Эта статья предусматривает протокол для выращивания рассады в Arabidopsis RootChip, микрофлюидных платформы визуализации, которая сочетает в себе автоматизированного контроля условий роста микроскопических мониторинга корня и FRET-измерительные внутриклеточных метаболитов.
Корневых функций, как физическое якорь завода и является органом, ответственным за поглощение воды и минеральных питательных веществ, таких как азот, фосфор, сульфат-и микроэлементов, что растения получают от почвы. Если мы хотим развивать устойчивые подходы к производству высокий урожай, мы должны лучше понять, как корень развивается, занимает широкий спектр питательных веществ, и взаимодействует с симбиотических и патогенных организмов. Для достижения этих целей, мы должны быть в состоянии исследовать корни в микроскопических деталей на сроки от нескольких минут до нескольких дней.
Мы разработали RootChip, полидиметилсилоксана (PDMS) – на основе микрофлюидных устройство, которое позволяет нам расти и изображение корни саженцев Arabidopsis избегая любой физической нагрузки на корнях при подготовке изображений 1 (рис. 1). Устройство содержит раздвоенные структуры канала с участием микромеханических клапаны для направления потока жидкостиРешение от входов в каждой из восьми камер наблюдения 2. Эта система позволяет перфузии корень микросреды необходимо контролировать и модифицировать с точностью и скоростью. Объем камеры составляет около 400 нл, что требует минимального количества исследуемого раствора.
Ниже мы предлагаем подробный протокол для изучения биологии в корень RootChip использование изображений подходы с реальным разрешением по времени. Корни могут быть проанализированы в течение нескольких дней с помощью микроскопа промежуток времени. Корни можно будет озарен питательных растворов или ингибиторов, и до восьми саженцы могут быть проанализированы параллельно. Эта система обладает потенциалом для широкого спектра приложений, в том числе анализ роста корней в присутствии или отсутствии химических веществ, флуоресценция основе анализа экспрессии генов, а также анализ биосенсоров, например FRET-наносенсоров 3.
Основные преимущества RootChip сравнению с традиционными методами роста малоинвазивных подготовки к микроскопии, способность обратимо и неоднократно менять корневой окружающей среды и потенциала для непрерывного наблюдения за умственно компетентный и физиологически здоровых тканей в течение нескольких дней. Ранее, саженцы были выращены вертикально геля средств массовой информации и передается перфузии системы непосредственно перед экспериментом, который разрешен только одно измерение корнями в то время 8. Микрофлюидных средства были использованы для Arabidopsis, но на низком уровне интеграции 9 или без перфузии управления 10. RootChip сочетает в себе высокий уровень интеграции с возможностью автоматизации экспериментов по точным руководством потока. Еще одним преимуществом этой платформы, характерные для всех микрожидкостных устройств 11, в том, что только минимальное количество жидкости, необходимый для питания корневой необходимые гайкиrients, даже эксперименты на протяжении нескольких дней. RootChip В настоящее время разработана в качестве одноразовых устройств, но, поскольку издержки производства чипов низки, небольшое количество потребляемых реагентов делает чип еще очень рентабельным.
Есть несколько важных шагов, которые необходимо предпринять, чтобы гарантировать здоровье рассады:
Объем в пластиковых конусов составляет всего 3-4 мкл, который начнет сохнуть на воздухе. Поэтому очень важно, что конусы передаются на чип быстрее и влажность сохраняется высоким до корней достигли камер наблюдения, которые будут снабжать их достаточным количеством воды. Шаги 4,2 до 4,5 должна быть выполнена быстро и без перерывов, чтобы предотвратить высыхание саженцев.
Шаги 3,5 – 3,8 описывают инкубации чипов в жидких средах, в течение которого корни растут в наблюдение камер. Этот шаг может быть пропущен по установке чипа в сarrier немедленно и начать постоянный перфузии питательной среды. Тем не менее, мы рекомендуем замачивания в питательную среду ночью, так как он имеет ряд преимуществ: 1) она создает влажную среду, поэтому саженцы имеют меньше шансов стать сухой, как они растут в камере наблюдения, 2) чип замачивают в жидкости, так дегазации (шаг 6.4) будет быстрее.
Важно использовать средства массовой информации с низкой концентрацией растворенного вещества. Более концентрированные растворы могут ускорить и закупоривают каналы, особенно, если чип используется в течение нескольких дней.
Когда устройство подключено к линии давления, расхода среднего регулируется путем изменения гидравлического давления в клапанах. Для обеспечения надлежащего закрытия микромеханических клапаны, важно выбрать контроля давления, что примерно в три раза выше, чем давление потока. Давление потока не должна превышать 15 фунтов на квадратный дюйм, как жидкость будет выталкиваться из коренных заливов. Более высокие давления мау вызвать отслоение чипе, что делает чип из строя.
Ограничение RootChip в том, что PDMS является пористым и гидрофобные. В то время как материал практически инертны к водным растворам, он может поглощать органические соединения 12. Это может помешать быстрому обмену решениями, органические соединения могут вылиться из материала, даже если поставки этого препарата была остановлена на входе. В связи с пористостью, с использованием органических растворителей может вызвать отек PDMS 12.
Мы продолжаем оптимизировать и расширить RootChip его полезность, например, с корней культурных растений. Мы считаем, что улучшение доступа к корневым для лечения и наблюдения, микрофлюидных инструменты, такие как RootChip откроет новые размеры корневой исследований.
The authors have nothing to disclose.
Мы благодарим Филипп Denninger за помощь в подготовке и видео Bhavna Чаудхури для обеспечения завода линии, экспрессирующие ладу датчиков. Эта работа была поддержана грантами от Национального научного фонда (MCB 1021677), Министерство энергетики (DE-FG02-04ER15542) в WBF, Национальные институты здравоохранения и Медицинского института Говарда Хьюза в SRQGG была поддержана EMBO долго срок общения. ММ при поддержке Фонда Александра фон Гумбольдта.
Items | Source | Information |
Chip carrier, software and other information. | Carnegie Institution – DPB | CAD and CNC files for carrier fabrication, controller software and further information are available for download from the website http://dpb.carnegiescience.edu/technology/rootchip Carriers can also be ordered from this website. |
RootChip | Stanford Foundry | Mask designs and fabrication protocols are available upon request. Ready-to-use RootChips can be ordered from http://www.stanford.edu/group/foundry/ |
Chip controller | -home built- | The automated valve controller system was originally developed by Rafael Gómez-Sjöberg , Lawrence Berkeley National Lab. A detailed instruction how to build your own actuated valve controller can be found at https://sites.google.com/a/lbl.gov/microfluidics-lab/valve-controllers |