本文提供中的RootChip的拟南芥幼苗栽培的协议,一个微成像平台,结合微观根监测和基于FRET的细胞代谢水平的测量与自动化控制生长条件。
作为植物的物理锚根职能和机关负责,如氮,磷,硫和微量元素,植物从土壤中获得水分和矿质营养的吸收。如果我们要发展可持续的方法来生产作物产量高,我们需要更好地了解如何根的发展,需要的营养物质很宽的频谱,共生和病原微生物的相互作用。为了实现这些目标,我们需要能够探索随着时间的推移时间从几分钟到几天不等的根在微观细节。
我们开发的RootChip,聚二甲基硅氧烷(PDMS)中-基于微流体装置,它允许我们成长,从拟南芥的形象根,同时避免任何生理上的压力,在制备过程中,根1( 图1)成像。该器件包含一个岔渠道结构,引导流体流动的细观阀门从解决方案入口每8个观察室2。这灌注系统允许根微环境进行控制和修改的精度和速度。室的体积大约是400 NL,因此要求只有极少量的测试解决方案。
在这里,我们提供了一个使用实时分辨率成像为基础的方法RootChip根生物学研究的详细协议。根可超过数天使用时间的推移显微镜分析。根源可以灌注营养液抑制剂,可以并行分析多达八个幼苗。该系统具有潜在的应用范围很广,包括化学品,荧光为基础的基因表达分析,生物传感器分析存在或不存在的情况下在根系生长的分析,如共振的纳米传感器3。
的RootChip比传统的增长方式的主要优点是显微镜微创准备,可逆性和反复改变根环境的能力,和发展主管和生理健康组织的几天内连续观测的能力。此前,幼苗生长垂直上胶凝媒体和立即转移到灌注系统实验前,只允许测量单根时间8。微流控工具,已被用于拟南芥,但一体化水平低9或无灌注控制10。 RootChip结合的高集成度,能够自动通过精确的流量指导实验。这个平台上,所有11个微流体装置的特点,另一个优点是,只有极少量的液体需要提供必要的螺母根rients,甚至跨越数天的实验。 RootChip是目前设计为一个单一用途的设备,但因为芯片的生产成本低,消耗试剂少量使得芯片仍然很合算。
有一个必须采取的几个关键步骤,以保证幼苗的健康:
在塑料锥体的体积只有3-4微升,这将开始干燥时,暴露在空气中。因此它是至关重要的锥体转移到芯片快速和湿度保持高直到根部已经达到了观察室,这将提供足够的水。应迅速执行,并没有中断,以防止幼苗干燥步骤4.2至4.5。
3.5 – 3.8的步骤描述了芯片的液体介质,在此期间,根增长到观察室孵化。这一步可以跳过安装到C芯片arrier立即开始生长介质常数灌注。但是,我们建议在生长培养基浸泡过夜,因为它具有一些优点:1),它创建了一个潮湿的环境,使幼苗不太可能成为干,因为他们成长到观察室; 2)芯片被浸泡在液体中,所以脱气(步骤6.4)会更快。
重要的是要使用低溶质浓度媒体。较为集中的解决方案可能会沉淀,堵塞通道,特别是如果该芯片使用数天。
一旦设备连接到空气压线,流动的介质,通过改变阀门液压控制。为了保证适当的微机械阀门关闭,重要的是选择一个控制压力是比流压力高三倍左右。流压力应不超过15磅,根入口的流体将被推迟。较高的压力,马y也引起脱层的芯片,使芯片无法使用。
是硅橡胶是多孔性和疏水性的RootChip限制。虽然水溶液几乎是惰性材料,它可吸收有机物12。这可能会干扰有机化合物可能泄漏甚至当这种化合物的供应已经停止在进口材料的解决方案的快速交换。由于孔隙率,使用有机溶剂可能引起肿胀的PDMS 12。
我们将继续,优化的RootChip和作物根系,延长它的效用,例如。我们相信,通过改善获得治疗和观察根,像的RootChip微工具将打开根研究的新维度。
The authors have nothing to disclose.
我们感谢帮助提供植物行表示共振传感器与视频准备和Bhavna乔德赫瑞:菲利普Denninger。这项工作是由国家科学基金会(MCB 1021677),能源部(DE-FG02-04ER15542)WBF的,国家卫生研究院,霍华德·休斯医学研究所SRQGG赠款支持由欧洲分子生物学组织长期支持长期研究金。 MM的是由亚历山大·冯·洪堡基金会的支持。
Items | Source | Information |
Chip carrier, software and other information. | Carnegie Institution – DPB | CAD and CNC files for carrier fabrication, controller software and further information are available for download from the website http://dpb.carnegiescience.edu/technology/rootchip Carriers can also be ordered from this website. |
RootChip | Stanford Foundry | Mask designs and fabrication protocols are available upon request. Ready-to-use RootChips can be ordered from http://www.stanford.edu/group/foundry/ |
Chip controller | -home built- | The automated valve controller system was originally developed by Rafael Gómez-Sjöberg , Lawrence Berkeley National Lab. A detailed instruction how to build your own actuated valve controller can be found at https://sites.google.com/a/lbl.gov/microfluidics-lab/valve-controllers |