Cet article fournit un protocole pour la culture de jeunes plants d'Arabidopsis dans le RootChip, une plate-forme d'imagerie qui combine microfluidique de contrôle automatisé des conditions de croissance avec un suivi racine microscopique et FRET basée sur la mesure de niveaux intracellulaires de métabolites.
Les fonctions des racines que l'ancre physique de l'usine et est l'organe responsable de l'absorption d'eau et les nutriments minéraux tels que des éléments d'azote, de phosphore, de sulfate et de trace que les plantes acquièrent à partir du sol. Si nous voulons développer des approches durables pour la production de rendement des cultures à haute, nous avons besoin de mieux comprendre comment se développe la racine, prend place un large éventail de nutriments, et interagit avec des organismes symbiotiques et pathogènes. Pour atteindre ces objectifs, nous devons être en mesure d'explorer les racines dans le détail microscopique sur des périodes allant de quelques minutes à plusieurs jours.
Nous avons développé le RootChip, un polydiméthylsiloxane (PDMS) – basé dispositif microfluidique, qui nous permet de grandir et de racines d'image à partir de plants d'Arabidopsis en évitant tout stress physique aux racines lors de la préparation pour l'imagerie 1 (figure 1). Le dispositif contient une structure de canal bifurqué avec vannes micromécaniques pour guider l'écoulement du fluideà partir des entrées de solution à chacun des huit chambres d'observation 2. Ce système de perfusion permet le microenvironnement root pour être contrôlé et modifié avec précision et rapidité. Le volume des chambres est d'environ 400 nl, ce qui nécessite que des quantités minimes de la solution d'essai.
Ici nous fournissons un protocole détaillé pour étudier la biologie racine sur le RootChip en utilisant l'imagerie des approches fondées sur la résolution en temps réel. Les racines peuvent être analysés sur plusieurs jours en utilisant la microscopie laps de temps. Les racines peuvent être perfusés avec des solutions nutritives ou des inhibiteurs, et jusqu'à huit plants peuvent être analysés en parallèle. Ce système a le potentiel pour une large gamme d'applications, y compris l'analyse de la croissance des racines dans la présence ou l'absence de produits chimiques, basé sur la fluorescence d'analyse de l'expression génique et l'analyse des biocapteurs, par exemple FRET nanocapteurs 3.
Les principaux avantages de la croissance par rapport aux méthodes RootChip classiques sont la préparation peu invasive pour la microscopie, la capacité de façon réversible et à plusieurs reprises de modifier l'environnement root, et la capacité d'observation continue du tissu développemental compétent et physiologiquement sain sur une période de plusieurs jours. Auparavant, les plants ont été cultivés à la verticale sur des supports gélifiés et transféré à un système de perfusion immédiatement avant l'expérience, ce qui a permis que la mesure de racines simples à un moment 8. Outils microfluidiques ont été utilisés pour Arabidopsis, mais à un niveau faible intégration 9 ou sans contrôle 10 perfusion. Le RootChip combine un niveau d'intégration élevé avec la possibilité d'automatiser des expériences par le biais des conseils précis du débit. Un autre avantage de cette plate-forme, caractéristique de tous les dispositifs microfluidiques 11, est que seules des quantités minimes de liquide sont tenus de fournir à la racine avec l'écrou nécessaireRients, même pour les expériences de plusieurs jours. Le RootChip est actuellement conçu comme un dispositif à usage unique, mais puisque les coûts de production de puces sont faibles, les faibles quantités de réactifs consommés rend la puce reste très rentable.
Il ya quelques étapes essentielles qui doivent être prises pour garantir la santé des plants:
Le volume dans les cônes en plastique n'est pl 3-4, qui va commencer à sécher lorsqu'elle est exposée à l'air. Par conséquent, il est essentiel que les cônes sont transférés sur la puce rapidement et l'humidité est maintenue élevée jusqu'à ce que les racines ont atteint les chambres d'observation, qui leur fournissent suffisamment d'eau. Étapes 4.2 à 4.5 doit être effectuée rapidement et sans interruption pour éviter le dessèchement des plants.
Étapes 3.5 – 3.8 décrire l'incubation de la puce dans des milieux liquides au cours de laquelle les racines se développent dans les chambres d'observation. Cette étape peut être ignorée par le montage de la puce dans le carrier immédiatement et de départ de perfusion constante avec un milieu de croissance. Toutefois, nous recommandons le trempage dans un milieu de croissance pendant une nuit, comme il a quelques avantages: 1) il crée un environnement humide de sorte que les plants sont moins susceptibles de se dessécher à mesure qu'ils grandissent dans la chambre d'observation; 2) la puce est trempé dans un liquide, de sorte dégazage (étape 6.4) est plus rapide.
Il est important d'utiliser les médias avec de faibles concentrations de soluté. Des solutions plus concentrées peuvent précipiter et de boucher les canaux, surtout si la puce est utilisée sur plusieurs jours.
Une fois que le terminal est connecté à la conduite de pression d'air, le flux de milieu est contrôlée en changeant la pression hydraulique dans les vannes. Afin de garantir une bonne fermeture des vannes micromécaniques, il est important de choisir une pression de commande qui est environ trois fois plus élevé que la pression d'écoulement. La pression d'écoulement ne doit pas dépasser 15 psi que le fluide sera poussé sur les entrées de racines. Des pressions plus élevées may aussi causer la délamination de la puce, ce qui rend inutilisable le chip.
Une limitation de la RootChip est que le PDMS est poreuse et hydrophobe. Alors que le matériau est pratiquement inerte à des solutions aqueuses, il peut absorber les composés organiques 12. Cela peut interférer avec un échange rapide de solutions que les composés organiques peuvent couler de la matière même lorsque l'alimentation de ce composé a été arrêté à l'entrée. En raison de la porosité, l'utilisation de solvants organiques peut provoquer un gonflement du PDMS 12.
On continuer à optimiser la RootChip et s'étendent son utilité, par exemple avec des racines de plantes cultivées. Nous croyons que par l'amélioration de l'accès à la racine pour les traitements et d'observation, les outils microfluidiques comme le RootChip va ouvrir de nouvelles dimensions de la recherche des racines.
The authors have nothing to disclose.
Nous remercions Philipp Denninger de l'aide pour la préparation et vidéo Bhavna Chaudhuri pour fournir des lignes de plantes exprimant FRET capteurs. Ce travail a été soutenu par des subventions de la National Science Foundation (MCB 1021677), le ministère de l'Énergie (DE-FG02-04ER15542) à WBF, le National Institutes of Health, et le Howard Hughes Medical Institute à SRQGG a été soutenu par une longue EMBO terme de bourses. MM a été soutenu par la Fondation Alexander von Humboldt.
Items | Source | Information |
Chip carrier, software and other information. | Carnegie Institution – DPB | CAD and CNC files for carrier fabrication, controller software and further information are available for download from the website http://dpb.carnegiescience.edu/technology/rootchip Carriers can also be ordered from this website. |
RootChip | Stanford Foundry | Mask designs and fabrication protocols are available upon request. Ready-to-use RootChips can be ordered from http://www.stanford.edu/group/foundry/ |
Chip controller | -home built- | The automated valve controller system was originally developed by Rafael Gómez-Sjöberg , Lawrence Berkeley National Lab. A detailed instruction how to build your own actuated valve controller can be found at https://sites.google.com/a/lbl.gov/microfluidics-lab/valve-controllers |