تنص هذه المادة على بروتوكول للزراعة شتلات Arabidopsis في RootChip، منصة التصوير ميكروفلويديك الذي يجمع بين التحكم الآلي من شروط النمو مع مراقبة جذر المجهرية والحنق القائم على قياس مستويات الأيض داخل الخلايا.
وظائف الجذر كما المرساة المادية للمصنع، وهي الهيئة المسؤولة عن امتصاص المواد الغذائية والمياه المعدنية مثل عناصر النيتروجين والفوسفور والكبريت والتتبع أن النباتات الحصول من التربة. إذا كنا نريد لوضع نهج مستدامة لإنتاج عالية المحصول، ونحن بحاجة إلى فهم أفضل لكيفية تطور الجذر، يتناول مجموعة واسعة من المواد الغذائية، ويتفاعل مع الكائنات التكافلية والمسببة للأمراض. لتحقيق هذه الأهداف، نحن بحاجة إلى أن تكون قادرة على استكشاف جذور بالتفصيل المجهرية على مدى فترات زمنية تتراوح ما بين دقائق إلى أيام.
قمنا بتطوير RootChip، وهو polydimethylsiloxane (PDMS) – جهاز ميكروفلويديك القائم، والذي يسمح لنا أن تنمو والجذور صورة من الشتلات Arabidopsis مع تجنب أي الاجهاد البدني إلى الجذور خلال التحضير لتصوير 1 (الشكل 1). الجهاز يحتوي على هيكل قناة مشقوقة يضم صمامات الميكرو ميكانيكية لتوجيه تدفق السوائلمن مداخل حل كل دائرة من الدوائر المراقبة 8 2. هذا النظام نضح يسمح تسيطر على المكروية الجذرية وتعديل مع الدقة والسرعة. حجم الدوائر على نحو 400 NL، مما يتطلب سوى كميات ضئيلة من محلول الاختبار.
هنا نقدم بروتوكول مفصل لدراسة علم الأحياء الجذر على RootChip باستخدام التصوير النهج القائمة مع القرار في الوقت الحقيقي. ويمكن تحليل الجذور على مدى عدة أيام باستخدام المجهر مرور الوقت. ويمكن perfused الجذور مع حلول المغذيات أو مثبطات، ويمكن تحليل ما يصل الى ثمانية الشتلات في نفس الوقت. هذا النظام لديه القدرة لمجموعة واسعة من التطبيقات، بما في ذلك تحليل نمو الجذور في وجود أو عدم وجود المواد الكيميائية، ومضان التحليل القائم على التعبير الجيني، وتحليل أجهزة الاستشعار، على سبيل المثال الحنق nanosensors 3.
المزايا الرئيسية لأكثر من وسائل النمو RootChip التقليدية هي إعداد مينيملي للفحص المجهري، والقدرة على عكسية مرارا وتكرارا تغيير البيئة الجذرية، والقدرة على المراقبة المستمرة للأنسجة المختصة انمائيا وصحي من الناحية الفسيولوجية على مدى عدة أيام. سابقا، كانت تزرع الشتلات عموديا على وسائل الإعلام تبلور وتحويلها إلى نظام نضح فورا قبل التجربة، والتي سمح فقط قياس جذور واحدة في وقت واحد 8. وقد استخدمت أدوات ميكروفلويديك لArabidopsis، ولكن على مستوى منخفض التكامل 9 أو بدون مراقبة نضح 10. وRootChip يجمع على مستوى عال من التكامل، مع القدرة على أتمتة التجارب من خلال توجيه تدفق دقيق. ميزة أخرى من هذا المنبر، سمة من جميع أجهزة ميكروفلويديك 11، هو أن هناك حاجة إلى كميات ضئيلة فقط من سائل لتزويد جذر مع الجوز ضروريrients، حتى بالنسبة للتجارب التي تمتد عدة أيام. تم تصميم حاليا RootChip كجهاز تستخدم مرة واحدة، ولكن نظرا لأن تكاليف إنتاج رقائق منخفضة، وكميات صغيرة من الكواشف المستهلكة يجعل من رقاقة جدا لا تزال فعالة من حيث التكلفة.
هناك بضع خطوات الحاسمة التي يجب اتخاذها لضمان صحة والشتلات:
وحدة التخزين في المخاريط البلاستيكية غير ميكروليتر فقط 3-4، والتي سوف تبدأ لتجف عند تعرضها للهواء. وبالتالي فمن الأهمية بمكان أن يتم نقل المخاريط على الرقاقة بسرعة ويتم الاحتفاظ بها رطوبة عالية حتى الجذور قد وصلت إلى غرف المراقبة، والتي سوف تزويدها كميات كافية من المياه. يجب أن يتم تنفيذ الخطوات 4،2-4،5 بسرعة ودون انقطاع لمنع جفاف الشتلات.
خطوات 3،5-3،8 وصف حضانة للرقاقة في وسائل الإعلام السائلة خلالها جذور تنمو في غرف المراقبة. قد يتم تخطي هذه الخطوة من قبل تركيب شريحة في جarrier فورا والبدء نضح مستمر مع متوسط نمو. ومع ذلك، نوصي تمرغ في متوسط نمو بين عشية وضحاها، كما أنها لديها بعض المزايا: 1) أنه يخلق بيئة رطبة وبالتالي فإن الشتلات هم أقل عرضة لتصبح المجفف لأنها تنمو في غرفة المراقبة، 2) وغارقة في رقاقة في السائل، وذلك وسوف التفريغ (الخطوة 6.4) يكون أسرع.
من المهم استخدام وسائل الإعلام مع تركيز المذاب منخفضة. قد تكون الحلول أكثر تركيزا ويعجل تسد القنوات، وخاصة إذا تم استخدام رقاقة على مدى عدة أيام.
بمجرد توصيل الجهاز إلى خط ضغط الهواء، ويتم التحكم في تدفق المتوسطة من خلال تغيير الضغط الهيدروليكي في الصمامات. لضمان إغلاق السليم للصمامات الميكرو ميكانيكية، من المهم اختيار ضغط الرقابة التي هي نحو ثلاثة أضعاف ضغط التدفق. ينبغي للضغط تدفق لا تزيد عن 15 رطل كما سيتم دفع السوائل من مداخل الجذر. ارتفاع الضغوط أماهذ أيضا أن يسبب التبطين للرقاقة، مما يجعل غير صالحة للاستعمال رقاقة.
وجود قيود على RootChip هو أن PDMS يسهل اختراقها ومسعور. في حين أن مادة خاملة عمليا إلى المحاليل المائية، قد امتصاص المركبات العضوية 12. وهذا يمكن أن تتداخل مع التبادل السريع للحلول والمركبات العضوية قد تسرب من المادة حتى عندما تم إيقاف العرض من هذا المركب على مدخل. بسبب المسامية، قد تستخدم المذيبات العضوية يسبب تورم في PDMS 12.
نستمر في تحسين وتوسيع RootChip فائدتها، على سبيل المثال مع جذور نباتات المحاصيل. ونحن نعتقد أن من خلال تحسين الوصول إلى جذر لعلاج والمراقبة، وأدوات ميكروفلويديك مثل RootChip سوف تفتح أبعادا جديدة للبحث جذر.
The authors have nothing to disclose.
نشكر فيليب Denninger للمساعدة في إعداد الفيديو وشودري Bhavna لتوفير خطوط مصنع معربا عن تأكل أجهزة الاستشعار. وأيد هذا العمل من المنح المقدمة من مؤسسة العلوم الوطنية (MCB 1021677)، وزارة الطاقة (DE-FG02-04ER15542) لWBF، والمعاهد الوطنية للصحة، ومعهد هوارد هيوز الطبي لSRQGG كان مدعوما من قبل فترة طويلة EMBO الأجل الزمالة. وأيد MM من قبل مؤسسة الكسندر فون همبولت.
Items | Source | Information |
Chip carrier, software and other information. | Carnegie Institution – DPB | CAD and CNC files for carrier fabrication, controller software and further information are available for download from the website http://dpb.carnegiescience.edu/technology/rootchip Carriers can also be ordered from this website. |
RootChip | Stanford Foundry | Mask designs and fabrication protocols are available upon request. Ready-to-use RootChips can be ordered from http://www.stanford.edu/group/foundry/ |
Chip controller | -home built- | The automated valve controller system was originally developed by Rafael Gómez-Sjöberg , Lawrence Berkeley National Lab. A detailed instruction how to build your own actuated valve controller can be found at https://sites.google.com/a/lbl.gov/microfluidics-lab/valve-controllers |