מאמר זה מספק פרוטוקול לגידול שתילים של ארבידופסיס ב RootChip, פלטפורמת הדמיה microfluidic המשלבת שליטה אוטומטית של תנאי הגידול עם מעקב שורש מיקרוסקופי ו להתרגז על בסיס מדידת רמות מטבוליט תאיים.
פונקציות שורש כעוגן הפיזי של המפעל הוא האיבר האחראי על ספיגת המזון בגוף מים מינרלים כגון אלמנטים, חנקן וזרחן, סולפט זכר שצמחים לרכוש מהקרקע. אם אנחנו רוצים לפתח גישות קיימא לייצור היבול גבוה, עלינו להבין טוב יותר כיצד השורש מפתחת, תופס קשת רחבה של חומרים מזינים, וכן אינטראקציה עם אורגניזמים פתוגניים ו סימביוטיים. כדי להשיג מטרות אלו, אנו צריכים להיות מסוגלים לחקור את השורשים בפירוט מיקרוסקופי על פני פרקי זמן הנעים בין דקות יום.
פיתחנו RootChip, polydimethylsiloxane (PDMS) – מכשיר microfluidic מבוסס, אשר מאפשר לנו לגדול השורשים תמונה שתילים ארבידופסיס תוך הימנעות מכל מתח פיזי לשורשים במהלך הכנת הדמיה 1 (איור 1). המכשיר מכיל מבנה הערוץ מפוצלת הכוללת שסתומים micromechanical להנחות את זרימת הנוזלמתוך פתחי הכניסה פתרון לכל אחד משמונת החדרים תצפית 2. מערכת זו מאפשרת זלוף microenvironment שורש כדי להיות מבוקר שונה עם דיוק ומהירות. נפח החדרים הוא כ 400 NL, וכן הוא מחייב רק כמויות מזעריות של פתרון המבחן.
כאן אנו מספקים פרוטוקול מפורט לחקר הביולוגיה שורש על RootChip באמצעות הדמיה מבוססי גישות עם רזולוציה בזמן אמת. השורשים ניתן לנתח על פני כמה ימים באמצעות מיקרוסקופיה זמן לשגות. השורשים ניתן perfused עם פתרונות או מעכבי תזונתיים, ועד 8 שתילים ניתן לנתח במקביל. במערכת זו יש פוטנציאל עבור מגוון רחב של יישומים, כולל ניתוח של צמיחה שורש בנוכחות או העדר של כימיקלים, הקרינה מבוסס ניתוח של ביטוי גנים, ועל ניתוח של biosensors, למשל סריג nanosensors 3.
היתרונות העיקריים של RootChip על פני שיטות גידול המקובלות הן הכנה פולשנית מיקרוסקופיה, היכולת הפיך שוב ושוב לשנות את סביבת השורש, ויכולת תצפית רציפה של רקמות מוסמכת מבחינה התפתחותית ובריא מבחינה פיזיולוגית על פני תקופה של מספר ימים. בעבר, שתילים גדלו בצורה אנכית על התקשורת תסרוקת והועברו מערכת טפטוף מיד לפני הניסוי, אשר אפשרה רק מדידה שורשים בודדים בכל פעם 8. כלים microfluidic שימשו במשך ארבידופסיס, אבל ברמה נמוכה אינטגרציה 9 או ללא שליטה זלוף 10. RootChip משלב רמה גבוהה של אינטגרציה עם היכולת להפוך ניסויים באמצעות הדרכה תזרים מדויק. יתרון נוסף של הפלטפורמה הזו, האופיינית כל התקנים microfluidic 11, הוא רק כמויות מזעריות של נוזל נדרשים לספק את השורש עם אגוז צורךrients, גם עבור ניסויים פורש מספר ימים. RootChip מיועד כיום כאמצעי יחיד לשימוש, אבל מאז עלויות הייצור של שבבי נמוכות, את כמויות קטנות של חומרים כימיים צרכו עושה את השבב עדיין מאוד חסכונית.
ישנם מספר שלבים קריטיים כמה שיש לנקוט כדי להבטיח את בריאותם של שתילים את:
נפח את גביעי פלסטיק רק μl 3-4, אשר יתחיל להתייבש כאשר נחשף לאוויר. לכן זה קריטי, כי את הקונוסים מועברים על גבי שבב במהירות והלחות נשמרת גבוהה עד השורשים הגיעו לתאי תצפית, אשר יספק להם מספיק מים. צעדים 4.2 ל 4.5 יש לבצע במהירות וללא הפסקה כדי למנוע התייבשות של השתילים.
צעדים 3.5 – 3.8 לתאר את הדגירה של השבב בתקשורת נוזלי שבמהלכו השורשים לצמוח לתאי תצפית. שלב זה ניתן לדלג על ידי הרכבה שבב לתוך גarrier מיד החל טפטוף מתמיד עם צמיחה בינונית. עם זאת, אנו ממליצים על השריית במדיום הגידול בין לילה, שכן יש כמה יתרונות: 1) הוא יוצר סביבה לחה כל כך את השתילים נוטים פחות להיות מיובש כאשר הם גדלים לתוך חדר תצפיות, 2) שבב ספוגה בנוזל, כך degassing (שלב 6.4) יהיה מהיר יותר.
חשוב להשתמש במדיה עם ריכוז המומס נמוך. תמיסות מרוכזות יותר עלולה לעורר ולסתום את הערוצים, במיוחד אם השבב משמש על פני כמה ימים.
ברגע שהמכשיר מחובר לקו לחץ האוויר, זרם בינוני נשלטת על ידי שינוי הלחץ ההידראולי של השסתומים. כדי להבטיח את סגירת נכון של השסתומים micromechanical, חשוב לבחור שליטה בלחץ כי הוא בערך פי שלושה מאחוז לחץ הזרימה. לחץ זרימת לא יעלה על 15 psi כמו נוזל יהיה דחף מתוך פתחי הכניסה שורש. לחצים גבוהים יותר מאY גם לגרום delamination של השבב, אשר הופך לא שמיש שבב.
הגבלה של RootChip היא PDMS הוא נקבובי הידרופובי. אמנם החומר הוא אינרטי מעשית תמיסות מימיות, הוא עלול לספוג תרכובות אורגניות 12. זה יכול להפריע חילופי מהירה של פתרונות כמו תרכובות אורגניות עלול לדלוף מן החומר גם כאשר האספקה של מתחם זה כבר עצר כניסת. עקב נקבוביות, שימוש בממסים אורגניים עלולה לגרום לנפיחות של PDMS 12.
אנו ממשיכים לייעל את RootChip ולהרחיב השירות שלה, למשל עם שורשים של צמחים הצומח. אנו מאמינים כי על ידי שיפור הגישה שורש עבור טיפולים תצפית, כלי microfluidic כמו RootChip תפתח מימדים חדשים של מחקר השורש.
The authors have nothing to disclose.
אנו מודים פיליפ Denninger לעזרה עם וידאו הכנה Bhavna צ'אודהורי למתן קווי צמחים המבטאים מאיימות חיישנים. עבודה זו נתמכה על ידי מענקי הקרן הלאומית למדע (MCB 1021677), מחלקת האנרגיה (DE-FG02-04ER15542) כדי WBF, מכון הבריאות הלאומי, ואת הווארד יוז רפואי במכון כדי SRQGG נתמך על ידי רב EMBO טווח המילגה. MM נתמך על ידי אלכסנדר פון הומבולדט קרן.
Items | Source | Information |
Chip carrier, software and other information. | Carnegie Institution – DPB | CAD and CNC files for carrier fabrication, controller software and further information are available for download from the website http://dpb.carnegiescience.edu/technology/rootchip Carriers can also be ordered from this website. |
RootChip | Stanford Foundry | Mask designs and fabrication protocols are available upon request. Ready-to-use RootChips can be ordered from http://www.stanford.edu/group/foundry/ |
Chip controller | -home built- | The automated valve controller system was originally developed by Rafael Gómez-Sjöberg , Lawrence Berkeley National Lab. A detailed instruction how to build your own actuated valve controller can be found at https://sites.google.com/a/lbl.gov/microfluidics-lab/valve-controllers |