Dieser Artikel enthält ein Protokoll für die Kultivierung von Arabidopsis-Keimlinge in der RootChip, ein Mikrofluidik-Imaging-Plattform, die eine automatisierte Kontrolle der Wachstumsbedingungen kombiniert mit mikroskopischen Wurzel Überwachungs-und FRET-basierten Messung der intrazellulären Metaboliten.
Die Root-Funktionen wie die physische Verankerung der Pflanze und ist das Organ für die Aufnahme von Wasser und mineralischen Nährstoffen wie Stickstoff, Phosphor-, Sulfat-und Spurenelementen, die Pflanzen aus dem Boden zu erwerben. Wenn wir nachhaltige Konzepte für die Herstellung qualitativ Ernteertrag entwickeln wollen, müssen wir besser verstehen, wie die Wurzel, entwickelt greift ein breites Spektrum an Nährstoffen, und interagiert mit symbiotischen und pathogenen Organismen. Um diese Ziele zu erreichen, müssen wir in der Lage sein Wurzeln im mikroskopischen Detail über Zeiträume von Minuten bis Tagen zu erkunden.
Wir entwickelten die RootChip, ein Polydimethylsiloxan (PDMS) – basierte Mikrofluidik-Vorrichtung, die uns zu wachsen und Wurzeln Bild von Arabidopsis-Keimlinge können unter Vermeidung jeglicher körperlicher Belastung zu Wurzeln während der Vorbereitung für die Abbildung 1 (Abb. 1). Das Gerät enthält einen gegabelten Kanalstruktur mit mikromechanischen, um die Fluidströmung leitenaus der Lösung Einlässen zu jedem der acht Beobachtung Kammern 2. Diese Perfusion System ermöglicht die Wurzel Mikroumgebung gesteuert und modifiziert werden mit Präzision und Geschwindigkeit. Das Volumen der Kammern beträgt etwa 400 nl und erfordern somit nur minimale Mengen an Testlösung.
Hier bieten wir Ihnen ein detailliertes Protokoll für das Studium der Biologie an der Wurzel RootChip mit bildgebenden Ansätze mit Echtzeit-Auflösung. Roots kann über mehrere Tage mit Zeitraffer-Mikroskopie analysiert werden. Roots mit Nährlösungen oder Inhibitoren durchströmt werden, und bis zu acht Sämlinge können parallel analysiert werden. Dieses System hat das Potenzial für eine breite Palette von Anwendungen, einschließlich der Analyse des Wurzelwachstums in Gegenwart oder Abwesenheit von Chemikalien, Fluoreszenz-basierte Analyse von Genexpression, und Analyse von Biosensoren, zB FRET Nanosensoren 3.
Die Hauptvorteile des RootChip gegenüber herkömmlichen Methoden sind das Wachstum minimal-invasive Präparation für die Mikroskopie, die Fähigkeit, reversibel und wiederholt verändern die Root-Umgebung, und die Fähigkeit zur kontinuierlichen Beobachtung von entwicklungspolitisch kompetente und physiologisch gesundes Gewebe über einen Zeitraum von mehreren Tagen. Zuvor wurden die Keimlinge senkrecht auf gelierten Medium gezüchtet und auf eine Perfusionssystem unmittelbar vor dem Experiment, das nur die Messung eine einzige Ursache zu einer Zeit 8 erlaubt. Mikrofluidik-Tools wurden für Arabidopsis, aber auf einem niedrigen Integrationsgrad 9 oder ohne Perfusion Steuerung 10 verwendet worden. Die RootChip verbindet ein hohes Maß an Integration mit der Fähigkeit, durch genaue Experimente Strömungsführung zu automatisieren. Ein weiterer Vorteil dieser Plattform Merkmal aller mikrofluidischen Vorrichtungen 11, ist, dass nur minimale Mengen an Flüssigkeit benötigt, um die Wurzel mit der erforderlichen Mutter zuzuführenkontrollierten Nährstoffeintrag, auch für Experimente über mehrere Tage. Die RootChip wird derzeit als Einweg-Gerät konzipiert, aber da die Produktionskosten von Chips niedrig sind, macht die kleine Mengen an Reagenzien verbraucht der Chip immer noch sehr kostengünstig.
Es gibt ein paar kritische Schritte, die ergriffen werden, um die Gesundheit der Setzlinge garantiert werden muss:
Das Volumen in der Kunststoff-Kegel ist nur 3-4 ul, die beginnen, um zu trocknen, wenn sie der Luft ausgesetzt wird. Daher ist es wichtig, dass die Zapfen auf den Chip übertragen werden schnell und Feuchtigkeit hoch gehalten wird, bis die Wurzeln der Beobachtungskammern, die sie mit ausreichend Wasser liefert erreicht haben. Schritte von 4,2 bis 4,5 sollte schnell und ohne Unterbrechung der Trocknung der Sämlinge zu verhindern durchgeführt werden.
Schritte von 3,5 bis 3,8 beschreiben die Inkubation des Chips in flüssigen Medien, in denen die Wurzeln wachsen in die Beobachtungskammern. Dieser Schritt kann durch Montage des Chips in die c übersprungenarrier sofort ab und konstante Perfusion mit Wachstumsmedium. Wir empfehlen jedoch, Einweichen in Wachstumsmedium über Nacht, da sie einige Vorteile hat: 1) es schafft eine feuchte Umgebung, damit die Keimlinge weniger wahrscheinlich geworden ausgetrocknet, als sie in der Beobachtung Kammer wachsen sind; 2) wird der Chip in Flüssigkeit getränkt, so Entgasung (Schritt 6.4) wird schneller sein.
Es ist wichtig, um Medien mit niedrigen Konzentrationen der gelösten Stoffe zu verwenden. Mehr konzentrierten Lösungen können ausfallen und verstopfen die Kanäle, insbesondere, wenn der Chip über mehrere Tage verwendet wird.
Sobald das Gerät in der Druckluftleitung verbunden ist, wird die Strömung des Mediums, indem hydraulische Druck in den Ventile gesteuert. Um eine ordnungsgemäße Schließung der mikromechanische Ventile gewährleisten, ist es wichtig, einen Steuerdruck, die etwa dreimal höher als der Fließdruck zu wählen. Der Fließdruck sollte nicht mehr als 15 psi als die Flüssigkeit wird aus der Wurzel Buchten geschoben werden. Höhere Drücke may auch dazu führen, Delamination der Chip, der den Chip unbrauchbar macht.
Eine Begrenzung der RootChip ist, dass PDMS porösen auch hydrophob ist. Während das Material praktisch inert ist gegenüber wässrigen Lösungen, kann es zu absorbieren organischen Verbindungen 12. Dies kann mit einem raschen Austausch von Lösungen als organische Verbindungen aus dem Material selbst wenn die Zufuhr dieser Verbindung an dem Einlass wurde gestoppt entweichen kann, beeinträchtigen. Aufgrund der Porosität kann die Verwendung von organischen Lösungsmitteln Aufquellen des PDMS 12.
Wir unterstützen weiterhin die RootChip optimieren und erweitern ihren Nutzen, zum Beispiel mit Wurzeln von Nutzpflanzen. Wir glauben, dass durch die Verbesserung der Zugriff auf das Root für Behandlungen und Beobachtung, Mikrofluidik-Tools wie der RootChip eröffnen sich neue Dimensionen der Wurzel Forschung.
The authors have nothing to disclose.
Wir danken Philipp Denninger um Hilfe bei der Vorbereitung und Video Bhavna Chaudhuri für die Bereitstellung von pflanzlichen Linien auszudrücken FRET-Sensoren. Diese Arbeit wurde durch Mittel der National Science Foundation (MCB 1021677), das Department of Energy (DE-FG02-04ER15542) zu WBF, die National Institutes of Health und dem Howard Hughes Medical Institute an SRQGG unterstützt wurde durch ein EMBO lange unterstützt -Term Fellowship. MM wurde von der Alexander von Humboldt-Stiftung unterstützt.
Items | Source | Information |
Chip carrier, software and other information. | Carnegie Institution – DPB | CAD and CNC files for carrier fabrication, controller software and further information are available for download from the website http://dpb.carnegiescience.edu/technology/rootchip Carriers can also be ordered from this website. |
RootChip | Stanford Foundry | Mask designs and fabrication protocols are available upon request. Ready-to-use RootChips can be ordered from http://www.stanford.edu/group/foundry/ |
Chip controller | -home built- | The automated valve controller system was originally developed by Rafael Gómez-Sjöberg , Lawrence Berkeley National Lab. A detailed instruction how to build your own actuated valve controller can be found at https://sites.google.com/a/lbl.gov/microfluidics-lab/valve-controllers |