Summary
इस वीडियो के उद्देश्य के लिए वयस्क zebrafish की भीतरी कान अंगों से स्वस्थ, अक्षत बालों की कोशिकाओं को प्राप्त करने और फिर उन्हें पैच दबाना उनके वोल्टेज gated चैनलों की biophysical गुणों निस्र्पक के उद्देश्य से अध्ययन के लिए उपयोग करने के लिए प्रक्रिया का प्रदर्शन है.
Abstract
पैच संवेदी बालों की कोशिकाओं में वोल्टेज gated चैनलों प्रजाति की एक किस्म से अलग क्लैंप का विश्लेषण करती है 1-4 पहले से वर्णित किया गया है, लेकिन इस वीडियो zebrafish से बालों की कोशिकाओं के लिए उन तकनीकों के पहले आवेदन का प्रतिनिधित्व करता है. अणुकोश, lagena, यूट्रिकल और semicircular नहरों: यहाँ हम एक भीतरी कान अंत अंगों के सभी से स्वस्थ, अक्षत बालों की कोशिकाओं को अलग करने के लिए एक विधि का प्रदर्शन. इसके अलावा, हम बाल सेल आकार और आकृति में विविधता का प्रदर्शन और पैच दबाना रिकॉर्डिंग के प्रकार है कि प्राप्त किया जा सकता है की एक उदाहरण दे. दूसरों पर इस zebrafish मॉडल प्रणाली के उपयोग के लाभ zebrafish म्यूटेंट कि दोनों सुनवाई और संतुलन को प्रभावित की उपलब्धता की वजह से उपजी है. ट्रांसजेनिक लाइनों और अन्य तकनीक है कि आनुवांशिक विश्लेषण और हेरफेर, सेल अलगाव और electrophysiological तरीकों का उपयोग का उपयोग के साथ संयोजन में यहाँ शुरू भूमिकाओं बाल पी कोशिकाओं में अधिक से अधिक जानकारी की सुविधा चाहिएइन संवेदी तौर तरीकों mediating में रखना.
Protocol
1. पूर्व प्रयोगात्मक तैयारी
- छह समाधान (रचनाओं के लिए 1 टेबल देखें) तैयार करें: (क) 100 मिलीलीटर NZR (सामान्य zebrafish घंटी है), (ख) 50 मिलीलीटर NZR + (MS222) Tricaine, (ग) 10 मिलीलीटर NZR + BSA, (घ) 100 मिलीलीटर LoCaS (कम Ca 2 + समाधान), (ए) 10 मिलीलीटर + LoCaS papain, (च) 100 मिलीलीटर कश्मीर +-आंतरिक समाधान. समाधान (क), (ख), (घ) और (च) 4 डिग्री सेल्सियस पर एक महीने तक के लिए भंडारित किया जा सकता है समाधान (ग) और (ड.) प्रयोग के दिन के लिए तैयार किया जाना चाहिए. सभी समाधान प्रयोगों की शुरुआत से पहले कमरे के तापमान पर होना चाहिए.
- लेबल और समाधान (क), (ग), (घ) के साथ लगभग आधे रास्ते और (ड.) चार 35 मिमी पेट्री डिश को भरने के.
- Sylgard (डॉव Corning, MIDLAND, MI) के साथ एक 60 मिमी पेट्री डिश भरने और फिर इसे में एक गुहा है कि एक मछली पर tipping के बिना ईमानदार बैठने के लिए अनुमति देगा काटने से एक विदारक पकवान बनाओ.
- एक कुत्ते के बाल के gluing कूप अंत तक कम से कम दो सेल अलगाव उपकरण एक कांच के अंत तक तैयारSuperglue साथ पाश्चर पिपेट, बाल विंदुक के अंत अतीत लगभग 0.5 सेमी का विस्तार करने के लिए अनुमति देता है. नरम लैब्राडोर Retrievers और Weimaraners जैसे furred कुत्तों से बाल अच्छी तरह से काम करते हैं.
2. श्रवण और Vestibular भूलभुलैया का अलगाव
- NZR + Tricaine युक्त बीकर में विसर्जन से एक वयस्क zebrafish बलिदान. नेत्रहीन गहरे नाले की निगरानी जब तक सभी opercular आंदोलनों रह गए हैं. मछली को हटाने और ताजा NZR साथ rinsing से पहले एक अतिरिक्त दस मिनट रुको. इन प्रक्रियाओं संस्थागत पशु की देखभाल द्वारा अनुमोदित किया गया है और Pepperdine विश्वविद्यालय की समिति (IACUC) का उपयोग करें, लेकिन अपनी खुद की संस्था से अनुमोदन प्राप्त किया जाना चाहिए.
- मछली पिन पकवान पृष्ठीय पक्ष विदारक प्रत्येक आंख और अक्ष पृष्ठीय उदर के माध्यम से एक तीसरे पिन गर्तिका के माध्यम से एक तिहाई के बारे में एक मानक सिलाई सीधे पिन (लंबे समय लगभग 2.5 सेमी) डालने से सिर से दूरी के आधे पूंछ के रूप में सचित्रचित्रा 1 ए.
- (0.62 5x) ज़ूम स्टीरियो विदारक 10x eyepieces से लैस खुर्दबीन के तहत, वसंत कैंची (ललित विज्ञान उपकरण सूची 15000-02 संख्या) का उपयोग करने के लिए लगभग एक बिंदु से खोपड़ी छत को हटाने के द्वारा मस्तिष्क और रीढ़ की हड्डी के एक छोटे वर्ग का पर्दाफाश 0.5 मछली की नाक के आगे गहरे नाले के स्तर लांगुलिय सेमी. रीढ़ की हड्डी में कटौती और ठीक संदंश (ललित विज्ञान उपकरण सूची 11251-30 संख्या) के साथ मस्तिष्क उठा जबकि रीढ़ की नसों और अन्य संलग्नक के काटने, मस्तिष्क को हटाने के और त्यागें (चित्रा 1 बी).
- खोपड़ी कैप्सूल कि रहता है के उदर छमाही एक "कटोरा" कि भीतरी कान अंगों शामिल रूपों. प्रमुख, प्रत्येक भीतरी कान और laterally तैनात utricle अधिक rostrally otoliths (आंकड़े 1C और 4A) की दुम का अंत में lagenas और sacculi symmetrically स्थित में सफेद, अपारदर्शी otoliths को ध्यान से देखें.
- सभी उदर और पार्श्व attachmen काटने के द्वारा हड्डी का कटोरा निकालेंटीएस जबकि धीरे इसे उठाने के बाहर सिर के ठीक संदंश के साथ. LoCaS (आंकड़े 1D और 4B) युक्त पेट्री डिश में रखें.
- ठीक संदंश के दो जोड़े का उपयोग करना है, या तो हड्डी का पार्श्व किनारों कब्जाने और उन्हें खींच अलावा या वैकल्पिक रूप से, केंद्र में संदंश की अंक डालने और halves prying द्वारा सही और बाएँ halves अलग अलग कटोरा दरार अपने पर midline अलग. ठीक संदंश (चित्रा 2) का उपयोग कर हड्डी से दो लेबिरिंथ निकालें.
- श्रवण और vestibular अंत अंगों की पहचान: semicircular नहरों, utricles, sacculi और lagenas (चित्रा 4C) लेबिरिंथ का निरीक्षण. प्रत्येक otolith के तहत गुलाबी क्षेत्रों maculae बालों की कोशिकाओं से युक्त हैं. इसी तरह, semicircular नहरों की ampullae अंदर गुलाबी रंग की एक पट्टी किसी संरचना के ऊपर स्थित एक छोटी उल्टे प्याले के आकार की अथवा मेहराब की आकृति की टोपी की पहचान जहां बालों की कोशिकाओं स्थित हैं.
- ध्यान से lagena और utricle से otoliths ठीक संदंश का उपयोग कर हटाने के लिए (
3. बाल सेल अलगाव
- एक प्लास्टिक हस्तांतरण विंदुक (फिशर साइंटिफिक सूची 13-711-9:00 संख्या) का उपयोग करना, पकवान युक्त अंत अंगों को स्थानांतरित LoCaS + papain स्थानांतरित तरल पदार्थ की मात्रा कम से कम.
- इस समाधान में कमरे के तापमान पर तीस मिनट के लिए इन संरचनाओं सेते हैं.
- ऊष्मायन अवधि के अंत में, NZR + BSA युक्त पकवान संरचनाओं कदम है और कम से कम तीस मिनट के लिए इस समाधान में सेते हैं. बालों की कोशिकाओं को इस समाधान में स्वस्थ लेकिन चार घंटे तक के लिए रहेगा अलगाव के बाद 1-2 घंटे के बाद खराब (अगले चरण देखें).
- सेल अलगाव के लिए तैयार करने में, NZR युक्त पकवान अंत अंगों के एक चाल है.
- Lagenas और utricles के लिए, एक कुत्ते के बाल का उपयोग करने के लिए धीरे से maculae गुलाबी उपकला ती की चादरें उठाssue कि बालों की कोशिकाओं (चित्रा 3A) होते हैं. maculae बाहर पकड़े जाते जा सकता है (एक कुत्ते के बाल का उपयोग कर) से sacculi की otoliths के तहत, और semicircular नहरों की ampullae अंदर अपने स्थानों से cupulae.
- दो सेल अलगाव 1.4 चरण में तैयार उपकरणों का उपयोग करना, एक मैक्युला या किसी संरचना के ऊपर स्थित एक छोटी उल्टे प्याले के आकार की अथवा मेहराब की आकृति की टोपी एक मलबे क्षेत्र है कि बालों की कोशिकाओं (3B चित्रा) उत्पन्न महीन चुर्ण बनाना. कोशिकाओं को कम से कम पांच मिनट यह चलती से पहले डिश के तल पर बसने की अनुमति दें.
- एक औंधा चरण विपरीत प्रकाशिकी के साथ सुसज्जित खुर्दबीन के चरण के लिए पकवान शरण लेनी. 40X आवर्धन के तहत कोशिकाओं को निरीक्षण और morphology में विविधता ध्यान दें. कई कोशिकाओं avocado के आकार के हैं, जबकि दूसरों को लंबी और पतली हैं. शिखर बाल बंडलों की उपस्थिति उन्हें बालों की कोशिकाओं के रूप में दिखाता है और चरण चमक उनके स्वास्थ्य का आश्वासन दिया. पृथक बालों की कोशिकाओं की photomicrographs चित्रा 5 में दिखाया जाता है.
4. Zebrafish बालों की कोशिकाओं Clamping पैच
- Perfo के लिए तैयारी मेंरेटेड पैच 5,6 रिकॉर्डिंग, के रूप में amphotericin युक्त आंतरिक समाधान तैयार: जगह 5 मिलीग्राम amphotericin बी (A4888 सिग्मा) एक 1.5 मिलीलीटर microcentrifuge ट्यूब में और 100 μl DMSO साथ भरें. तुरंत भंवर 10-20 सेकंड के लिए इस समाधान amphotericin के सभी तक भंग कर रहा है. फिर, पिपेट एक 2 microcentrifuge ट्यूब में 625 μl कश्मीर +-आंतरिक समाधान. +-आंतरिक समाधान के रूप में ऊपर और कश्मीर भंवर amphotericin समाधान के 10 μl जोड़ें. शेयर amphotericin समाधान कई घंटे पिछले लेकिन एक घंटे के बाद अंतिम समाधान निकाल देगा.
- BF 150-86-10 borosilicate ग्लास (Sutter उपकरण) से पैच pipettes डांड़ी बहु मंच (Sutter P-1000) का उपयोग निर्माण. Pipettes लगभग 2 सुक्ष्ममापी की diameters टिप चाहिए और 1-3 की resistances तालिका 1 में समाधान के साथ है MΩ. डांड़ी पर सेटिंग है कि अच्छी तरह से काम कर रहे हैं के रूप में इस प्रकार: हीट = minus10 रैंप, = 0 वेग, खींचो = 18 देरी = 1, दबाव = 600. का आकारएक अच्छा विंदुक टिप चित्रा 5 इनसेट ग में तस्वीर से स्पष्ट है. ब्लंट "गोली के आकार" pipettes के रूप में वे electrophysiological रिकॉर्डिंग के दौरान कम से कम उपयोग प्रतिरोध की पेशकश पसंद कर रहे हैं.
- एक 28 गेज MICROFIL सिरिंज सुई (MF28G-5, विश्व प्रेसिजन उपकरण) का उपयोग करने के लिए कश्मीर amphotericin युक्त +-आंतरिक समाधान के साथ एक रिकॉर्डिंग इलेक्ट्रोड आधे रास्ते भर.
- एक पैच दबाना एम्पलीफायर के headstage इलेक्ट्रोड प्रत्यय. -10 एम वी, 10 हर्ट्ज पर 10 ms कदम वोल्टेज लागू है और इलेक्ट्रोड में सकारात्मक दबाव बनाए रखने के रूप में यह इंटरफ़ेस / हवा समाधान के माध्यम से चतुराई है और कोशिकाओं के निकट रिकॉर्डिंग पकवान के नीचे करने के लिए नीचे.
- इलेक्ट्रोड orthogonally स्थिति एक स्वस्थ लग सेल. जब इलेक्ट्रोड सेल करने के लिए पर्याप्त पास इतना है कि यह बाहर बह समाधान से दूर स्थानांतरित करने के लिए शुरू होता है, जल्दी दबाव रिवर्स, इलेक्ट्रोड के लिए एक मामूली निर्वात लगाने जब तक सेल पर यह "कूदता". तुरंत वें पर चूषण संघर्षई इलेक्ट्रोड और -70 mV के इलेक्ट्रोड के अंदर करने के लिए एक होल्डिंग क्षमता लागू. कुछ ही सेकंड के भीतर एक gigaohm सील बनेगी.
- वोल्टेज कदम है कि सील गठन के बाद जल्द ही प्रदर्शित होने की शुरुआत और समाप्ति पर capacitive वर्तमान यात्रियों का निरीक्षण. Amphotericin से इलेक्ट्रोड के तहत के रूप में देख रहा यात्रियों परिमाण में अपने अधिकतम आकार के बढ़ने (लगभग दस मिनट में) झिल्ली के वेध की निगरानी जारी है.
- एक स्वस्थ कोशिका में पूरे सेल विन्यास (छिद्रित) की स्थापना की पुष्टि करने के लिए, hyperpolarizing और depolarizing वोल्टेज के इस कदम को लागू करने से जावक कश्मीर + धाराओं को प्रकाश में लाना. अधिकांश बालों की कोशिकाओं प्रमुख जावक धाराओं (चित्रा 6 देखें).
5. प्रतिनिधि परिणाम
चित्रा 4 सेल अलगाव के चरणों के दौरान लिए गए चित्रों से पता चलता है. पैनल में एक throu lagenas saccluli, और utricles के साथ जुड़े otoliths देखा जा सकता हैgh हड्डी की एक पतली परत है कि उन्हें overlies. इन अपारदर्शी संरचनाओं सुविधाजनक स्थलों विच्छेदन के बाद के चरणों के दौरान पशु से अंत अंगों के सुरक्षित हटाने में सहायता प्रदान करते हैं. पैनल बी "कटोरा" हड्डी का पता चलता है कि बरकरार लेबिरिंथ और utricles lagenas, और sacculi में प्रमुख otoliths. पैनल सी एक भूलभुलैया है कि हड्डी से हटा दिया गया है पता चलता है. बड़े otolith lagena में स्कैलप्ड बढ़त के साथ, हिमलंब के आकार और utricle में सेम के आकार otolith लघुकोशक में otolith नोट. आकार और morphology lagena से अलग कक्षों में देखा में विविधता के कुछ चित्रा 5 में सचित्र है. एक स्वस्थ कोशिका एक तेज परिधि के साथ उज्ज्वल चरण के रूप में किया जा रहा आसानी से पहचाना जाता है. सेल आकृति को मोटे तौर पर दो वर्गों में विभाजित किया जा सकता है: (avo) avocado के आकार और लंबी और पतली (thn) हालांकि प्रत्येक समूह के भीतर कोशिकाओं के आकार को स्पष्ट रूप से भिन्न हो सकते हैं (1 avo और avo 3 उदाहरण के लिए तुलना). इनसेट एक के एक क्लस्टर से पता चलता हैतीन कोशिकाओं है कि पूरी तरह से एक दूसरे से अलग नहीं किया गया है. काले और इनसेट ख में सेल के बारीक उपस्थिति रंग में मृत के रूप में आसानी से इस सेल की पहचान है. इनसेट ग एक पैच आकार और आयाम इन कोशिकाओं से रिकॉर्डिंग के लिए उपयुक्त illustrating विंदुक टिप से पता चलता है.
वर्तमान चित्रा 6 में दिखाया निशान hyperpolarizing और depolarizing संभावित कदम एक lagena avo 2 चित्रा 5 में दिखाया के लिए इसी तरह की सेल पर लगाया जवाब में प्राप्त किया गया. विभिन्न आकारों और आकार की कोशिकाओं में वर्तमान प्रतिक्रियाओं व्यापक रूप से वोल्टेज gated चैनलों के पूरक में विविधता सुझाव है भिन्न हो सकते हैं.
1-3 आंकड़े: बालों की कोशिकाओं के अलगाव में कदम illustrating कार्टून.
चित्रा 1 खोपड़ी capsu का निकालना.zebrafish से भीतरी कान लेबिरिंथ युक्त ले. पिन zebrafish पृष्ठीय पक्ष का बलिदान पकवान विदारक बी. ओपन खोपड़ी को दूर करने के लिए, और मस्तिष्क त्यागें सी. Utricles lagenas और sacculi डी otoliths में देखो. खोपड़ी लेबिरिंथ युक्त कैप्सूल के उदर भाग को निकालें.
चित्रा 2 खोपड़ी कैप्सूल से लेबिरिंथ हटाने. अलग अपने पर midline खोपड़ी कैप्सूल दरार बी. हड्डी से लेबिरिंथ सी निकालें. Lagenas और utricles संदंश का उपयोग कर से otoliths निकालें.
चित्रा 3 लेबिरिंथ से बालों की कोशिकाओं के अलगाव. धीरे से मा लिफ्टएक कुत्ते के बाल के साथ culae बी. दो कुत्ते के बाल के साथ maculae महीन चुर्ण बनाना. सी. पैच दबाना के लिए पृथक बालों की कोशिकाओं का उपयोग करें.
चित्रा 4. व्यक्ति की कोशिकाओं के अलगाव में चरणों के दौरान लिया मस्तिष्क के हटाने के बाद ए, दो lagenas और sacculi (तीर) और utricles (तीर) के साथ जुड़े otoliths देखे जा सकते हैं. उदर के हटाने के बाद बी. खोपड़ी कैप्सूल कि जानवर से भीतरी कान अंगों का भाग. कार्टून बी के ठीक आधे में छोड़ दिया utricle, lagena और saccule के स्थानों की पहचान है. धराशायी लाइन छोड़ दिया भूलभुलैया की अनुमानित स्थिति को दर्शाता है. अधिकार (औसत दर्जे का दृश्य) भूलभुलैया डी: कार्टून ड्राइंग सी में भूलभुलैया के प्रमुख अंश illustrating. एक: पूर्वकाल अर्धपरिपत्र नहर, ख: क्षैतिज नहर, ग: पीछे नहर, d: otolith utricular, ई: लघुकोश otolith, च: lagenal otolith. डी में स्केल पट्टी ए और बी, सी और डी के लिए 0.5 मिमी के लिए 1 मिमी का प्रतिनिधित्व करता है
चित्रा 5 पृथक, आकारिकी की विविधता illustrating lagena से स्वस्थ कोशिकाओं, avo: avocado आकार की कोशिकाओं, thn: लंबे, पतले कोशिकाओं. इनसेट एक: तीन अधूरे अलग कक्षों की क्लस्टर, इनसेट ख: मृत सेल, इनसेट ग: पैच zebrafish बालों की कोशिकाओं से electrophysiological रिकॉर्डिंग में इस्तेमाल किया इलेक्ट्रोड की टिप. पैमाने बार = 20 सुक्ष्ममापी मुख्य आंकड़ा और सभी insets के लिए लागू होता है.
चित्रा 6 एक पैच में दर्ज धाराओं बाल सेल clamped. एक सेल में औसतन प्रतिक्रियाओं (इसी तरह टीचित्रा 5 में 2 avo वोल्टेज 10 -140 mV से 70 mV एमवी -70 mV की होल्डिंग क्षमता से वेतन वृद्धि में लागू कदम के तीन प्रस्तुतियों के लिए). नोट निष्क्रिय मौजूदा कि अधिक depolarized क्षमता पर प्रकट होता है. वोल्टेज कदम magnitudes कुछ निशान के बगल में दिखाए जाते हैं.
Discussion
अंत अंगों और कोशिकाओं की कोमल उपचार के सावधान विच्छेदन स्वस्थ, अक्षत और physiologically सक्रिय बालों की कोशिकाओं के सफल अलगाव के लिए महत्वपूर्ण है. सफलता के आश्वासन निम्नलिखित सुझावों का पालन होगा:
- यह छोटी मछली (लंबाई में 2-2.5 सेमी) से स्वस्थ कोशिकाओं को प्राप्त करने के लिए आसान है. बड़ी मछली बहुत अधिक वसा कि विच्छेदन की प्रक्रिया के दौरान अस्पष्ट दृश्य बूंदों है.
- देखभाल जब otoliths है, जो बालों की कोशिकाओं overlie हटा लिया जाना चाहिए. संदंश के साथ otoliths हथियाने जब कोशिकाओं को छू से बचें.
- उत्तम परिणाम प्राप्त कर रहे हैं जब maculae और cupulae चादरें और कोशिकाओं उपकला से triturated के रूप में उठा रहे हैं.
- हम एक कुत्ते के बाल का उपयोग करने के लिए कोशिकाओं को महीन चुर्ण बनाना मानव eyelashes जो 7 के रूप में पतला और कम लचीली नहीं कर रहे हैं प्रयोग सहित अन्य विधियों, के लिए बेहतर हो पाते हैं.
- पैच clamping, सकारात्मक दबाव के आवेदन के दौरानवह इलेक्ट्रोड के रूप में यह गुजरता है के माध्यम से अंतरफलक / हवा समाधान के टिप को साफ रखने के लिए महत्वपूर्ण है. सेल सक्षम इलेक्ट्रोड पर "छलांग" सकारात्मक दबाव की रिहाई भी महत्वपूर्ण है. इस विधि amphotericin युक्त समाधान की एक छोटी मात्रा टिप से दूर साफ, इस प्रकार सेल के साथ एक gigaohm सील बनाने की संभावना बढ़ रही है. हमारे प्रयोगों में हम बजाय अधिक परंपरागत पूरे सेल विन्यास की कोशिकाओं की कमजोरी की वजह से छिद्रित पैच रिकॉर्डिंग तकनीक का उपयोग करें. "पूरे सेल जाना" gigaohm मुहर के नुकसान में अक्सर परिणाम करने का प्रयास किया जा रहा है.
यहाँ वर्णित विधि जानवर प्रति स्वस्थ बालों की कोशिकाओं के सैकड़ों निकलेगा. तकनीक कमरे के तापमान पर प्रदर्शन किया जा सकता है और एक विदारक माइक्रोस्कोप से परे कोई विशेष उपकरणों की आवश्यकता है. जौव में पिछले एक रिपोर्ट zebrafish में भीतरी कान एक उदर 8 दृष्टिकोण का उपयोग कर के विच्छेदन का वर्णन करता है. इन लेखकों disse दिखाना हैपूरे, paraformaldehyde तय भीतरी कान अंगों के ction. हम पाठक हमारे तरीकों के साथ तुलना करने के लिए इस वीडियो को देखने के लिए प्रोत्साहित करते हैं. यहाँ प्रस्तुत तरीकों का एक फायदा जीना शारीरिक जांच के लिए उपयोगी कोशिकाओं के प्राप्त है. पैच दबाना प्रयोगों में उनके उपयोग के वोल्टेज gated चैनलों का अध्ययन (के रूप में यहाँ दिखाया गया है) इन कोशिकाओं का उपयोग करने के लिए समाई माप का बनाने 11,12 सेल 9,10 प्रतिध्वनि, निगरानी neurotransmitter रिहाई का अध्ययन करने के लिए बढ़ाया जा सकता है के अलावा, द्वारा प्रेरित neuromodulation की जांच ligand gated 13 चैनलों के सक्रियण के रूप में के रूप में अच्छी तरह से जानकारी के धन है कि म्यूटेंट कि दोनों सुनवाई और 14 संतुलन को प्रभावित का उपयोग कर से gleaned जा सकता में नल.
Disclosures
ब्याज की कोई संघर्ष की घोषणा की.
Acknowledgments
NSF (0854551) द्वारा वित्त पोषित है.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| (a) NZR (Normal Zebrafish Ringer's) (in mM) | 116 NaCl, 2 KCl, 2 CaCl2, 3 Glucose, 5 Na+-HEPES, pH 7.35. | ||
| (b) NZR + Tricaine | NZR + 0.02% 3-aminobenzoic acid ethyl ester methane sulfonate (Sigma A5040). | ||
| (c) NZR + BSA | NZR + 0.4% Bovine Serum Albumin (Sigma A2153). | ||
| (d) LoCaS (Low Ca2+ Solution) (in mM) | 100 NaCl, 2 KCl, 0.05 CaCl2, 0.05 MgCl2, 3 Glucose, 30 Na+-HEPES, pH 7.35. | ||
| (e) LoCaS + papain | LoCaS + 0.05% L-cysteine (Sigma C1276) + 0.2% papain (Sigma P3375). | ||
| (f) K+-internal solution (in mM) | 52 K2SO4, 38 KCl, 1 K+-EGTA, 5 K+-HEPES, pH 7.3. | ||
Table 1. Solutions. |
|||
References
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