Dit artikel geeft een protocol voor de teelt van Arabidopsis zaailingen in de RootChip, een microfluïdische imaging platform dat automatisch besturen van de voorwaarden voor groei combineert met microscopische wortel monitoring en FRET-gebaseerde meting van intracellulaire metaboliet niveaus.
De wortel fungeert als fysische anker van de plant en het orgaan verantwoordelijk voor opname van water en minerale nutriënten zoals stikstof, fosfor, sulfaat en sporenelementen installaties meten van de grond. Willen we een duurzame aanpak te ontwikkelen voor het produceren van hoge gewasopbrengst, moeten we beter begrijpen hoe de wortel ontwikkelt, neemt een breed spectrum van voedingsstoffen en interactie met symbiotische en pathogene organismen. Om deze doelen te bereiken, moeten we in staat zijn om wortels in microscopisch detail te onderzoeken na verloop van tijd een periode variërend van minuten tot dagen.
We hebben de RootChip, een polydimethylsiloxaan (PDMS) – op basis van microfluïdische apparaat, die ons in staat om te groeien en beeld wortels van Arabidopsis zaailingen zonder dat dit fysieke stress naar de roots van tijdens de voorbereiding van beeldvorming 1 (figuur 1). Het apparaat bevat een gespleten kanaal structuur met micromechanische kleppen om de vloeistofstroom te begeleidenuit de oplossing inlaten elk van de acht waarneming kamers 2. Dit perfusie systeem maakt het mogelijk de wortel micro-omgeving te worden gecontroleerd en aangepast met precisie en snelheid. Het volume van de kamers is ongeveer 400 nl, waarvoor derhalve slechts minimale hoeveelheden meetoplossing.
Hier bieden wij u een gedetailleerd protocol voor het bestuderen van wortel biologie op de RootChip met behulp van imaging-gebaseerde benaderingen met real-time resolutie. Roots kan worden geanalyseerd over een aantal dagen met behulp van time-lapse microscopie. Wortels kunnen worden geperfuseerd met voedingsoplossingen of remmers, en tot acht zaailingen kunnen worden geanalyseerd in parallel. Dit systeem heeft het potentieel voor een breed scala aan toepassingen, waaronder de analyse van wortelgroei in de aanwezigheid of afwezigheid van chemicaliën, fluorescentie-gebaseerde analyse van genexpressie, en de analyse van biosensoren, bijvoorbeeld FRET nanosensoren 3.
De belangrijkste voordelen van de RootChip groei ten opzichte van conventionele methoden zijn de minimaal invasieve voorbereiding voor microscopie, de mogelijkheid om reversibel en herhaaldelijk af aan het wortelmilieu, en de capaciteit voor continue observatie van ontwikkelingsgebied bevoegde en fysiologisch gezond weefsel gedurende een periode van meerdere dagen. Vroeger werden zaailingen verticaal gegroeid op gegeleerde media en overgebracht naar een perfusiesysteem onmiddellijk vóór de proef, waardoor alleen het meten een wortel tegelijk 8. Microfluïdische middelen zijn gebruikt Arabidopsis, maar op een laag niveau integratie 9 of zonder perfusie regelaar 10. De RootChip combineert een hoge mate van integratie met de mogelijkheid om experimenten te automatiseren door middel van een zeer nauwkeurige begeleiding. Een ander voordeel van dit platform kenmerk van microfluïdische apparaten 11, dat slechts minimale hoeveelheden vloeistof moeten de wortel voorzien van de nodige moerRients, zelfs voor experimenten verspreid over meerdere dagen. De RootChip is momenteel ontworpen als een gebruiksvriendelijk apparaat, maar aangezien de productiekosten van chips zijn laag, de kleine hoeveelheden van de verbruikte reagentia maakt de chip nog steeds zeer rendabel.
Er zijn enkele kritische stappen worden genomen om de gezondheid van de zaailingen waarborgen:
Het volume in de kunststof kegels slechts 3-4 pi, die beginnen te drogen bij blootstelling aan lucht. Daarom is het essentieel dat de kegels worden overgebracht snel op de chip en de luchtvochtigheid is hoog gehouden tot aan de wortels hebben bereikt de observatie kamers, die hen zal voorzien van voldoende water. Stappen 4,2 tot 4,5 dient snel en zonder onderbreking het drogen van de zaailingen voorkomen worden.
Stappen 3,5 tot 3,8 beschrijven de incubatie van de chip in vloeibare media waarin de wortels groeien in de waarneming kamers. Deze stap kan worden overgeslagen montage van de chip in de carrier onmiddellijk en het starten van een constante perfusie met groeimedium. Toch raden wij onderdompelen in groeimedium 's nachts, want het heeft een aantal voordelen: 1) het creëert een vochtige omgeving, zodat de zaailingen minder snel gedroogd als ze groeien in de observatie kamer, 2) de chip wordt geweekt in vloeistof, zodat ontgassing (stap 6.4) zal sneller zijn.
Het is belangrijk media met lage concentraties opgeloste stof. Meer geconcentreerde oplossingen kan neerslaan en verstoppen de kanalen, vooral als de chip wordt gedurende meerdere dagen.
Wanneer het apparaat is verbonden met de luchtdruk lijn wordt mediumstroom geregeld door het veranderen hydraulische druk in de kleppen. Om te garanderen goede sluiting van de microbladveren kleppen is belangrijk om een stuurdruk die ongeveer driemaal hoger dan de waterdruk. De waterdruk niet meer dan 15 psi de vloeistof wordt geduwd van de wortel inlaten. Hogere drukken may ook leiden delaminatie van de chip, die de chip onbruikbaar maakt.
Een beperking van de RootChip dat PDMS is poreus en hydrofoob. Hoewel het materiaal nagenoeg inert aan waterige oplossingen, kan absorberen organische verbindingen 12. Dit kan interfereren met een snelle uitwisseling van oplossingen organische verbindingen kunnen lekken van het materiaal zelfs wanneer de toevoer van deze verbinding is gestopt bij de inlaat. Door de porositeit kan met organische oplosmiddelen opzwellen van de PDMS 12.
Wij blijven de RootChip optimaliseren en het nut verlengen, bijvoorbeeld met wortels van gewassen. Wij geloven dat door het verbeteren van de toegang tot de wortel voor behandelingen en observatie, microfluïdische tools zoals de RootChip zal leiden tot nieuwe dimensies van wortel onderzoek.
The authors have nothing to disclose.
Wij danken Philipp Denninger voor hulp bij video-voorbereiding en Bhavna Chaudhuri voor het leveren van planten lijnen uitdrukken FRET sensoren. Dit werk werd ondersteund door subsidies van de National Science Foundation (MCB 1.021.677), het Ministerie van Energie (DE-FG02-04ER15542) om WBF, de National Institutes of Health, en het Howard Hughes Medical Institute te SRQGG werd ondersteund door een EMBO lange termijn gemeenschap. MM werd gesteund door de Alexander von Humboldt Foundation.
Items | Source | Information |
Chip carrier, software and other information. | Carnegie Institution – DPB | CAD and CNC files for carrier fabrication, controller software and further information are available for download from the website http://dpb.carnegiescience.edu/technology/rootchip Carriers can also be ordered from this website. |
RootChip | Stanford Foundry | Mask designs and fabrication protocols are available upon request. Ready-to-use RootChips can be ordered from http://www.stanford.edu/group/foundry/ |
Chip controller | -home built- | The automated valve controller system was originally developed by Rafael Gómez-Sjöberg , Lawrence Berkeley National Lab. A detailed instruction how to build your own actuated valve controller can be found at https://sites.google.com/a/lbl.gov/microfluidics-lab/valve-controllers |