이 문서 RootChip의 Arabidopsis 모종 배양을위한 프로토콜, 미세한 루트 모니터링 및 세포내 신진 대사 단계의 걱정 기반의 측정과 성장 조건의 자동 제어를 결합한 microfluidic 이미징 플랫폼을 제공합니다.
뿌리 식물의 물리적 앵커와 같은 기능과 같은 식물이 토양으로부터 취득하는 질소, 인, 황산 및 추적 구성 요소로서 물과 미네랄 영양소의 이해에 대한 책임 기관입니다. 우리가 높은 작물 수확량을 생산에 지속적인 접근법을 개발하고자한다면, 우리는 더 뿌리가 영양분의 다양한 스펙트럼을 소요하고, 공생과 병원성 유기체와 상호 작용, 개발 방법을 이해해야합니다. 이러한 목표를 달성하기 위해, 우리는 몇 분 거리 일까지 기간 동안 미세한 자세하게 뿌리를 탐구 할 수 있어야합니다.
기반 microfluidic 장치, 이미징 1 (그림 1)에 대한 준비를하는 동안 뿌리에 어떠한 물리적인 스트레스를 피하는 동안 우리 Arabidopsis 모종의 성장 및 이미지 뿌리하실 수 있습니다 – 우리는 RootChip, polydimethylsiloxane (PDMS)을 개발했다. 장치는 유체 흐름을 안내하는 micromechanical 밸브를 갖춘 bifurcated 채널 구조를 포함솔루션 inlets에서 8 개의 관측 실이 각각 있습니다. 이 관류 시스템은 루트 microenvironment를 조절하고 정밀도와 속도로 수정할 수 있습니다. 챔버의 부피 따라서 테스트 솔루션에만 최소한의 금액을 필요로하는 약 400 NL이다.
여기 실시간 해상도로 영상 기반 접근 방법을 사용하여 RootChip에 루트 생물학을 공부를위한 상세한 프로토콜을 제공합니다. 뿌리는 시간 저속 현미경을 사용하여 며칠 동안 분석할 수 있습니다. 루츠는 영양 솔루션이나 저해제로 perfused 수 있으며, 최대 8 모종은 병렬로 분석할 수 있습니다. 이 시스템은 화학, 유전자 발현의 형광 기반의 분석 및 biosensors의 분석의 존재 또는 부재의 루트 성장의 분석을 포함하여 어플 리케이션의 광범위한 잠재력을 가지고, 예를 들어이 nanosensors 3 초조해.
기존의 성장 방식을 통해 RootChip의 주요 장점은 현미경을위한 최소한 침략적 준비, reversibly 반복 루트 환경을 변경할 수있는 능력, 그리고 몇 일간의 기간 동안 발달 능력과 생리학적으로 건강한 조직의 지속적인 관찰을위한 용량입니다. 이전에는 모종은 gelled 미디어에 수직으로 성장되었으며 한 번에 8 시에 하나의 뿌리를 측정하는 허용 실험 직전 관류 시스템에 전송. Microfluidic 도구는 Arabidopsis에게뿐만 아니라 낮은 통합 레벨 9 또는 관류 컨트롤 열없이 사용되었습니다. RootChip 정확한 흐름지도를 통해 실험을 자동화하는 기능과 함께 통합의 높은 수준을 자랑합니다. 모든 microfluidic 장치 11 특성이 플랫폼, 또 다른 이점은 액체의 단지 최소한의 금액이 필요한 너트와 루트를 제공하는 데 필요한 것입니다심지어 며칠 걸치는 실험을위한 rients. RootChip는 현재 단일 사용 장치로 설계되어 있지만, 칩의 생산 비용이 낮은이기 때문에, 소비 시약의 소량은 여전히 매우 비용 효율적인 칩을 만들 수 있습니다.
모종의 건강을 보장하기 위해 촬영해야합니다 몇 가지 중요한 단계가 있습니다 :
플라스틱 원뿔의 부피는 공기에 노출되면 건조되기 시작합니다서만 3-4 μl입니다. 따라서 그것은 원뿔이 빠르게 칩에 전송되고 뿌리가 충분한 물로 그들을 공급할 것입니다 전망대 챔버를 도달할 때까지 습도가 높은 유지되는 것이 중요합니다. 4.2-4.5 단계는 빠르고 모종의 건조를 방지하기 위해 중단없이 수행되어야한다.
단계 3.5-3.8는 뿌리가 관측 실로 성장하는 동안에 액체 매체 칩의 인큐베이션을 설명합니다. 이 단계는 C에 칩을 장착하여 생략 수 있습니다arrier 즉시과 성장 매체와 지속적인 관류를 시작합니다. 그것이 몇 가지 장점이있다 그러나, 우리는 하룻밤 사이에 성장 매체에 몸을 담글 좋습니다 묘목들이 관찰 챔버로 성장로서 desiccated 될 확률이 적은있다 그래야 그것이 습한 환경을 조성 1), 2) 칩은 액체에 배어 있으므로 degassing (6.4 단계)이 빠르게 될 것입니다.
그것은 낮은 용질 농도와 미디어를 사용하는 것이 중요합니다. 더 농축 솔루션은 칩은 며칠 동안 사용되고 특히, 침전 및 채널을 방해할 수 있습니다.
장치가 공기 압력 라인에 연결되면, 매체의 유량은 밸브의 유압 압력을 변경하여 제어됩니다. micromechanical 밸브의 적절한 종결을 보장하기 위해서는 유동 압력보다 약 세 배 높다 제어 압력을 선택하는 것이 중요합니다. 유체가 루트 inlets에서 밀쳐되므로 유동 압력이 15 Psi를 넘지 않아야합니다. 높은 압력 mAY는 또한 칩을 사용할 수 없게를 렌더링 칩, 박리의 원인.
RootChip의 제한은 PDMS는 다공성과 소수성이라는 것입니다. 자료가 수성 솔루션에 거의 불활성이지만, 그것은 유기 화합물에게 12 흡수할 수 있습니다. 이것은 유기 화합물이 화합물의 공급 장치가 입구에서 중지되었습니다에도 물질로부터 누출 수 있으므로 솔루션의 신속한 교환을 방해할 수 있습니다. 다공성으로 인해 유기 용제를 사용하면 PDMS 12 부기의 원인이 될 수 있습니다.
우리는 작물 식물의 뿌리 RootChip을 최적화하고 예를 들어, 자사의 유틸리티를 확장하는 것을 계속한다. 우리는 치료와 관찰에 대한 루트 액세스를 향상시킴으로써, RootChip 같은 microfluidic 도구 루트 연구의 새로운 차원을 열었을 것입니다.
The authors have nothing to disclose.
우리는 센서를 안달 표현 공장 라인을 제공하기위한 동영상 준비와 Bhavna Chaudhuri과 관련하여 도움이 필립 Denninger 감사드립니다. 이 작품은 국립 과학 재단 (MCB 1,021,677), WBF, 국립 보건원에 에너지학과 (DE-FG02-04ER15542) 및 SRQGG에 하워드 휴즈 의학 연구소에서 교부금에 의해 지원되었다하는 것은 EMBO 길이에 의해 지원되었다 교제 – 용어입니다. MM은 알렉산더 폰 훔볼트 재단에 의해 지원되었다.
Items | Source | Information |
Chip carrier, software and other information. | Carnegie Institution – DPB | CAD and CNC files for carrier fabrication, controller software and further information are available for download from the website http://dpb.carnegiescience.edu/technology/rootchip Carriers can also be ordered from this website. |
RootChip | Stanford Foundry | Mask designs and fabrication protocols are available upon request. Ready-to-use RootChips can be ordered from http://www.stanford.edu/group/foundry/ |
Chip controller | -home built- | The automated valve controller system was originally developed by Rafael Gómez-Sjöberg , Lawrence Berkeley National Lab. A detailed instruction how to build your own actuated valve controller can be found at https://sites.google.com/a/lbl.gov/microfluidics-lab/valve-controllers |