Patch Clamp Opnamen in Binnen-oorhaar cellen geïsoleerd uit zebravis

Summary

Het doel van deze video aan te tonen procedures voor het verkrijgen van gezonde, intacte haarcellen van het binnenoor organen van volwassen zebravissen en gebruik voor patch clamp studies gericht op het karakteriseren van de biofysische eigenschappen van de voltage-gated kanalen.

Abstract

Patch clamp analyses van de voltage-gated kanalen in sensorische haarcellen geïsoleerd uit verschillende species zijn eerder beschreven ^1-4 maar video is de eerste toepassing van deze technieken om haarcellen van zebravis. Hier laten we zien een methode om gezond, intact haarcellen te isoleren van al het binnenoor eind-organen: sacculus, lagena, utriculus en halfcirkelvormige kanalen. Verder tonen we de diversiteit in haarcel grootte en morfologie en een voorbeeld van het soort patch clamp opnamen die kunnen worden verkregen. Het voordeel van het gebruik van dit zebravis modelsysteem dan andere voort uit de beschikbaarheid van zebravismutanten dat zowel gehoor en het evenwicht beïnvloeden. In combinatie met het gebruik van transgene lijnen en andere technieken die genetische analyse en manipulatie, de celisolatie en elektrofysiologische werkwijzen gebruiken geïntroduceerd moet hier meer inzicht in de rollen vergemakkelijken haarcellen plag in het bemiddelen van deze sensorische modaliteiten.

Protocol

1. Pre-experimentele Voorbereidingen

1. Neem zes oplossingen (zie tabel 1 voor samenstelling): (a) 100 ml NZR (normale zebravis Ringer's), (b) 50 ml NZR + Tricaine (MS222), (c) 10 ml NZR + BSA, (d) 100 ml Locas (laag Ca ^{2 +} oplossing), (e) 10 ml Locas + papaïne, (f) 100 ml K ^+-interne oplossing. Solutions (a), (b), (d) en (f) worden gedurende maximaal een maand bij 4 ° C. Solutions (c) en (e) worden bereid op de dag van het experiment. Alle oplossingen moeten op kamertemperatuur voordat experimenten.
2. Etiket en vul vier 35 mm Petrischalen ongeveer halverwege oplossingen (a), (c), (d) en (e).
3. Maak een dissectie gerecht door het invullen van een 60 mm petrischaal met Sylgard (Dow Corning, Midland, MI) en vervolgens het snijden van een holte in het waarmee een vis om rechtop te zitten zonder kantelen.
4. Bereid ten minste twee celisolatie instrumenten door lijmen van de follikel einde van haren die het uiteinde van een glazenPasteur pipet met superlijm, waardoor het haar voorbij het einde van de pipet te verlengen met ongeveer 0,5 cm. De haren van zacht-behaarde honden zoals Labrador Retrievers en Weimaraners werken goed.

2. Isolatie van auditieve en vestibulaire Labyrinth

1. Offer een volwassen zebravis door onderdompeling in een bekerglas met NZR + Tricaine. Visueel toezicht op de kieuwen totdat alle opercular bewegingen hebben opgehouden. Wacht een extra tien minuten voor het verwijderen van vis en spoelen met verse NZR. Deze procedures zijn goedgekeurd door de Institutional Animal Care en gebruik Comite (IACUC) van Pepperdine University, maar de vergunning moet worden verkregen van de eigen instelling.
2. Pin de vissen aan de rugzijde ontleden schotel door het inbrengen van een standaard naai rechte pen (ongeveer 2,5 cm lang) door elk oogkas en een derde pin door de dorsale-ventrale as ongeveer een derde tot de helft van de afstand van het hoofd tot staart zoals inFiguur 1A.
3. Onder een zoom (0.62-5x) stereo dissectiemicroscoop uitgerust met 10x oculairs, gebruik dan de lente schaar (Fine Science Tools catalogus nummer 15000-02) op de hersenen en een kort segment van het ruggenmerg bloot door het verwijderen van de schedel dak van een punt ongeveer 0,5 cm caudaal van het niveau van de kieuwen uit naar de neus van de vis. Snijd het ruggenmerg en til de hersenen met fijne pincet (Fine Science Tools catalogus nummer 11251 tot 30), terwijl het snijden van de spinale zenuwen en andere bijlagen, verwijder de hersenen en gooi (Figuur 1B).
4. De ventrale helft van de schedel capsule die overblijft vormt een "kom" die het binnenoor organen bevat. Let op de opvallende, witte, ondoorzichtige otolieten in de lagenas en sacculi symmetrisch gelegen aan het caudale einde van elke binnenoor en de zijdelings geplaatste utriculus otolieten meer rostraal (Figuren 1C en 4A).
5. Verwijder de kom van het bot door te snijden alle ventrale en laterale attachments terwijl voorzichtig op te tillen het uit het hoofd met fijne pincet. Plaats deze in de petrischaal met Locas (Figuren 1D en 4B).
6. Gebruik van twee paar fijne forceps, kraken elkaar de kom de middellijn door ofwel grijpen de zijranden van het bot los te trekken of als alternatief, het scheiden van de rechter en linker helften door inbrengen van de punten van de forceps in het centrum en breekijzer helften apart. Verwijder de twee labyrinten van het bot met fijne pincet (Figuur 2).
7. Controleer de labyrinten van de auditieve en vestibulaire eind-organen te identificeren: de halfcirkelvormige kanalen, utricles, sacculi en lagenas (Figuur 4C). De roze gebieden onder elke otoliet zijn de maculae met de haarcellen. Ook een strook roze in de ampoules de halfcirkelvormige kanalen worden de cupula waar de haarcellen bevinden.
8. Verwijder voorzichtig de otolieten van de lagena en utriculus met behulp van de fijne pincet (

3. Hair Cell Isolation

1. Met een kunststof transferpipet (Fisher Scientific Catalogus nummer 13-711-9AM), de eindorganen naar het schaaltje met Locas + papaïne minimaliseren de hoeveelheid fluïdum overgebracht.
2. Incubeer deze structuren in deze oplossing gedurende dertig minuten bij kamertemperatuur.
3. Aan het einde van de incubatieperiode verplaats de structuren het schaaltje met NZR + BSA en incubeer in deze oplossing gedurende ten minste dertig minuten. Haarcellen zullen gezond te blijven in deze oplossing voor maximaal vier uur, maar zal verslechteren na 1-2 uur na isolatie (zie volgende stappen).
4. Ter voorbereiding van celisolatie, verplaatst u een van de eind-organen het schaaltje met NZR.
5. Voor de lagenas en utricles, gebruik dan een hond haar om voorzichtig tillen van de maculae-bladen van roze epitheliale tissue de haarcellen (Figuur 3A) bevat. De maculae kunnen worden uitgehold (met behulp van een hond haar) van onder de otolieten van de sacculi, en de cupulae van hun locaties in de ampullen van de halfcirkelvormige kanalen.
6. Met twee celisolatie hulpmiddelen bereid in stap 1.4, vermalen of een macula cupula een puingebied de haarcellen (Figuur 3B) bevat genereren. Laat de cellen ten minste vijf minuten op de bodem van de schaal te regelen voordat het.
7. Verplaats de schotel naar de fase van een omgekeerde microscoop uitgerust met fasecontrast optiek. Let cellen onder 40x vergroting en let op de diversiteit in morfologie. Veel cellen zijn avocado-vormig, terwijl anderen zijn lang en dun. De aanwezigheid van apicale haarbundels identificeert ze als haarcellen en fase-helderheid verzekert hun gezondheid. Microfoto van geïsoleerde haarcellen zijn weergegeven in figuur 5.

4. Patch Spannen zebravis haarcellen

1. Ter voorbereiding van perfonominaal patch opnames ^5,6, voor te bereiden amfotericine-bevattende interne oplossing als volgt: plaats 5 mg amfotericine B (Sigma A4888) in een 1,5 ml microcentrifugebuis en vul aan met 100 ul DMSO. Onmiddellijk vortex deze oplossing gedurende 10-20 seconden totdat alle amfotericine opgelost. Vervolgens pipet 625 pi K ^+-interne oplossing in een tweede microcentrifugebuis. Voeg 10 ul van de oplossing van het amfotericine K ^+-oplossing en interne vortex als hierboven. De voorraad amfotericine oplossing zal duren enkele uren, maar gooi de uiteindelijke oplossing na een uur.
2. Vervaardig patch pipetten van BF 150-86-10 borosilicaatglas (Sutter Instruments) met behulp van een multi-stage trekker (Sutter P-1000). Pipetten moeten tip diameters van ongeveer 2 um en MQ hebben weerstanden van 1-3 met de oplossingen in tabel 1. De instellingen op de trekker die goed werken zijn als volgt: Heat = Ramp minus10, Pull = 0, Velocity = 18, Delay = 1, Druk = 600. De vorm vande punt van een pipet goed blijkt uit de foto in de inzet van figuur 5 c. Blunt "kogelvormige" pipetten hebben de voorkeur want ze bieden de minste toegang weerstand tijdens elektrofysiologische opnamen.
3. Gebruik een 28 gauge Microfil injectienaald (MF28G-5; Wereld Precisie-instrumenten) om een registratie-elektrode halverwege vullen met het amfotericine-bevattende K ^+-interne oplossing.
4. Bevestig de elektrode met de headstage een patch clamp-versterker. Toepassing -10 mV, 10 ms spanning treden bij 10 Hz en onderhouden positieve druk in de elektrode wordt gemanoeuvreerd door de lucht / oplossing interface naar de onderkant van de opname schotel bij de cellen.
5. Orthogonaal Plaats de elektrode om een ​​gezond uitziende cel. Wanneer de elektrode dicht genoeg bij de cel zodat het begint weg van de uit-stromende oplossing snel herstellen van de druk van een lichte onderdruk op de elektrode tot de cel "jumps" erop. Onmiddellijk te staken zuigkracht op the elektrode en toepassen die potentiaal van -70 mV aan de binnenkant van de elektrode. Binnen een paar seconden een gigaohm zegel zal vormen.
6. Let op de capacitieve stroom transiënten bij het begin en einde van de spanning stappen die verschijnen snel na afdichting vorming. Blijf de perforatie van het membraan te controleren onder de elektrode door de amfotericine door te kijken naar de passanten groeien in omvang tot hun maximale grootte (in ongeveer tien minuten).
7. Om de oprichting van whole-cell (geperforeerd)-configuratie in een gezonde cel te bevestigen, te lokken naar buiten K ⁺ stromen door het toepassen van hyperpolariserende en depolariserende stappen van spanning. De meeste haarcellen hebben opvallende uiterlijke stromen (zie figuur 6).

5. Representatieve resultaten

Figuur 4 toont beelden die tijdens de stappen van celisolatie. In paneel A kan de otolieten worden geassocieerd met het lagenas, saccluli en utricles te zien through de dunne laag van bot dat ligt over hen. Deze ondoorzichtige structuren bieden handige oriëntatiepunten om te helpen bij de veilige verwijdering van de eindorganen van het dier tijdens de volgende stappen van de dissectie. Paneel B toont de "kom" van het bot dat het intacte labyrinten en de prominente otolieten in de utricles, lagenas en sacculi bevat. Paneel C toont een labyrint dat is verwijderd uit het bot. Let op de grote otoliet met de geschulpte rand in de lagena, de ijspegel-vormige otoliet in de sacculus en de boonvormige otoliet in de utriculus. Sommige van de diversiteit in grootte en morfologie gezien in cellen geïsoleerd uit de lagena wordt geïllustreerd in figuur 5. Een gezonde cel wordt gemakkelijk geïdentificeerd als zijnde fase helder met een scherpe rand. Cell vormen kunnen grofweg worden verdeeld in twee klassen: avocado-vormige (avo) en lang en dun (THN), hoewel de grootte van de cellen binnen elke groep kan sterk variëren (vergelijk bijvoorbeeld avo 1 en avo 3). Inzet toont een cluster vandrie cellen die niet volledig geïsoleerd van elkaar. De zwarte kleur en korrelig uiterlijk van de cel in inzet b identificeert gemakkelijk deze cel dood. C inzet toont de punt van een pipet patch illustreert de vorm en afmetingen geschikt voor het opnemen van deze cellen.

De huidige sporen figuur 6 werden verkregen in reactie op hyperpolariseren en depolariserende stappen van potentiële opgelegd aan lagena soortgelijke cel het avo 2 weergegeven in figuur 5. Huidige reacties in cellen van verschillende maten en vormen kunnen sterk verschillen suggereren diversiteit in het complement van voltage-gated kanalen.

Figuren 1-3: Cartoons stappen illustreert de isolatie van haarcellen.

Figuur 1. Verwijdering van de schedel capsule met het binnenoor labyrinten van zebravissen. A. Pin opgeofferd zebravis dorsale zijde tot ontleden schotel. B. Open schedel, te verwijderen en gooi hersenen. C. Let op otolieten in utricles, lagenas en sacculi. D. Verwijder ventrale deel van de schedel capsule, die de labyrinten.

Figuur 2. Verwijdering van labyrinten van schedel capsule. A. Crack uit elkaar schedel capsule op zijn middellijn. B. Verwijder labyrinten van bot. C. Verwijder de otolieten van de lagenas en utricles behulp van een tang.

Figuur 3. Isolatie van haarcellen van labyrinten. A. Til off maculae met een hond haar. B. Tritureer maculae met twee honden haren. C. Gebruik geïsoleerd haarcellen voor patch-clamp.

Figuur 4. Images tijdens stappen isolatie van afzonderlijke cellen. A. Na verwijdering van de hersenen, de otolieten geassocieerd met de twee lagenas en sacculi (pijlen) en utricles (pijlpunten) kan worden gevisualiseerd. B. Na verwijdering van het ventrale gedeelte van de schedel capsule dat het binnenoor organen van het dier bevat. De cartoon in de rechter helft van B identificeert de locaties van de linker utriculus, lagena en sacculus. De stippellijn geeft de globale positie van de linker labyrint. C. Rechts labyrint (mediaal aanzicht) D: Cartoon tekening van de belangrijkste delen van labyrint in C. a: voorste semiRingvaart, b: horizontaal kanaal, c: het achterste kanaal, d: utriculaire otoliet, e: zakvormig otoliet, f: lagenal otoliet. Schaalbalk in D is 1 mm voor A en B, 0,5 mm voor C en D.

Figuur 5 Geïsoleerde, gezonde cellen van lagena illustreert de diversiteit van morfologie; avo:. Avocado gevormde cellen; thn: lange, dunne cellen. Inzet van een: cluster van drie onvolledig geïsoleerde cellen; inzet b: dode cel; inzet c: punt van patch elektrode gebruikt in elektrofysiologische opnamen van zebravissen haarcellen. Scale bar = 20 urn is van toepassing op de hoofdfiguur en alle inlegwerk.

Figuur 6. Stromingen opgenomen in een patch geklemde haar cel. Gemiddelde respons in een cel (t vergelijkbaaro avo 2 in figuur 5) drie presentaties van spanningsverschillen toegepast in 10 mV stappen van -140 mV tot +70 mV van een bedrijf potentiaal van -70 mV. Noteer de inactiverende stroom die verschijnt gedepolariseerd meer mogelijkheden. Spanningssprong magnitudes naast aantal sporen aangegeven.

Discussion

Zorgvuldige dissectie van de eindorganen en zachte behandeling van de cellen is cruciaal voor de succesvolle isolatie van gezonde, intacte en fysiologisch actieve haarcellen. Vasthouden aan de volgende tips zal ervoor zorgen succes:

1. Het is gemakkelijker te verkrijgen gezonde cellen van kleinere vissen (2-2,5 cm in lengte). Grotere vissen hebben veel meer vet druppeltjes die obscure visualisatie tijdens de dissectie proces.
2. Zorg moet worden genomen bij het verwijderen van de otolieten, die de haarcellen liggen boven. Vermijd het aanraken van de cellen bij het grijpen van de otolieten met een pincet.
3. De beste resultaten worden verkregen wanneer de maculae en cupulae worden opgetild zoals lakens en de cellen van het epitheel getritureerd.
4. Wij vinden het gebruik van haren die cellen vermalen superieur aan andere methoden, waaronder met menselijke wimpers ⁷ die niet zo taps en minder flexibel.
5. Tijdens patch klemming toepassing van positieve druk thij elektrode als het door de lucht / oplossing interface belangrijk om de tip te reinigen. De vrijgave van de positieve druk naar de cel mogelijk te "springen" op de elektrode van belang. Deze methode verwijdert een klein volume van amfotericine-bevattende oplossing afstand van de tip, waardoor de kans op het vormen van een afdichting met gigaohm de cel. In onze experimenten met de geperforeerde patch opnametechniek plaats van de traditionele volledige cel configuratie vanwege de kwetsbaarheid van de cellen. Proberen "go whole cell" resulteert vaak in het verlies van de gigaohm afdichting.

De methode die hier beschreven zal opleveren honderden gezonde haarcellen per dier. De techniek kan worden uitgevoerd bij kamertemperatuur en vereist geen speciale apparatuur dan een ontleedmicroscoop. Een eerdere rapport in Jove beschrijft de dissectie van het binnenoor in de zebravis met behulp van een ventrale benadering ^8. Deze auteurs tonen de Dissectie van geheel paraformaldehyde gefixeerde binnenoor organen. We moedigen de lezer om deze video te bekijken voor de vergelijking met onze werkwijze. Een voordeel van de hier gepresenteerde methoden is het verkrijgen van levende cellen nuttig voor fysiologische onderzoeken. Naast het gebruik in patch clamp experimenten de voltage-gated kanalen bestuderen (zoals hier getoond) het gebruik van deze cellen kunnen worden uitgebreid naar cel resonantie ^9,10, monitor neurotransmitter afgifte bestuderen door capaciteitsmetingen ^11,12, onderzoeken neuromodulatie geïnduceerd door de activering van ligand gated kanalen ¹³ en boren in de schat aan informatie die kan worden afgeleid uit het gebruik mutanten die zowel gehoor en evenwicht ¹⁴ beïnvloeden.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
(a) NZR (Normal Zebrafish Ringer's) (in mM)	116 NaCl, 2 KCl, 2 CaCl2, 3 Glucose, 5 Na+-HEPES, pH 7.35.
(b) NZR + Tricaine	NZR + 0.02% 3-aminobenzoic acid ethyl ester methane sulfonate (Sigma A5040).
(c) NZR + BSA	NZR + 0.4% Bovine Serum Albumin (Sigma A2153).
(d) LoCaS (Low Ca2+ Solution) (in mM)	100 NaCl, 2 KCl, 0.05 CaCl2, 0.05 MgCl2, 3 Glucose, 30 Na+-HEPES, pH 7.35.
(e) LoCaS + papain	LoCaS + 0.05% L-cysteine (Sigma C1276) + 0.2% papain (Sigma P3375).
(f) K+-internal solution (in mM)	52 K2SO4, 38 KCl, 1 K+-EGTA, 5 K+-HEPES, pH 7.3.
Table 1. Solutions.