde av tynntarmen, vanligvis større enn 50 til 75 prosent, slik at dens absorpsjonsevne er sterkt redusert, og pasienten kan ikke oppnå tilstrekkelig næring fra enteral ernæring. 2 I barn, de vanligste årsakene til SBS er massiv tynntarmen reseksjon sekundært til nekrotiserende enterokolitt eller malrotasjon med midgut tarmslyng. 8,9 Også, om enn mindre vanlig, kan SBS forekomme hos voksne på grunn av flere stasjonsberegninger i innstillingen av Crohns sykdom, eller med mesenteric iskemi sekundært til vaskulær sykdom. 10,11 Fordi SBS pasienter ikke kan opprettholde tilstrekkelig ernæring med enteral inntak, kan de kreve langsiktig total parenteral ernæring, som i seg selv kan være komplisert hos barn av leversvikt og skrumplever. 12 SBS pasienter derfor tåle betydelig helsekostnader, nylig estimert til å være i størrelsesorden $ 1,600,000 per pasientover 5 år. 13 Den gjeldende standarden på omsorg for intestinal svikt sekundært til SBS er intestinal, lever / tarm, eller andre multivisceral transplantasjon, men dette confers bare en 60% 5-års overlevelse og consigns pasienten til en livslang løpet av immunsuppressiv behandling . 14 Videre begrenset donor organ tilgjengelighet resulterer i en uunngåelig mismatch i tilbud og etterspørsel og lang ventetid. 15. Derfor vil tissue engineering fra pasientens autologt vev være et attraktivt alternativ.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Ingen interessekonflikter erklært.
Acknowledgments
Tracy C. Grikscheit, Erik R. Barthel, og Frédéric G. Sala støttes av California Institute for regenerativ medisin (CIRM), Grant tall RN2-00946-1 (TCG) og TG2-01168 (ERB, FGS). Allison L. Speer er en forening av University kirurger Ethicon lærd. Yashuhiro Torashima er finansiert av et barnesykehus i Los Angeles Saban Forskning Career Development Fellowship.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| HBSS | Gibco | 114170-112 | |
| Antibiotic-Antimycotic 100X | Invitrogen | 15240-062 | |
| Dispase | Gibco | 17105-041 | |
| Collagenase Type 1 | Worthington | LS004194 | |
| DMEM High Glucose 1X | Gibco | 11995-065 | |
| Heat inactivated FBS | Invitrogen | 16140-071 | |
| Biofelt 100% PGA | Concordia Medical | FELT01-1005 | For polymer preparation as in Ref. 4 |
| Poly-L-lactic acid | Durect | B6002-1 | For polymer preparation as in Ref. 4 |
| Type I Collagen, rat tail | Sigma-Aldrich | C3867-1VL | For polymer preparation as in Ref. 4 |
| Ketoprofen 100 mg/ml | Fort Dodge Animal Health | 71-KETOI-100-50 | |
| LabDiet 5001 rodent chow | LabDiet | 5001 | |
| Septra 200 mg / 40 mg per 5 ml, USP | Hi-Tech Pharmacal | 50383-824-16 | |
| Isoflurane, USP | Phoenix Pharmaceuticals | 57319-507-06 |
References
- Grikscheit, T. C., Siddique, A., Ochoa, E. R., et al. Tissue-engineered small intestine improves recovery after massive small bowel resection. Ann. Surg. 240, 748-754 (2004).
- Wales, P. W., Christison-Lagay, E. R. Short bowel syndrome: epidemiology and etiology. Sem. Ped. Surg. 19, 3-9 (2010).
- Evans, G. S., Flint, N., Somers, A. S., et al. The development of a method for the preparation of rat intestinal epithelial cell primary cultures. J. Cell Sci. 101, 219-231 (1992).
- Sala, F. G., Matthews, J. A., Speer, A. L., et al. A multicellular approach forms a significant amount of tissue-engineered small intestine in the mouse. Tiss. Eng. Part A. 17, 1841-1850 (2011).
- Speer, A. L., Sala, F. G., Matthews, J. A., Grikscheit, T. C. Murine tissue-engineered stomach demonstrates epithelial differentiation. J. Surg. Res. 171, 6-14 (2011).
- Haxhija, E. Q., Yang, H., Spencer, A. U., et al. Intestinal epithelial cell proliferation is dependent on the site of massive small bowel resection. Pediatr. Surg. Int. 23, 379-390 (2007).
- Zhao, L., Cheng, Z., Dhall, D., et al. A novel corrective pullthrough surgery in a mouse model of Hirschsprung's disease. J. Pediatr. Surg. 44, 759-766 (2009).
- Petrosyan, M., Guner, Y. S., Williams, M., et al. Current concepts regarding the pathogenesis of necrotizing enterocolitis. Ped. Surg. Int. 25, 309-318 (2009).
- Shew, S. B. Surgical concerns in malrotation and midgut volvulus. Ped. Radiol. 39, S167-S171 (2009).
- Sampietro, G. M., Corsi, F., Maconi, G., et al. Prospective study of long-term results and prognostic factors after conservative surgery for small bowel Crohn's disease. Clin. Gastroenterol. Hepatol. 7, 183-191 (2009).
- Klempnauer, J., Grothues, F., Bektas, H., Pichlmayr, R. Long-term results after surgery for acute mesenteric ischemia. Surgery. , 121-239 (1997).
- Fitzgibbons, S. C., Jones, B. A., Hull, M. A., et al. Relationship between biopsy-proven parenteral nutrition-associated liver fibrosis and biochemical cholestasis in children with short bowel syndrome. J. Ped. Surg. 45, 95-99 (2010).
- Spencer, A. U., Kovacevich, D., McKinney-Barnett, M., et al. Pediatric short bowel syndrome: the cost of comprehensive care. Am. J. Clin. Nutr. 88, 1552-1559 (2008).
- Kato, T., Tzakis, A. G., Selvaggi, G., et al. Intestinal and multivisceral transplantation in children. Ann. Surg. 243, 756-766 (2006).
- Reyes, J., Bueno, J., Kocoshis, S., et al. Current status of intestinal transplantation in children. J. Ped. Surg. 33, 243-254 (1998).
