Bu makale RootChip içinde Arabidopsis fide ekimi için bir protokol, mikroskobik kök izleme ve hücre içi metabolit düzeylerinin FRET tabanlı ölçümü ile büyüme koşullarını otomatik kontrol birleştiren bir mikroakışkan görüntüleme platform sağlar.
Kök bitkinin fiziksel çapa olarak fonksiyonları ve bu tür bitkilerin topraktan edindiğiniz azot, fosfor, sülfat ve eser elementler olarak su ve mineral besin alımı sorumlu bir organdır. Biz yüksek mahsul üreten sürdürülebilir yaklaşımlar geliştirmek istiyorsak, daha iyi kök besinlerin geniş bir spektrum kaplıyor ve simbiyotik ve patojen organizmalar ile etkileşime, nasıl geliştiğini anlamak gerekir. Bu hedefleri gerçekleştirmek için, biz dakika gün arasında değişen süreler içinde mikroskobik ayrıntılı köklerini keşfetmek gerekiyor.
Tabanlı mikro cihaz, görüntüleme 1 (Şekil 1) için hazırlık sırasında köklerine herhangi bir fiziksel stres kaçınarak bize Arabidopsis fidecilikten büyümeye ve görüntü kökleri sağlar – Biz RootChip, bir polidimetilsiloksan (PDMS) geliştirdi. Cihaz sıvı akışını yönlendirmek için mikromekanik vanalar featuring çatallı kanal yapısı içerençözeltisi girişlerden itibaren sekiz gözlem odalarına 2 her birine. Bu perfüzyon sistemi kök mikro kontrollü ve kesinlik ve hız ile değiştirilmiş izin verir. Odalarının hacmi dolayısıyla testi çözümün sadece az miktarda gerektiren, yaklaşık 400 nl olduğunu.
Burada gerçek zamanlı çözünürlüklü görüntüleme tabanlı yaklaşımlar kullanılarak RootChip kök biyolojisi çalışmaları için ayrıntılı bir protokol sağlar. Kökler time lapse mikroskobu kullanarak birkaç gün içinde analiz edilebilir. Kökler besin çözümler veya inhibitörleri ile perfüze edilebilir ve sekiz fidan paralel olarak analiz edilebilir. Bu sistem, kimyasal maddeler, gen ekspresyonunun floresans bazlı analizi, ve biyosensör analizi varlığında veya yokluğunda büyüme kök analizi de dahil olmak üzere, geniş bir uygulama alanı için potansiyele sahip, örneğin nanosensors 3 FRET.
Klasik büyüme yöntemleri üzerinde RootChip başlıca avantajları mikroskopi için minimal invaziv hazırlanması, geri dönüşümlü ve tekrar tekrar kök çevrelerini değiştirme yeteneği ve birkaç gün bir süre içinde gelişimsel olarak yetkili ve fizyolojik sağlıklı doku sürekli gözetim için, kapasitesi vardır. Daha önce, fide jölelenmişti medya dikey yetiştiği ve sadece bir kez 8 de tek kök ölçüm izin deney, hemen önce bir perfüzyon sistemine aktarılabilir. Mikroakışkan araçları Arabidopsis için değil, düşük entegrasyon seviyesi 9 veya perfüzyon kontrolü 10 görülmemiştir. RootChip hassas akış rehberlik yoluyla deneyler otomatikleştirmek yeteneği ile bütünleşme yüksek düzeyde birleştirir. Tüm mikroakışkan cihazlar 11 karakteristik özelliği, bu platform, diğer bir avantajı, bu sıvı, sadece minimum miktarda gerekli somun ile kök talep edilen birHatta birkaç gün süren deneyler için rients. RootChip şu anda tek kullanımlık bir cihaz olarak tasarlanmış, ancak fişleri üretim maliyetleri düşük olduğundan, tüketilen reaktif küçük miktarlarda hala çok düşük maliyetli yonga yapar.
Fide sağlığı garanti etmek için alınması gereken birkaç önemli adım vardır:
Plastik koni içinde hacim havaya maruz kaldığında kurumaya başlayacak sadece 3-4 ul vardır. Dolayısıyla konileri hızlı yonga üzerine aktarılır ve kökler yeterli su ile tedarik edecek gözlem odaları, ulaşana kadar nem oranının yüksek tutulması önemlidir. 4,2-4,5 adımlar hızlı ve fide kurumasını önlemek için kesintisiz yapılmalıdır.
Adımlar 3,5-3,8 kökleri gözlem odalarına büyümeye sırasında sıvı ortamda çip kuluçka açıklar. Bu adım c içine çip monte edilerek atlanabilirarrier hemen ve büyüme ortamı ile sürekli perfüzyon başlıyor. Bazı avantajları vardır Ancak, biz, gece büyüme ortamında iliklerine tavsiye: filizlere gözlem odasına büyüdükçe kurumuş olma ihtimali daha azdır bu yüzden nemli bir ortam oluşturur 1); 2) çip sıvı içinde kalıyor, bu yüzden Gaz alma (adım 6.4) daha hızlı olacaktır.
Düşük solüt konsantrasyonu ile medya kullanmak önemlidir. Daha konsantre solüsyonlar çip birkaç gün içinde kullanıldığında, özellikle çökelmesi ve kanalları tıkayabilir.
Cihaz, hava basıncı hattına bağlı sonra, orta akışı vanalar hidrolik basınç değiştirerek kontrol edilir. Mikromekanik vanalar doğru kapatılması sağlamak için, akış basıncı yaklaşık üç kat daha fazla kontrol basıncı seçmek önemlidir. Sıvı kök girişlerinin basılmış olacaktır gibi akış basıncı 15 psi geçmemelidir. Yüksek basınç may da çip kullanılamaz hale getirmektedir çip, bir delaminasyon neden olur.
RootChip bir sınırlandırma PDMS gözenekli ve hidrofobik olmasıdır. Malzeme sulu çözeltiler pratik olarak eylemsiz iken, organik bileşikler 12 absorbe edebilir. Bu organik bileşikler, bu bileşiğin besleme girişinde durduruldu da malzemenin akabilir gibi çözeltilerin hızlı bir değişim ile karışabilir. Porozite nedeniyle, organik çözücüler kullanılarak PDMS 12 şişmesine neden olabilir.
Biz ürün bitkilerinin kökleri ile RootChip optimize ve örneğin, kendi programını genişletmek için devam etmektedir. Biz tedavi ve gözlem için kök erişimi iyileştirerek, RootChip gibi mikroakışkan araçları root araştırma yeni ufuklar açacaktır inanıyorum.
The authors have nothing to disclose.
Biz sensörleri oyma ifade bitki hat sağlanması için video hazırlama ve Bhavna Chaudhuri yardım için Philipp Denninger teşekkür ederim. Bu çalışma, Ulusal Bilim Vakfı (MCB 1.021.677), WBF, Ulusal Sağlık Enstitüleri Enerji Departmanı (DE-FG02-04ER15542) ve SRQGG ile Howard Hughes Tıp Enstitüsü'nden hibeleri tarafından desteklenen bir EMBO Uzun tarafından desteklenmiştir dostluk vadeli. MM Alexander von Humboldt Vakfı tarafından desteklenmiştir.
Items | Source | Information |
Chip carrier, software and other information. | Carnegie Institution – DPB | CAD and CNC files for carrier fabrication, controller software and further information are available for download from the website http://dpb.carnegiescience.edu/technology/rootchip Carriers can also be ordered from this website. |
RootChip | Stanford Foundry | Mask designs and fabrication protocols are available upon request. Ready-to-use RootChips can be ordered from http://www.stanford.edu/group/foundry/ |
Chip controller | -home built- | The automated valve controller system was originally developed by Rafael Gómez-Sjöberg , Lawrence Berkeley National Lab. A detailed instruction how to build your own actuated valve controller can be found at https://sites.google.com/a/lbl.gov/microfluidics-lab/valve-controllers |