Questo articolo fornisce un protocollo per la coltivazione di piantine di Arabidopsis in RootChip, una piattaforma di imaging microfluidico che combina controllo automatizzato delle condizioni di crescita con il monitoraggio radice al microscopio e FRET-based misura i livelli di metaboliti intracellulari.
Le funzioni principali come l'ancoraggio fisico della pianta ed è l'organo responsabile per l'assorbimento delle sostanze nutritive e di acqua minerale, quali elementi azoto, fosforo, solfato e la traccia che acquisiscono le piante dal terreno. Se vogliamo sviluppare approcci sostenibili alla produzione di colture ad alto rendimento, abbiamo bisogno di capire meglio come la radice si sviluppa, occupa un ampio spettro di nutrienti, e interagisce con gli organismi simbiotici e patogeni. Per raggiungere questi obiettivi, dobbiamo essere in grado di esplorare le radici in dettaglio microscopico su periodi di tempo che vanno da minuti a giorni.
Abbiamo sviluppato il RootChip, un polidimetilsilossano (PDMS) – dispositivo basato su microfluidica, che ci permette di crescere e radici immagini da piantine di Arabidopsis evitando qualsiasi stress fisico alle radici durante la preparazione per l'imaging 1 (figura 1). Il dispositivo contiene una struttura biforcata canale dotato di valvole micromeccanici per guidare il flusso del fluidoda insenature soluzione a ciascuno degli otto camere di osservazione 2. Questo sistema permette la perfusione microambiente radice da controllare e modificato con precisione e rapidità. Il volume delle camere è di circa 400 nl, richiedendo così soltanto quantità minime di soluzione campione.
Qui forniamo un protocollo dettagliato per studiare la biologia root sul RootChip utilizzando l'imaging basate su approcci con la risoluzione in tempo reale. Le radici possono essere analizzati più giorni utilizzando la microscopia lasso di tempo. Roots può essere perfuso con soluzioni nutritive o inibitori, e fino a otto giovani pianta possono essere analizzati in parallelo. Questo sistema ha il potenziale per una vasta gamma di applicazioni, compresa l'analisi della crescita delle radici in presenza o assenza di sostanze chimiche, basato sulla fluorescenza analisi di espressione genica, e l'analisi dei biosensori, ad esempio FRET nanosensori 3.
I vantaggi principali del RootChip rispetto ai metodi convenzionali di crescita sono la preparazione minimamente invasivo per la microscopia, la capacità di alterare reversibilmente e ripetutamente l'ambiente radice, e la capacità di osservazione continua di tessuto evolutivamente competente e fisiologicamente sano per un periodo di diversi giorni. In precedenza, piantine sono state cresciute verticalmente su supporti gelificati e trasferiti ad un sistema di perfusione immediatamente prima dell'esperimento, che ha consentito solo misurando radici uno alla volta 8. Strumenti microfluidici sono stati utilizzati per Arabidopsis, ma su un livello di integrazione basso 9 o senza controllo perfusione 10. Il RootChip combina un elevato livello di integrazione con la possibilità di automatizzare gli esperimenti attraverso l'orientamento del flusso preciso. Un altro vantaggio di questa piattaforma, caratteristica di tutti i dispositivi microfluidici 11, è che solo quantità minime di liquido sono tenuti a fornire alla radice con il dado necessariaRients, anche per gli esperimenti che coprono diversi giorni. Il RootChip è attualmente concepito come un dispositivo monouso, ma dal momento che i costi di produzione di chip sono bassi, le piccole quantità di reagenti consumati rende il chip ancora molto conveniente.
Ci sono alcuni punti critici che devono essere adottate per garantire la salute delle piantine:
Il volume dei coni di plastica è solo ul 3-4, che inizierà ad asciugare se esposto all'aria. Quindi è importante che i coni vengono trasferiti sul chip rapidamente e l'umidità è mantenuta alta fino a quando le radici hanno raggiunto le camere di osservazione, che li alimentano con acqua sufficiente. Passi 4.2 a 4.5 devono essere eseguite in modo rapido e senza interruzioni per evitare l'essiccazione delle piantine.
Passi 3.5 – 3.8 descrivono l'incubazione del chip in mezzi liquidi durante il quale le radici crescono nelle camere di osservazione. Questo passaggio può essere saltato montando il chip nel carrier immediatamente e partendo perfusione costante con terreno di crescita. Tuttavia, si consiglia ammollo nel mezzo di crescita per tutta la notte, in quanto ha alcuni vantaggi: 1) crea un ambiente umido in modo che le piantine sono meno probabilità di diventare essiccata man mano che crescono nella camera di osservazione; 2) il chip è imbevuta di liquido, in modo degassamento (step 6.4) sarà più veloce.
E 'importante utilizzare supporti con basse concentrazioni di soluto. Le soluzioni più concentrate possono precipitare e intasare i canali, specialmente se il chip viene utilizzato per diversi giorni.
Una volta che il dispositivo è collegato alla linea di pressione dell'aria, il flusso del fluido è controllata regolando la pressione idraulica nelle valvole. Per garantire la corretta chiusura delle valvole micromeccanici, è importante scegliere una pressione di comando che è circa tre volte superiore alla pressione del flusso. La pressione del flusso non deve superare i 15 psi come il fluido verrà spinto fuori delle bocche di radice. Pressioni più elevate ragazzoy anche causare delaminazione del chip, il che rende inutilizzabile chip.
Una limitazione è che RootChip PDMS è poroso e idrofobo. Mentre il materiale è praticamente inerti di soluzioni acquose, può assorbire composti organici 12. Questo può interferire con un rapido scambio di soluzioni di composti organici potrebbe fuoriuscire dal materiale, anche quando la fornitura di questo composto è stato fermato all'ingresso. A causa della porosità, che utilizza solventi organici può causare gonfiore del PDMS 12.
Si continua a ottimizzare il RootChip ed estendere la sua utilità, ad esempio con radici delle piante coltivate. Siamo convinti che migliorando l'accesso alla radice per i trattamenti e di osservazione, strumenti come la microfluidica RootChip aprirà nuove dimensioni della ricerca root.
The authors have nothing to disclose.
Ringraziamo Philipp Denninger aiuto con video di preparazione e Bhavna Chaudhuri per la fornitura di linee di piante che esprimono FRET sensori. Questo lavoro è stato supportato anche da finanziamenti della National Science Foundation (MCB 1.021.677), il Dipartimento dell'Energia (DE-FG02-04ER15542) al WBF, il National Institutes of Health, e la Howard Hughes Medical Institute a SRQGG è stato sostenuto da un lungo EMBO termine borsa di studio. MM è stato sostenuto dalla Alexander von Humboldt Foundation.
Items | Source | Information |
Chip carrier, software and other information. | Carnegie Institution – DPB | CAD and CNC files for carrier fabrication, controller software and further information are available for download from the website http://dpb.carnegiescience.edu/technology/rootchip Carriers can also be ordered from this website. |
RootChip | Stanford Foundry | Mask designs and fabrication protocols are available upon request. Ready-to-use RootChips can be ordered from http://www.stanford.edu/group/foundry/ |
Chip controller | -home built- | The automated valve controller system was originally developed by Rafael Gómez-Sjöberg , Lawrence Berkeley National Lab. A detailed instruction how to build your own actuated valve controller can be found at https://sites.google.com/a/lbl.gov/microfluidics-lab/valve-controllers |