Este artigo fornece um protocolo para o cultivo de mudas de Arabidopsis no RootChip, uma plataforma microfluídica imagem que combina controle automatizado das condições de crescimento com acompanhamento raiz microscópica e FRET baseado em medição de níveis de metabólitos intracelulares.
As funções de raiz como a âncora físico da planta e é o órgão responsável pela captação de água e nutrientes minerais, como nitrogênio, fósforo, sulfato e oligo-elementos que as plantas adquirem a partir do solo. Se queremos desenvolver abordagens sustentáveis para a produção de alta produtividade da cultura, nós precisamos entender melhor como a raiz se desenvolve, ocupa um amplo espectro de nutrientes, e interage com organismos simbiontes e patogênicos. Para alcançar esses objetivos, precisamos ser capazes de explorar as raízes em detalhes microscópicos ao longo de períodos que variam de minutos a dias.
Nós desenvolvemos o RootChip, um polidimetilsiloxano (PDMS) – dispositivo micro based, o que nos permite crescer e raízes de imagem de mudas de Arabidopsis, evitando qualquer esforço físico às raízes durante a preparação para a imagem 1 (Figura 1). O dispositivo contém uma estrutura de canal bifurcada com válvulas micromecânicos para guiar o fluxo do fluidoa partir de entradas de solução para cada um dos oito câmaras de observação 2. Este sistema de perfusão permite que o microambiente de raiz para ser controlado e modificado com precisão e rapidez. O volume das câmaras é de aproximadamente 400 nl, exigindo assim apenas quantidades mínimas de solução de teste.
Aqui nós fornecemos um protocolo detalhado para o estudo da biologia raiz no RootChip utilizando imagens baseadas em abordagens com a resolução em tempo real. Raízes pode ser analisada ao longo de vários dias usando microscopia lapso de tempo. Raízes podem ser perfundidos com soluções nutritivas ou inibidores, e até oito plântulas podem ser analisados em paralelo. Este sistema tem o potencial para uma vasta gama de aplicações, incluindo a análise do crescimento das raízes na presença ou ausência de produtos químicos, de fluorescência baseada em análise da expressão do gene, ea análise de biossensores, por exemplo, FRET nanosensores 3.
As principais vantagens do RootChip sobre os métodos de crescimento convencionais são a preparação minimamente invasiva para a microscopia, a capacidade de reversivelmente e repetidamente alterar o ambiente de raiz, e da capacidade de observação contínua de tecido developmentally competente e fisiologicamente saudável durante um período de vários dias. Anteriormente, as plantas foram cultivadas em meios gelificados verticalmente e transferidos para um sistema de perfusão imediatamente antes da experiência, o que permitiu medir apenas raízes de cada vez 8. Ferramentas microfluídicos têm sido utilizados para Arabidopsis, mas a um nível baixo de integração 9 ou sem controlo de perfusão 10. O RootChip combina um alto nível de integração com a capacidade de automatizar experimentos através de orientação de fluxo preciso. Outra vantagem desta plataforma, característica de todos os dispositivos microfluídicos 11, é que apenas quantidades mínimas de líquido são necessárias para fornecer a raiz com a porca necessáriorients, mesmo para experimentos que abrangem vários dias. O RootChip está concebido como um dispositivo de uso único, mas desde que os custos de produção de chips estão baixos, as pequenas quantidades de reagentes consumidos faz o chip ainda é muito rentável.
Existem alguns passos críticos que devem ser tomadas para garantir a saúde das mudas:
O volume nos cones de plástico é apenas uL 3-4, que vai começar a secar quando exposta ao ar. Por isso, é crítico que os cones são transferidos para o chip de forma rápida e de humidade é mantida elevada até que as raízes tenham atingido as câmaras de observação, o que irá fornecer-lhes água suficiente. Passos 4.2 para 4.5 deve ser realizada rapidamente e sem interrupção para evitar o ressecamento das mudas.
Passos de 3,5 – 3,8 descrever a incubação do chip em meios líquidos durante o qual as raízes crescem para dentro das câmaras de observação. Este passo pode ser ignorada pela montagem do chip no carrier imediatamente e iniciando a perfusão constante com meio de crescimento. No entanto, é recomendável imersão em meio de crescimento durante a noite, uma vez que tem algumas vantagens: 1) cria um ambiente húmido de modo as plântulas são menos provável que se torne dessecado à medida que crescem para dentro da câmara de observação, 2), o chip é embebido em líquido, de modo desgaseificação (passo 6,4) será mais rápido.
É importante a utilização de meios de comunicação com baixas concentrações de soluto. As soluções mais concentradas podem precipitar e entupir os canais, especialmente se o chip é usado em vários dias.
Uma vez que o dispositivo está conectado à linha de pressão de ar, o fluxo de meio é controlado alterando a pressão hidráulica nas válvulas. Para garantir o correcto encerramento das válvulas micromecânicos, é importante escolher uma pressão de comando que é cerca de três vezes maior do que a pressão de fluxo. A pressão de fluxo não deve exceder 15 psi como o fluido vai ser empurrado para fora das entradas de raiz. Altas pressões may também causar delaminação do chip, o que torna o inutilizável chip.
Uma limitação do RootChip é que o PDMS é porosa e hidrofóbico. Enquanto o material é praticamente inerte a soluções aquosas, que podem absorver compostos orgânicos 12. Isso pode interferir com uma troca rápida de soluções como compostos orgânicos podem vazar a partir do material, mesmo quando o fornecimento deste composto foi parado na entrada. Devido à porosidade, a utilização de solventes orgânicos podem causar inchaço do PDMS 12.
Continuamos a optimizar a RootChip e alargar a sua utilidade, por exemplo, com raízes de plantas de cultivo. Acreditamos que melhorando o acesso à raiz para o tratamento e observação, ferramentas microfluídicos como a RootChip vai abrir novas dimensões de pesquisa raiz.
The authors have nothing to disclose.
Agradecemos Philipp Denninger para obter ajuda com o vídeo de preparação e Chaudhuri Bhavna para fornecer linhas de plantas que expressam FRET sensores. Este trabalho foi suportado por concessões do National Science Foundation (MCB 1021677), o Departamento de Energia (DE-FG02-04ER15542) a WBF, o National Institutes of Health e do Howard Hughes Medical Institute para SRQGG foi apoiada por um longo EMBO prazo comunhão. MM foi apoiado pela Fundação Alexander von Humboldt.
Items | Source | Information |
Chip carrier, software and other information. | Carnegie Institution – DPB | CAD and CNC files for carrier fabrication, controller software and further information are available for download from the website http://dpb.carnegiescience.edu/technology/rootchip Carriers can also be ordered from this website. |
RootChip | Stanford Foundry | Mask designs and fabrication protocols are available upon request. Ready-to-use RootChips can be ordered from http://www.stanford.edu/group/foundry/ |
Chip controller | -home built- | The automated valve controller system was originally developed by Rafael Gómez-Sjöberg , Lawrence Berkeley National Lab. A detailed instruction how to build your own actuated valve controller can be found at https://sites.google.com/a/lbl.gov/microfluidics-lab/valve-controllers |