Denne artikel indeholder en protokol til dyrkning af Arabidopsis planter i RootChip, en mikrofluid billedbehandling platform, der kombinerer automatiseret kontrol af vækstbetingelser med mikroskopiske rod overvågning og FRET-baseret måling af intracellulære metabolit niveauer.
De rod fungerer som den fysiske anker af anlægget, og er det organ, ansvarlig for optagelse af vand og mineralske næringsstoffer som kvælstof, fosfor, sulfat og sporstoffer, at planter erhverver fra jorden. Hvis vi ønsker at udvikle bæredygtige tilgange til at producere højt høstudbytte, er vi nødt til bedre at forstå hvordan roden udvikler sig, tager et bredt spektrum af næringsstoffer, og interagerer med symbiotiske og patogene organismer. For at opnå disse mål, er vi nødt til at være i stand til at udforske rødder i mikroskopiske detaljer i perioder varierende fra minutter til dage.
Vi har udviklet RootChip, en polydimethylsiloxan (PDMS) – baseret mikrofluid enhed, som giver os mulighed for at vokse og billede rødder fra Arabidopsis planter og samtidig undgå fysisk stress til rødderne under forberedelserne til billedbehandling 1 (figur 1). Enheden indeholder en tvedelt kanal struktur byder mikromekaniske ventiler til at styre væskestrømmenfra opløsning indløb til hver af de otte observation kamrene 2. Dette perfusionssystem tillader roden mikromiljø, der skal kontrolleres og modificeres med præcision og hastighed. Volumenet af kamrene er ca 400 nl, hvilket således kræver kun minimale mængder af testopløsning.
Her giver vi en detaljeret protokol for at studere rod biologi på RootChip med imaging-baserede metoder med real time opløsning. Rødder kan analyseres over flere dage med tidsforskydningen mikroskopi. Rødder kan perfunderet med næringsopløsninger eller inhibitorer, og op til otte kimplanter kan analyseres parallelt. Dette system har mulighed for en bred vifte af anvendelser, herunder analyse af rodvækst i nærvær eller fravær af kemikalier, fluorescens-baseret analyse af genekspression og analyse af biosensorer, f.eks FRET nanosensorer 3.
De væsentligste fordele ved RootChip forhold til konventionelle vækst metoder er minimalt invasiv forberedelse mikroskopi, evnen til reversibelt og gentagne gange at ændre roden miljøet og evnen til kontinuerlig overvågning af udviklingsmæssigt kompetent og fysiologisk sundt væv i løbet af en periode på adskillige dage. Tidligere blev kimplanter dyrket lodret gelerede medier og overføres til en perfusionssystem umiddelbart før forsøget, der kun tillades at måle en enkelt rødder på et tidspunkt 8. Mikrofluidenheder værktøjer er blevet brugt til Arabidopsis, men på et lavt integration niveau 9 eller uden perfusion kontrol 10. Det RootChip kombinerer en høj grad af integration med muligheden for at automatisere eksperimenter gennem præcis flow vejledning. En anden fordel ved denne platform, som er karakteristisk for alle mikrofluide anordninger 11, er, at kun minimale mængder af væske skal forsyne roden den nødvendige møtrikkenrients, selv for eksperimenter spænder over flere dage. Den RootChip øjeblikket udformet som en enkelt-brug enhed, men da produktionsomkostningerne for chips er lave, de små mængder af forbruges reagenser gør chippen stadig meget omkostningseffektiv.
Der er et par vigtige skridt, der skal træffes for at sikre sundheden for de planter:
Lydstyrken i plastic kegler er kun 3-4 pi, som vil begynde at tørre, når de udsættes for luft. Derfor er det kritisk, at keglerne overføres på chippen hurtigt og fugtighed holdes høj, indtil roden er nået observation kamre, der forsyner dem med tilstrækkeligt vand. Trin 4,2 til 4,5 skal udføres hurtigt og uden afbrydelse for at forhindre udtørring af frøplanter.
Trin 3.5 – 3.8 beskriver inkubering af chippen i flydende medier, hvor de rødder vokser ind i observation kamre. Dette trin kan springes ved at montere jeton i carrier straks begynder konstant perfusion med vækstmedium. Imidlertid anbefales gennemvædning i vækstmedium natten, da det har nogle fordele: 1) skaber et fugtigt miljø, så kimplanterne er mindre tilbøjelige til at blive tørret som de vokser i observationskammeret, 2) chippen gennemvædes i væsken, således afgasning (trin 6,4) vil være hurtigere.
Det er vigtigt at anvende medier med lave koncentrationer af opløst stof. Mere koncentrerede opløsninger kan udfælde, og tilstoppe kanaler, især hvis chippen anvendes over flere dage.
Når enheden er forbundet til lufttryk linie, er strømmen af medium styres ved at ændre hydraulisk tryk i ventilerne. At sikre en korrekt lukning af mikromekaniske ventiler, er det vigtigt at vælge et styretryk, der er omkring tre gange større end strømningstryk. Strømningen trykket bør ikke overstige 15 psi, idet fluidet vil blive presset ud af de grundliggende indløbene. Højere tryk may også forårsage delaminering af chippen, som gør chip ubrugelig.
En begrænsning af RootChip at PDMS er porøs og hydrofob. Medens materialet er praktisk inert for vandige opløsninger, kan det absorbere organiske forbindelser 12. Dette kan interferere med en hurtig udveksling af opløsninger som organiske forbindelser kan lække fra det materiale, selv når forsyningen af denne forbindelse er blevet stoppet ved indløbet. På grund af porøsiteten kan anvendes organiske opløsningsmidler forårsage kvældning af PDMS 12.
Vi fortsætter med at optimere RootChip og udvide sin funktion, for eksempel med rødder i afgrødeplanter. Vi mener, at ved at forbedre adgangen til roden for behandling og observation, vil mikrofluid værktøjer som RootChip åbne op for nye dimensioner af rod forskning.
The authors have nothing to disclose.
Vi takker Philipp Denninger for at få hjælp med video forberedelse og Bhavna Chaudhuri for at give plante-linjer udtrykker FRET sensorer. Dette arbejde blev støttet af tilskud fra National Science Foundation (MCB 1.021.677), Department of Energy (DE-FG02-04ER15542) til WBF, National Institutes of Health, og Howard Hughes Medical Institute til SRQGG blev understøttet af en EMBO lang sigt fællesskab. MM blev støttet af Alexander von Humboldt Foundation.
Items | Source | Information |
Chip carrier, software and other information. | Carnegie Institution – DPB | CAD and CNC files for carrier fabrication, controller software and further information are available for download from the website http://dpb.carnegiescience.edu/technology/rootchip Carriers can also be ordered from this website. |
RootChip | Stanford Foundry | Mask designs and fabrication protocols are available upon request. Ready-to-use RootChips can be ordered from http://www.stanford.edu/group/foundry/ |
Chip controller | -home built- | The automated valve controller system was originally developed by Rafael Gómez-Sjöberg , Lawrence Berkeley National Lab. A detailed instruction how to build your own actuated valve controller can be found at https://sites.google.com/a/lbl.gov/microfluidics-lab/valve-controllers |