Denne artikkelen gir en protokoll for dyrking av Arabidopsis frøplanter i RootChip, en microfluidic tenkelig plattform som kombinerer automatisert kontroll av vekstforhold med mikroskopisk rot overvåking og FRET-basert måling av intracellulære metabolitter.
De grunnleggende funksjonene som den fysiske anker av anlegget og er det organ som har ansvar for opptak av vann og mineral næringsstoffer som nitrogen, fosfor, sulfat og sporstoffer som planter erverver fra jorda. Hvis vi ønsker å utvikle bærekraftige metoder for å produsere høy avling avkastning, må vi bedre forstå hvordan roten utvikler, tar opp et bredt spekter av næringsstoffer, og samhandler med symbiotiske og sykdomsframkallende organismer. For å oppnå disse målene, må vi være i stand til å utforske røttene i mikroskopisk detalj er over tidsperioder fra minutter til dager.
Vi utviklet RootChip, en polydimetylsiloksan (PDMS) – basert microfluidic enhet, som tillater oss å vokse og bilde røtter fra Arabidopsis frøplanter samtidig unngå enhver fysisk stress til røttene under forberedelse for avbildning 1 (figur 1). Enheten inneholder en todelt kanal struktur med mikromekaniske ventiler til å lede væskestrømfra løsningen innløpene til hver av de åtte observasjon kamre 2. Dette perfusjon systemet gjør roten mikromiljøet å bli kontrollert og modifisert med presisjon og hastighet. Volumet av kamrene er ca 400 nl, og dermed krever bare minimale mengder test løsning.
Her tilbyr vi en detaljert protokoll for å studere root biologi på RootChip hjelp bildebehandling tilnærminger med sanntid oppløsning. Røtter kan analyseres over flere dager med tid lapse mikroskopi. Røtter kan perfused med næringsinnhold løsninger eller hemmere, og opptil åtte frøplanter kan analyseres parallelt. Dette systemet har potensiale for et bredt spekter av bruksområder, inkludert analyse av rot vekst i nærvær eller fravær av kjemikalier, fluorescens-basert analyse av genuttrykk, og analyse av biosensorer, f.eks FRET nanosensorer tre.
De viktigste fordelene ved RootChip enn konvensjonelle vekst metoder er det minimalt invasiv forberedelse for mikroskopi, evnen til å reversibelt og gjentatte ganger endre rotmiljøet, og kapasiteten for kontinuerlig observasjon av utviklingshemmede kompetent og fysiologisk friskt vev over en periode på flere dager. Tidligere ble frøplanter dyrket vertikalt på gelled media og overført til en perfusjon system umiddelbart før forsøket, noe som tillot bare måle enkle røtter på en tid 8. Microfluidic verktøy har blitt brukt til Arabidopsis, men på et lavt integrering nivå 9 eller uten perfusjon kontroll 10. Den RootChip kombinerer en høy grad av integrasjon med evnen til å automatisere eksperimenter gjennom presis flyt veiledning. En annen fordel med denne plattformen, karakteristisk for alle microfluidic enheter 11, er at bare minimale mengder væske er nødvendig for å forsyne rot med nødvendig mutterrients, selv om forsøk som spenner over flere dager. Den RootChip tiden utformet som en engangskode enhet, men siden produksjonskostnadene for chips er lav, gjør at små mengder av konsumert reagenser brikken fortsatt svært kostnadseffektiv.
Det er noen viktige skritt som må tas for å sikre helsen til seedlings:
Volumet i plast koner er bare 3-4 mL, som vil begynne å tørke når de utsettes for luft. Derfor er det avgjørende at kjeglene blir overført på brikken raskt og fuktighet holdes høyt inntil røttene har nådd observasjon kamre, som vil forsyne dem med tilstrekkelig vann. Trinn 4.2 til 4.5 skal utføres raskt og uten avbrudd for å hindre uttørking av frøplanter.
Steps 3.5 – 3.8 beskrive inkubasjon av brikken i flytende medier der røttene vokser inn i observasjon kamre. Dette trinnet kan bli hoppet over ved å montere chip inn i carrier umiddelbart og begynner konstant perfusjon med vekst medium. Vi anbefaler imidlertid soaking i vekst medium over natten, så den har noen fordeler: 1) Det skaper et fuktig miljø, så spirene er mindre sannsynlig å bli revet som de vokser til observasjon kammeret, 2) brikken er dynket i væske, så avgassing (steg 6,4) vil være raskere.
Det er viktig å bruke medier med lav stoff konsentrasjoner. Mer konsentrerte løsninger kan utløse og tette kanaler, spesielt hvis brikken brukes over flere dager.
Når enheten er koblet til lufttrykket linjen, er flyten av medium kontrolleres ved å endre hydraulisk trykk i ventilene. For å garantere riktig lukking av mikromekaniske ventiler, er det viktig å velge en kontroll trykk som er omtrent tre ganger høyere enn vanntrykk. Flyten trykket bør ikke overstige 15 psi som væske vil bli skjøvet ut av roten inntakene. Høyere presset may også forårsake delaminering av chip, som gjør brikken ubrukelig.
En begrensning av RootChip er at PDMS er porøs og hydrofobe. Mens materialet er praktisk talt inert til vandige løsninger, kan det absorbere organiske forbindelser 12. Dette kan forstyrre en rask utveksling av løsninger som organiske forbindelser kan lekke fra materialet, selv når tilførselen av denne forbindelsen har blitt stoppet ved innløpet. På grunn av porøsitet, kan bruke organiske løsemidler forårsake svelling av PDMS 12.
Vi fortsetter å optimalisere RootChip og utvide sin nytteverdi, for eksempel med røtter av planter. Vi tror at ved å forbedre tilgangen til roten for behandlinger og observasjon, vil microfluidic verktøy som RootChip åpner opp nye dimensjoner av rot forskning.
The authors have nothing to disclose.
Vi takker Philipp Denninger for hjelp med video forberedelse og Bhavna Chaudhuri for å gi plante linjene uttrykker slite sensorer. Dette arbeidet ble støttet med tilskudd fra National Science Foundation (MCB 1.021.677), Department of Energy (DE-FG02-04ER15542) til WBF, National Institutes of Health, og Howard Hughes Medical Institute til SRQGG ble støttet av en embo lang sikt fellesskap. MM ble støttet av Alexander von Humboldt Foundation.
Items | Source | Information |
Chip carrier, software and other information. | Carnegie Institution – DPB | CAD and CNC files for carrier fabrication, controller software and further information are available for download from the website http://dpb.carnegiescience.edu/technology/rootchip Carriers can also be ordered from this website. |
RootChip | Stanford Foundry | Mask designs and fabrication protocols are available upon request. Ready-to-use RootChips can be ordered from http://www.stanford.edu/group/foundry/ |
Chip controller | -home built- | The automated valve controller system was originally developed by Rafael Gómez-Sjöberg , Lawrence Berkeley National Lab. A detailed instruction how to build your own actuated valve controller can be found at https://sites.google.com/a/lbl.gov/microfluidics-lab/valve-controllers |