הקלטות קלאמפ תיקון בתאי שיער באוזן פנימיים מבודדות מדג הזברה

Summary

מטרת סרטון זה היא להדגים הליכים לקבלת תאי שיער בריאים, ללא פגע מהאיברים הפנימיים של דג זברת האוזן בוגר ולאחר מכן להשתמש בם ללימודים מהדקים תיקון שנועדו לאפיין את מאפייני biophysical של ערוציהם מתח המגודרים.

Abstract

ניתוחי תיקון מהדק של ערוצי מתח המגודרים בתאי שיער חושיים שבודדו ממגוון מינים שתוארו קודם לכן ^1-4 אבל הסרטון הזה מייצג את היישום הראשון של השיטות הללו לתאי שיער מדג הזברה. כאן אנו מדגימים שיטה לבודדה תאי שיער בריאים, ללא פגע מכל הקצה, אברי האוזן הפנימיים: שקיק, lagena, utricle ותעלות קמורות. יתר על כן, אנחנו מדגימים את הגיוון בגודל והמורפולוגיה של תאי שיער ולתת דוגמה של סוגי הקלטות מהדקות תיקון שניתן להשיג. היתרון של השימוש במערכת מודל דג זברה זה על פני אחרים נובע מהזמינות של דג זברת מוטציות המשפיעות על שמיעה ושיווי משקל. בשילוב עם השימוש בקווים מהונדסים וטכניקות אחרות שעושות שימוש בניתוח גנטי ומניפולציות, בידוד התא ושיטות אלקטרו הציג כאן צריך להקל על תובנה רבה יותר לתוך תאי שיער תפקידי pשכב בתיווך מערכות חוש אלו.

Protocol

1. הכנות שלפני ניסוי

1. הכן 6 פתרונות (ראה טבלה 1 ליצירות): (א) 100 המ"ל NZR (דג זברת צלצול של רגיל), (ב) 50 המ"ל NZR + Tricaine (MS222), (ג) 10 המ"ל NZR + BSA; (ד) 100 לוקאס המ"ל (נמוך Ca ^{2 +} פתרון), (ה) 10 המ"ל לוקאס + פפאין, (ו) 100 המ"ל K ^+-פתרון פנימי. פתרונות (א), (ב), (ד) (ו) ניתן לאחסן לתקופה של עד חודש אחד ב 4 ° C. פתרונות (ג) ו (ה) צריכים להיות מוכנים ביום ההתנסות. כל הפתרונים צריכים להיות בטמפרטורת חדר לפני תחילת ניסויים.
2. תווית ולמלא ארבעה 35 צלחות פטרי מ"מ בערך באמצע עם פתרונות (א), (ג), (ד) ו (ה).
3. הפוך מנה לנתח באמצעות מילוי צלחת פטרי 60 מ"מ עם Sylgard (Dow Corning, Midland, MI) ולאחר מכן חיתוך חלל לתוכו, שיאפשר לדגים לשבת זקוף בלי להטות מעל.
4. הכן לפחות שני כלי בידוד תא על ידי ההדבקה של סוף זקיק שיער כלב לסוף כוספסטר פיפטה בדבק מגע, ומאפשרת את השיער כדי להאריך מעבר לקצה פיפטה בכ 0.5 סנטימטר. ההשערות מכלבים רכי פרווה כמו לברדור רטריבר וWeimaraners לעבוד היטב.

2. בידוד של שמיעה ושיווי משקל מבוך

1. להקריב דג זברה מבוגרת אחד על ידי טבילה בכוס המכילה NZR + Tricaine. חזותי לנטר את הזימים עד שכל תנועות opercular חדלו. מתן עשר דקות נוספות לפני ההסרה ושטיפת דגים עם NZR טרי. נהלים אלה אושרו על ידי הטיפול בבעלי החיים המוסדי והשתמשו ועדה (IACUC) מאוניברסיטת פפרדין אבל אישור יש לקבל מהמוסד שלך.
2. להצמיד את הדג לביתור צד הגבה צלחת על ידי החדרת סיכה אחת סטנדרטית תפירה ישר (כ -2.5 סנטימטרים) באמצעות כל שקע עין וסיכה שלישית דרך הציר הגבה-הגחון כשליש למחצית מהמרחק מהראש לזנב כפי שמודגם באיור 1 א '.
3. תחת זום (0.62-5x) מיקרוסקופ לנתח סטריאו המצויד בעינית 10x, להשתמש במספריים באביב (כלי מדע פיין מספר קטלוג 15000-02) לחשוף את המוח וקטע קצר של חוט השדרה על ידי הסרת גג הגולגולת מנקודה כ 0.5 סנטימטר זנב לרמה של הזימים קדימה לאפו של הדג. חותך את חוט השדרה והרם את המוח עם מלקחיים עדינים (כלי מדע פיין מספר קטלוג 11251-30) בעת גזירת העצבים בעמוד השדרה ובקבצים מצורפים אחרות; להסיר את המוח ולהשליך (1B איור).
4. מחצית הגחון של כמוסת הגולגולת שנותרה יוצרת "קערה" המכילה את האיברים באוזן הפנימי. הקפד על otoliths הבולט, הלבן, האטום בlagenas וsacculi ממוקם בצורה סימטרית בסוף הזנב של כל אוזן פנימית ואת מיקומו otoliths הרוחבי utricle יותר rostrally (האיורים 1C ו4A).
5. הסר את הקערה של עצם על ידי חיתוך כל attachmen הגחון ורוחבts תוך הרמתו בעדינות אל מחוץ לראש עם מלקחיים עדינים. הנח אותו לתוך צלחת פטרי המכילה לוקאס (1D דמויות ו4B).
6. שימוש בשני זוגות של מלקחיים עדינים, להתנפץ לרסיסים את הקערה בקו האמצע שלה על ידי גרירת שני קצוות לרוחב של העצם ומושך אותם בנפרד או לחלופין להפריד את חצי הימניים ושמאליים על ידי הוספת נקודות של המלקחיים במרכז ובחטטני את החצאים זה מזה. הסר את שני מבוכים מעצם שימוש במלקחיים עדינים (איור 2).
7. בדוק את המבוכים לזהות השמיעתי ו- end איברי שיווי משקל: תעלות החצי העגולות, utricles, sacculi וlagenas (האיור 4C). אזורי רדרדים מתחת לכל אבן אוזן הם maculae המכיל את תאי שיער. כמו כן, רצועה של ורוד בתוך ampullae של תעלות החצי העגולות מזהה cupula שבו תאי השיער נמצאים.
8. מוציא בזהירות את otoliths מlagena וutricle באמצעות מלקחי הקנס (

3. בידוד תאי שיער

1. באמצעות העברת פלסטיק פיפטה (מספר פישר סיינטיפיק קטלוג 13-711-09:00), להזיז את איברי קצה הקערה ובה לוקאס + פפאין מזעור נפחיו של נוזל מועבר.
2. דגירת מבנים אלה בפתרון זה עבור 30 דקות בטמפרטורת חדר.
3. בתום תקופת הדגירה, להעביר את המבנים לצלחת המכילה NZR + BSA ודגירה בפתרון זה במשך לפחות 30 דקות. תאי שיער יישארו בריאים בפתרון זה לתקופה של עד ארבע שעות, אך ידרדרו לאחר 1-2 שעות לאחר בידוד (ראה שלבים הבאים).
4. כהכנה לבידוד תא, להעביר אחד מאיברי הקצה לצלחת המכילה NZR.
5. לlagenas וutricles, השתמש שיער כלב בעדינות כדי להרים את maculae גיליונות של TI אפיתל ורדרדssue שמכיל את תאי שיער (איור 3 א). ניתן גרף maculae החוצה (באמצעות שיער כלב) מתחת לotoliths של sacculi, וcupulae ממקומותיהם בתוך ampullae של התעלות הקמורות.
6. שימוש בשני כלי תא בידוד שהוכנו בשלב 1.4, triturate המקולה או cupula ליצירת שדה פסולת המכיל את תאי שיער (איור 3 ב '). אפשר התאים לפחות חמש דקות ליישוב על תחתית הצלחת לפני שעבר אותו.
7. להעביר לצלחת השלב של מיקרוסקופ ההפוך מצוידים באופטיקה לעומת השלב. ציית לתאים בהגדלת 40X ושים לב לגיוון במורפולוגיה. תאים רבים אבוקדו בצורה ואילו אחרים הם ארוכים ודקים. הנוכחות של צרורות שיער apical מזהה אותם כתאי שיער ושלב בהירות מבטיחה את בריאותם. Photomicrographs של תאי שיער מבודדים מוצגים באיור 5.

4. תיקון Clamping תאי שיער דג זברה

1. במסגרת הכנות לperfoמדורגות תיקון הקלטות ^5,6, להכין תמיסה הפנימית amphotericin המכיל כדלקמן: המקום 5 מ"ג amphotericin B (סיגמה A4888) לתוך צינור microcentrifuge מ"ל 1.5 ומלאו עם DMSO μl 100. מייד מערבולת פתרון זה עבור 10-20 שניות עד שכל amphotericin נמס. ואז, פיפטה μl 625 K ^+-פתרון פנימי לתוך צינור microcentrifuge שני. הוסף 10 μl של פתרון amphotericin לפתרון K ^+-פנימי ומערבולת כאמורה לעיל. פתרון amphotericin המניות יימשך שעות אחדויות, אבל להשליך את הפתרון הסופי לאחר שעה אחת.
2. לפברק pipettes תיקון מBF 150-86-10 ורוסיליקט זכוכית (סאטר מכשירים) באמצעות חולץ רב שלבים (סאטר P-1000). Pipettes צריך להטות קוטר של כ 2 מיקרומטר ויהיה התנגדויות של 1-3 MΩ את הפתרונים בטבלה 1. הגדרות על החולץ שעובד טוב הנם כדלקמן: חום = הרמפה minus10, משוכה = 0, מהירות = 18, עיכוב = 1, לחץ = 600. הצורה שלקצה פיפטה טובה ניכר מהתצלום בג ההבלעה של איור 5. pipettes בלאנט "בצורת קליע" הם העדיפו כפי שהם מציעים גישת התנגדות לפחות במהלך הקלטות אלקטרו.
3. השתמש במחט 28 מד Microfil מזרק (MF28G-5; מכשירי Precision העולם) למלא האלקטרודה הקלטה באמצע הדרך עם K amphotericin המכיל פתרון ^{+-פנימי.}
4. להדביק את האלקטרודה לheadstage של מגבר מהדק תיקון. החל -10 mV, 10 צעדים במתח ms 10 הרץ ולשמור על לחץ חיובי באלקטרודה כפי שהוא תמרן דרך ממשק האוויר / פתרון ועד לתחתית של צלחת ההקלטה ליד התאים.
5. מקם את האלקטרודה orthogonally לתא מראה בריא. כאשר האלקטרודה היא קרובה מספיק לתא כך שהוא מתחיל להתרחק מהפתרון החוצה זורם, להפוך במהירות את הלחץ, החלת ואקום קל לאלקטרודה עד התא "קופץ" עליו. מייד להפסיק את היניקה על ההאלקטרודה הדואר ולהחיל פוטנציאל החזקת -70 mV לחלק הפנימי של האלקטרודה. בתוך כמה שניות חותם gigaohm יהווה.
6. שים לב העוברים הנוכחיים הקיבולים, בתחילתם וסיומם של שלבי המתח המופיעים מייד לאחר היווצרות חותם. המשך לעקוב אחר הניקוב של הקרום מתחת האלקטרודה ידי amphotericin על ידי צפייה בעוברים לגדול בגודל לגודל המרבי שלהם (בכעשר דקות).
7. כדי לאשר את הקמתה של תצורה כל התאים (מחורר) בתא בריא, לעורר K ⁺ זרמים חיצוניים על ידי יישום hyperpolarizing וdepolarizing צעדים של מתח. רוב תאי שיער חיצוניים יש זרמים בולטים (ראה איור 6).

5. נציג תוצאות

איור 4 מראה תמונות שצולמה במהלך השלבים של בידוד תא. בפנל, את otoliths קשורים לlagenas, saccluli וutricles ניתן לראות through השכבה הדקה של העצם שoverlies. מבנים אטומים אלה מספקים ציוני דרך נוחים כדי לסייע בהסרה הבטוחה של איברי הקצה, מהחיה במהלך השלבים המאוחרים יותר של הניתוח. לוח ב 'מציג את "הקערה" של עצם המכילה את מבוכיו השלמים ואת otoliths הבולט בutricles, lagenas וsacculi. לוח C מראה מבוך שהוסר מהעצם. שים לב אבן אוזן הגדולה עם את השוליה בlagena, אבן אוזן נטיף קרח בצורה בשקיק ואבן אוזן צורת השעועית בutricle. חלק מהגיוון בגודל ומורפולוגיה ראתה בתאים מבודדים מlagena מודגם באיור 5. תא בריא מזוהה בקלות כשלב בהיר עם היקף חד. צורות סלולריות ניתן לחלק באופן גס לשני סוגים: אבוקדו בצורה (AVO) וארוכים ודקים (thn) למרות שהגודל של תאים בתוך כל קבוצה יכול להשתנות במידה ניכרת (השווה לדוגמא 1 AVO וAVO 3). הבלעה מציגה מקבץ שלשלושה תאים שאינם מבודדים לחלוטין אחד מהשני. הצבע השחור והמראה פרטני של התא בב הבלעת קלות מזהים תא זה מת. ג הבלעה מראה את קצה פיפטה תיקון הממחישה את הצורה והממדים המתאימים להקלטה מתאים אלה.

העקבות הנוכחיות מוצגות באיור 6 התקבלו בתגובה לhyperpolarizing וdepolarizing מדרגות הפוטנציאל שהוטלו על תא דומה לAVO 2 מוצג באיור 5 lagena. תגובות נוכחיות בתאים בגדלים ובצורות שונים יכולות להשתנות מציעות מגוון נרחב של ערוצי משלימי מתח מגודרים.

איורים 1-3: קריקטורות הממחישות שלבים בבידוד של תאי שיער.

איור 1. הסרה של גולגולת capsule המכיל את מבוכי האוזן הפנימיות מדג הזברה.. הפין הקריב צד הגבה דג זברה לנתח עד צלחת. ב '. גולגולת פתוחה, להסיר ולסלק מוח. ג. שימו לב otoliths בutricles, lagenas וsacculi. D. הסרת חלק גחון של כמוסה המכילה את מבוכי גולגולת.

איור 2. הסרת מבוכים מכמוסת גולגולת.. לפצח את כמוסת גולגולת בקו האמצע שלה. ב. הסר מבוכים מעצם. ג. הסר את otoliths מlagenas וutricles באמצעות מלקחיים.

איור 3. בידוד של תאי שיער ממבוכים.. רם בעדינות את האמאculae עם שערות של כלב. ב '. Triturate maculae עם שתי שערות של כלב. ג משתמש תאי שיער מבודדים למהדק תיקון.

איור 4. תמונות צולמו במהלך שלבים בבידוד של תאים בודדים. א לאחר ההסרה של המוח, הקשורים לotoliths שתי lagenas וsacculi (חיצים) וutricles (ראשי חץ) ניתן דמיין. B. לאחר הסרת הגחון חלק מגולגולת הכמוסה המכילה את האיברים באוזן הפנימי מבעלי החיים. הקריקטורה במחצית הימנית של B מזהה את מיקומם של utricle השמאל, lagena ושקיק. הקו המקווקו מציין את המיקום המשוער של מבוך השמאל. ג. מבוך עכבר (תצוגה המדיאלי) D: ציור קריקטורה הממחיש חלקים מרכזיים של מבוך ב-C. : חצי קדמימעגלית תעלה, ב: תעלה אופקית, ג: תעלה אחורית, ד: utricular אבן האוזן, דואר: saccular אבן אוזן, f: lagenal אבן אוזן. סרגל קנה מידה בD מייצג 1 מ"מ לA ו-B, 0.5 מ"מ לC ו-D

איור 5, תאים בריאים מבודדים מlagena הממחיש את המגוון של מורפולוגיה; AVO:. תאים בצורת אבוקדו; thn: תאים, ארוכים ודקות. הבלעה: אשכול של שלושה תאים מבודדים חלקי; הבלעה ב: תאים מתים; ג הבלעה: קצה אלקטרודה תיקון השתמש בהקלטות אלקטרו מתאי שיער דג זברה. סרגל קנה מידה = 20 מיקרומטר חל על הדמות הראשית וכל השיבוצים.

איור 6. זרמים שנרשמו בתיקון הדקו תא שיער. תגובות בממוצע בתא (t הדומהo AVO 2 באיור 5) לשלוש מצגות של צעדי מתח יושמו בהפרשים קבועים של 10 MV מ-140 mV עד +70 mV מפוטנציאל החזקת -70 mV. שים לב לנוכחי inactivating שמופיע בפוטנציאל depolarized עוד. בהירויות צעד מתח מוצגות לצד כמה מהעקבות.

Discussion

נתיחה מדוקדקת של איברי הקצה והטיפול העדין של התאים היא קריטית לבידוד המוצלח של תאים בריאים, שלמים ופעילים מבחינה פיזיולוגית לשיער. דבקות את הטיפים הבאים תבטיח הצלחה:

1. קל יותר להשיג תאים בריאים מדגים קטנים (2-2.5 סנטימטר אורך). דגים גדולים יותר יש טיפי שומן רבים יותר שלא ברורה להדמיה במהלך תהליך הנתיחה.
2. יש להקפיד בעת הסרת otoliths, אשר לשכב תאי השיער. הימנע ממגע עם התאים כאשר תופסים את otoliths עם מלקחיים.
3. התוצאות הטובות ביותר מתקבלות כאשר maculae וcupulae ניתקים כגיליונות והתאים, נכתשו מהאפיתל.
4. אנו מוצאים את השימוש בשיער כלב לtriturate תאים להיות עדיף על שיטות אחרות, כוללים שימוש בריסי אדם ⁷ שאינם מחודדים וכפחות גמישים.
5. במהלך התיקון Clamping, הפעלת לחץ חיובי לtהוא אלקטרודה כשהוא עובר דרך ממשק האוויר / פתרון חשוב לשמור על הקצה נקי. שחרורו של הלחץ החיובי כדי לאפשר לתא "לקפוץ" על האלקטרודה הוא גם חשוב. שיטה זו מנקה את נפח קטן של תמיסה המכילה amphotericin מרחק מהקצה, ובכך להגדיל את הסיכוי ליצירת חותם gigaohm עם התא. בניסויים שלנו אנו משתמשים בטכניקת הקלטת התיקון המחוררת במקום תצורה המסורתית יותר כל התאים בגלל השבריריות של התאים. מנסה "ללכת עד תא" לעתים קרובות תוצאות בהפסד של חותם gigaohm.

השיטה המתוארת כאן תניב מאה תאי שיער בריאים לכל חיים. הטכניקה יכולה להתבצע בטמפרטורת חדר ולא דורשת ציוד מיוחד מעבר למיקרוסקופ לנתח. דו"ח קודם ביופיטר מתאר את הנתיחה של האוזן הפנימית בדג הזברה בגישה הבטנית ^8. מחברים אלה מדגימים dissection של איברים שלמים, paraformaldehyde-קבועי אוזן פנימיים. אנו מעודדים את הקורא לצפות בסרטון זה לצורך ההשוואה עם השיטות שלנו. אחד יתרונות של השיטות שהוצגו כאן הוא הקבלה של תאים שימושיים לחקירות פיסיולוגיות בשידור חיים. מלבד השימוש בם בניסויים מהדקים תיקון ללמוד את ערוצי מתח המגודרים (כפי שמוצג כאן) את השימוש בתאים אלה ניתן להאריך ללמוד תהודת תא ^9,10, שחרור הנוירוטרנסמיטר לפקח על ביצוע מדידות קיבול ^11,12, לחקור neuromodulation הנגרם על ידי ההפעלה של ערוצי יגנד המגודר ^13, כמו גם לנצל את השפע של מידע שניתן ללמוד מן השימוש במוטציות המשפיעות על שמיעה ושיווי משקל ^14.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
(a) NZR (Normal Zebrafish Ringer's) (in mM)	116 NaCl, 2 KCl, 2 CaCl2, 3 Glucose, 5 Na+-HEPES, pH 7.35.
(b) NZR + Tricaine	NZR + 0.02% 3-aminobenzoic acid ethyl ester methane sulfonate (Sigma A5040).
(c) NZR + BSA	NZR + 0.4% Bovine Serum Albumin (Sigma A2153).
(d) LoCaS (Low Ca2+ Solution) (in mM)	100 NaCl, 2 KCl, 0.05 CaCl2, 0.05 MgCl2, 3 Glucose, 30 Na+-HEPES, pH 7.35.
(e) LoCaS + papain	LoCaS + 0.05% L-cysteine (Sigma C1276) + 0.2% papain (Sigma P3375).
(f) K+-internal solution (in mM)	52 K2SO4, 38 KCl, 1 K+-EGTA, 5 K+-HEPES, pH 7.3.
Table 1. Solutions.