Summary
I progressi nella spettrometria di massa hanno permesso l'analisi ad alta velocità di espressione della proteina e la modifica in una miriade di tessuti. In combinazione con frazionamento subcellulare e modelli di malattia, di massa quantitativa spettrometria e bioinformatica può rivelare nuove proprietà nei sistemi biologici. Il metodo qui descritto analizza cromatina proteine associate alla regolazione di malattie cardiache ed è facilmente applicabile ad altre
Abstract
Nel nucleo risiedono le proteomi le cui funzioni sono più intimamente collegati con regolazione genica. Adulto nuclei cardiomiociti mammiferi sono unici a causa della elevata percentuale di cellule binucleated, 1 lo stato prevalentemente eterocromatico del DNA, e la non divisione natura del cardiomiociti che rende nuclei adulto in uno stato permanente di interfase. 2 Regolazione trascrizionale durante lo sviluppo e la malattia sono stati ben studiati in questo organo, 3-5 ma ciò che rimane relativamente inesplorato è il ruolo svolto dalle proteine nucleari responsabili per il confezionamento del DNA e di espressione, e di come queste proteine controllare i cambiamenti nei programmi trascrizionali che si verificano durante la malattia. 6 Nella sviluppato mondo, la malattia di cuore è la causa numero uno di mortalità sia per gli uomini e le donne. 7 Insight su come proteine nucleari cooperano per regolare la progressione di questa malattia è fondamentale per far progredire l'attuale trattamento opzioni.
La spettrometria di massa è lo strumento ideale per affrontare queste domande in quanto permette una annotazione imparziale della quantificazione nucleare proteoma e relativo per come l'abbondanza di queste proteine cambiamenti con la malattia. Mentre ci sono stati diversi studi di proteomica per mammiferi complessi proteici nucleari, 8-13 fino a poco tempo 14 vi è stato un solo studio che esamina la proteoma cardiaco nucleare, ed è considerato il nucleo intero, piuttosto che esplorare il proteoma a livello di compartimenti sub nucleari . 15 In gran parte, questa carenza di lavoro è dovuta alla difficoltà di isolare nuclei cardiaca. Nuclei cardiaca avvenire entro un rigido e denso actina-miosina dell'apparecchio a cui sono collegati tramite estensioni multiple dal reticolo endoplasmatico, nella misura in cui altera contrazione miociti loro forma complessiva. 16 Inoltre, cardiomiociti sono il 40% in volume mitocondri 17 che necessitates arricchimento del nucleo parte le altri organelli. Qui si descrive un protocollo per cardiaca arricchimento nucleare e ulteriore frazionamento in compartimenti biologicamente rilevanti. Inoltre, i metodi di dettaglio per l'etichetta senza dissezione massa quantitativa spettrometria di queste frazioni-tecniche suscettibili di sperimentazione in vivo in vari modelli animali e sistemi di organi in cui marcatura metabolica non è fattibile.
Protocol
Il flusso di lavoro sperimentale contiene sette fasi principali (Figura 1). Per ogni lavoro che coinvolge i campioni che verranno eseguiti sul spettrometro di massa, lo sperimentatore deve indossare un camice da laboratorio, guanti e retina per capelli e fare attenzione per evitare la contaminazione da polvere e spargimento personale di cheratina.
1. Cuore Omogeneizzazione e isolamento nucleare
Cuore di topo sono omogeneizzare e una intatta nuclei pellet è isolato (Figura 2).
- Sacrificio topo adulto, accisa il cuore, sciacquare in ghiaccio PBS freddo, e omogeneizzare sul ghiaccio in Dounce vetro (noi preferiamo il Grinder Tissue Wheaton da Fisher, # 08-414-13A, ma altri metodi possono funzionare altrettanto bene) contenente 2 ml di tampone di lisi (una soluzione ipotonica che lisa differenziale la membrana cellulare negli organelli tra il nucleo) (10 mM Tris pH 7,5, 15 mM NaCl, e 0,15% v / v Nonidet P-40 [NP-40] in acqua deionizzata più proteasi e fosfatasi imiscela nhibitor: 10 butirrato di sodio mM, 0.1 mM fluoruro fenilmetilsulfonil [PMSF], 0,2 mM Na 3 VO 4, 0.1 mM NaF e 1 Roche proteasi pellet/10 ml - tampone di lisi può essere conservato per un massimo di una settimana a -20 ° C ). (Nota: Non troviamo necessario perfusione i cuori con PBS, come dati di massa e spettrometria nostri GO analisi identificare le proteine come prevalentemente cardiomiociti [p-value 3.8E-22] in origine piuttosto che la contaminazione del sangue [p valore di 5,0 E-2].)
- Versare lisato mediante filtro da 100 micron e raccogliere il flusso attraverso in 1,5 ml di tubo di centrifuga. A questo punto, se non specificato, campione deve essere tenuta in ghiaccio.
- Centrifugare a 4000 rpm per 5 min a 4 ° C.
- Rimuovere il surnatante. (Questo è il citosol, e deve essere conservato a -80 ° C. Contiene mitocondri lisato.) Risospendere il precipitato in 200 microlitri di tampone di lisi triturando. (Questa è l'nucleare grezzo pellet.)
- Riempire 1,5 ml provetta da centrifuga con 1 ml di appassionato di saccarosioer (peso saccarosio 24% / volume, 10 mM Tris pH 7,5, e 15 mM di NaCl in acqua deionizzata con proteasi / inibitore miscela fosfatasi - tampone saccarosio deve essere reso fresco il giorno di utilizzo). Delicatamente strato sedimento risospeso su sopra il pannello di saccarosio e centrifugare a 5000 rpm per 10 minuti a 4 ° C.
- Rimuovere la pellicola sopra così come il pad saccarosio (che contengono membrana). Risciacquare il restante pellet con 200 pl ghiacciata PBS / EDTA (1x PBS con 1 mM EDTA). (Questa è l'nuclei pellet e può essere solubilizzato o fissati per uso in western blotting o microscopia elettronica [Vedere fasi 4.1 e 4.2] per quantificare arricchimento.)
2. Nucleoplasma e detergente-estratto Frazionamento cromatina
Il grezzo nuclei pellet viene separato in una nucleoplasma e detergente-estratta frazione cromatina, contenente proteine liberamente associate al DNA.
- Triturare pellet dal punto 1,6 in 200 microlitri di buffer di estrazione detergente (20 mM HEPES pH 7,6, 7,5 mM MgCl 2. 0,2 mM EDTA, 30 mM NaCl, 1 M Urea, 1% NP-40 in acqua deionizzata con proteasi / inibitore miscela fosfatasi - estrazione tampone detergente può essere conservato fino ad una settimana a -20 ° C).
- Vortex campione di circa 2 volte, ogni 10 sec. Posto su ghiaccio 10 min.
- Centrifugare a 13.000 rpm per 5 min a 4 ° C.
- Rimuovere il surnatante. (Questa è nucleoplasma e deve essere conservato a -80 ° C). Sciacquare pellet con ghiacciata PBS / EDTA. (Questo è il pellet cromatina.)
- Triturare pellet in 300 ml di Tris, SDS, EDTA (50 mM Tris pH 7,4, 10 mM EDTA, 1% SDS in acqua deionizzata con proteasi / inibitore miscela fosfatasi - Tris, SDS, EDTA può essere conservato fino ad una settimana al -20 ° C).
- Sonicare 3-6 volte per 10 secondi ciascuna per rompere il DNA. Tenere campione su ghiaccio tra sonications.
- Centrifugare a 13.000 rpm per 5 min a 4 ° C. Conservare il surnatante. (Supernatante è il detergente-estratto cromatina proteine frazionamenton e deve essere conservato a -80 ° C). Il restante pellet dovrebbe essere piccolo e può essere scartato.
- Se si utilizza invece miociti isolati del cuore: Isolare miociti ventricolari neonatali di ratto da ratti di un giorno dalla nascita tramite digestione enzimatica, seguita da coltura in Dulbecco modified Eagle medium (DMEM) con 10% di siero fetale bovino (FBS), 1% di insulina transferrina sodio selenite (ITS), e 1% di penicillina. Dopo 24 ore, il trasferimento di mezzi privi di siero (come sopra, ma privo di FBS). Cellule della raccolta, in tampone di lisi (elencati al punto 1.1), e iniziano frazionamento nucleare nella fase 1.3.
3. Acid-estrazione Frazionamento - DNA-proteina legato Enrichment
Si arricchisce di un frazionamento separati per le proteine strettamente legate al DNA, tra cui gli istoni.
- Ripetere i passaggi 1,1-2,4.
- Triturare il pellet cromatina in 400 ml di acido solforico 0,4 N. Vortex per rimuovere i grumi.
- Incubare a 4 ° C per 30 minuti o overnight durante la rotazione.
- Centrifugare a 16.000 xg per 10 min a 4 ° C per rimuovere i detriti nucleare.
- Trasferire il surnatante in una nuova provetta.
- Aggiungere 132 ml di acido tricloroacetico goccia a goccia al supernatante. Capovolgere più volte. Incubare su ghiaccio per 30 min.
- Centrifugare a 16.000 xg per 10 min a 4 ° C.
- Gettare il surnatante. Lavare delicatamente pellet con gelida acetone. (Questa è l'istone pellet.)
- Centrifugare a 16.000 xg per 10 min a 4 ° C.
- Ripetere il lavaggio, i passaggi 3,8-3,9.
- Aria secca pellet.
- Risospendere il pellet in 100 ml di Tris, SDS, EDTA. Impostato a pH 8 mediante aggiunta di 1 M Tris. (Utilizzare una M 1 stock Tris che non è il pH modificato.)
- Sonicare a bagnomaria per 15 minuti. Evitare il surriscaldamento con l'aggiunta di ghiaccio a bagnomaria. (Questa è l'estratte con acido frazione e deve essere conservato a -80 ° C.)
4. Purezza Verifica
Western blot e la microscopia elettronicaconfermare arricchimento successo dei nuclei e l'esaurimento di altri organelli. Per visualizzare i risultati tipici per tutti i seguenti saggi di controllo di qualità, si prega di consultare la nostra pubblicazione precedente 18.
- Eseguire l'analisi Western blot. Sonda membrana contenente ogni frazione per istone H2A o nucleoporin P62 (come marcatori nucleari per verificare arricchimento), e per il trasportatore adenina nucleotide, BiP e tubulina (come marcatore mitocondriale, pennarello reticolo endoplasmatico, e marcatore citoscheletrico rispettivamente per verificare la purezza). Per verificare subfractionation successo della sonda nuclei, per l'istone H3 o fibrillarina (detergente e estratte con acido nuclei cromatina e intatto) e SNRP70 o E2F (nucleoplasma). Sonda per retinoblastoma o inducibile dall'ipossia fattore-1 (arricchito con detergente-estratto cromatina su estratte con acido, frazione). Campioni di controllo supplementari lisato cellulare HeLa e lisato tutto il cuore può essere eseguito anche nel gel stesso: Preparare controllo delle cellule HeLa lisato con l'aggiunta di Tris, SDS, EDTA buffer per piastra di coltura e l'utilizzo di un raschietto cellula per la raccolta del campione. Sottoporre ad ultrasuoni e centrifugare campione come nei passaggi 2,6-2,7. Preparare intero controllo lisato cuore omogeneizzando il cuore in 2 ml di tampone (20 mM Tris pH 7,4, 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1 mM EGTA, 1% Triton X-100, pirofosfato di sodio 2,5 mM, 1 mM glicerofosfato in acqua deionizzata con proteasi e fosfatasi inibitore miscela). Sottoporre ad ultrasuoni e centrifugare come nei passaggi 2,6-2,7. Vedere il passaggio 5 per la preparazione di campioni di proteine per SDS-PAGE.
- Microscopia elettronica: Risospendere il pellet di nuclei da 1,6 passo in tampone di lisi contenente 2% di glutaraldeide e fissare campione a 4 ° C. Sciacquare i campioni in acido osmico, disidratano, e incorporare in resina epossidica. Tagliare 70 fette nm utilizzando un Reichert Ultracut ultramicrotomo. Colorare i campioni in acetato di uranile e poi piombo e immagine utilizzando un JEOL 100CX microscopio elettronico a trasmissione. Quantificare arricchimento misurando l'area di nuclei intatti rispetto superficie totale del materiale con immagini. Troviamo 60-80% dei nuclei diessere intatto 14.
Considerazioni importanti per arricchire contro depurazione nuclei. Questo protocollo è stato sviluppato per consentire analisi proteomica della cromatina cardiaca allo scopo di studiare i processi globali di regolazione genica durante la malattia. Una componente importante della progettazione di tutto il proteoma esperimenti di spettrometria di massa è la questione della gamma dinamica e di essere in grado di identificare e caratterizzare le proteine a bassa abbondanza. Oltre all'obiettivo primario di fornire informazioni sulla biologia nucleare e cromatina-specifici, per arricchire il proteoma nucleare, aumenta la probabilità di rilevare queste proteine a bassa abbondanza, così come subfractionation ulteriore dei nuclei. Tuttavia, come discusso, il cardiomiociti adulti ha una componente citoscheletrico densa collegato alla membrana nucleare. Noi non crediamo che abbiamo completamente purificati i nuclei di queste altre componenti cellulari. Tuttavia, arricchendo solo per i nuclei, abbiamo ottenereed una soglia accettabile per consentire i tipi di analisi descritto.
Specificamente, abbiamo EM usato per valutare la purezza della nostra nuclei pellet greggio e trovato 60-80% della frazione da nuclei intatti, circa il 10% mitocondri, e il resto detriti. Inoltre, sappiamo da un nostro precedente studio sulla popolazione nuclei intatti, che, mentre molti non miofilamenti sono arricchiti da questo protocollo (compresi tubulina e actina come misurato da occidentale) alcune proteine (calsarcin-1) sono arricchiti, suggerendo una popolazione vera biologica queste proteine nei nuclei cardiaca 19.
Inoltre, abbiamo confrontato le proteine abbiamo trovato ad essere presente nel estratte con acido frazione cromatina, ai ruoli previsti di queste proteine dall'ontologia gene. È importante sottolineare che questa analisi ontologia gene non tiene in considerazione l'abbondanza relativa delle diverse proteine (così come i nostri dati Western Blot), ma conta piuttosto tutte le proteine identificate (arricchirendr o meno) uguali al momento di individuare percorsi comuni e compartimenti cellulari. L'analisi di queste vie e dei compartimenti cellulari si trovano nelle nostre pubblicazioni precedenti. 18,20 più importante, il successo della arricchimento nel estratte con acido, frazione cromatina ci ha permesso di identificare la presenza di 54 varianti istoniche in miociti topo adulto, 18 molte delle quali basata su un peptide unico per l'identificazione e, quindi, probabilmente non sono stati rilevabili senza questo protocollo di arricchimento data l'enorme complessità del proteoma cardiomiociti totale. Delle proteine 1048 abbiamo identificato dai nuclei cardiaca, 56 di essi (5,3%) sono stati annotati da GO analisi a far parte del nucleosoma (un componente del nucleo di interesse). Un altro studio guardando il cuore, identificato 6.180 proteine, di cui solo 11 proteine (0,18%) sono stati annotati far parte del nucleosoma 21. Ciò conferma ulteriormente la forza del nostro protocollo meaningfully arricchire per le proteine nucleari.
5. Proteine Gel e enzimatica delle proteine Digest
Le proteine sono separate da uno dimensionale SDS-PAGE e tripsina digerito da eseguire sul spettrometro di massa.
- Scongelare i campioni sul ghiaccio e determinare la concentrazione di proteine per ogni campione mediante l'acido bicinconinico (BCA) dosaggio delle proteine.
- Diluire i campioni ad una concentrazione nota con 5x tampone di Laemmli, bollire per 10 min e conservare a -20 ° C per unidimensionale SDS-PAGE. Diluire i campioni ad una concentrazione nota di estrazione utilizzando tampone urea e conservare a -20 ° C per gel bidimensionali.
- Eseguire gel di scelta carico pari quantità di proteina in ciascuna corsia. Proteine possono essere trasferiti ad una membrana di nitrocellulosa da utilizzare per Western blotting (come con controlli passo 4.1) o bande può essere tagliato per analisi di spettrometria di massa; vedere passi seguenti.
- Rimuovere il gel da apparecchi con acqua deionizzata per trasferirla in un contenitore pulito.Copertura gel in Oriole macchia, e contenitore avvolgere in un foglio di alluminio per bloccare la luce. Permettono gel ad incubare a temperatura ambiente su un agitatore per almeno 90 min.
- Immagine Oriole macchiato di gel (Figura 3) usando la luce ultravioletta, e marchio, se le bande saranno tagliati sull'immagine. Abbiamo tagliato ogni corsia in circa 25 2 mm di bande per gli studi di misurazione del proteoma totale.
- Inserire gel su una superficie pulita. Utilizzare solo materiali che sono stati tenuti chiusi o vengono spruzzati con etanolo per prevenire la contaminazione cheratina. Tagliare ogni banda, e quindi ulteriormente tagliare in 3 parti uguali. Mettere tutti e tre i pezzi di ogni band insieme il meglio di sé etichettato 1,5 ml tubetto. Pezzi di gel possono essere conservati a -20 ° C per diversi mesi.
- Preparare spine gel per la digestione enzimatica. Digest pezzi gel usando tripsina a 37 ° C per una notte. Per il protocollo dettagliato esempio gel di vedere la nostra pubblicazione precedente. 22 È possibile digerire fasce a basso peso molecolare con chimotripsina in luogo di tripsina,per eliminare scollatura ampia tripsina di code degli istoni.
6. Spettrometria di massa e analisi dei dati
Campioni sono separati su un LC e analizzati mediante MS / MS. Gli spettri sono confrontati con un database di proteine per l'identificazione di proteine.
- Eseguire 10 microlitri di ciascun campione mediante LC / MS / MS. Usiamo un nano-flusso Eskigent LC con una colonna di 75 micron di fase inversa. Utilizzare un run LC ottimizzato per una gamma di proteine e peptidi. Impiegare un gradiente lineare da fase mobile A (0,1% di acido formico, acetonitrile 2% [ACN] in acqua) a fase mobile B (0,1% di acido formico, 20% di acqua in ACN): 60 min dal 5% B fase mobile a 50 B%, poi 15 min da 50% B a 95% B e infine 10 min a 95% costante B. Utilizzare una portata di 200 Nl / min. Acquisire dati di spettrometria di massa in un modo dipendente dai dati. Usiamo un Orbitrap Thermo che frammenta i primi 6 ioni madri più abbondanti.
- Ripetizione viene eseguito per almeno tre tecniche biologiche e due repliche. (Recommended)
- Utilizzare il software (le opzioni disponibili in commercio comprendono Bioworks e Xcalibur;! Pubblicamente opzioni disponibili includono PROWL, X Tandem, SpectraST) per cercare spettri sul database UniProt di scelta tramite un algoritmo di ricerca (ad esempio SEQUEST o MASCOT).
- Provare a modificare i parametri di ricerca per consentire carbamidomethylation cisteina e metionina ossidazione, due modifiche comuni creati durante l'elaborazione del campione.
- Calcolare un tasso di falsi positivi con la ricerca inversa database.
- Filtro identificazioni proteiche per accettare solo le partite di una confidenza soglia. Si consigliano i seguenti parametri di iniziare con: Xcorr> 3 (+2),> 4 (+3),> 5 (+4), la tolleranza deltaCN> 0,1, il punteggio consenso ≥ 20, la tolleranza di massa per gli ioni 2 Da genitore, di massa di 0,5 Da per ioni prodotto, almeno due peptidi unici al proteine e non più di 3 mancati spaccature.
7. Etichetta senza quantificazione
Determine l'abbondanza relativa di proteine usando label-free quantificazione (Figura 4).
- Un certo numero di programmi software sono pubblicamente disponibili in commercio o per l'etichetta senza quantificazione dei dati di spettrometria di massa tra cui Censimento (gruppo del Prof. Yates '), 23 Elucidator (Microsoft), 24 SETACCIO (Thermo Scientific), 25 Scaffold (Software Proteome) 26. Questi programmi mirano a correlare il segnale di spettrometria di massa di peptidi intatti o il numero di peptide eventi di sequenziamento di un quantitativo di proteine relativi tra due o più stati.
- Mentre ciascun programma incorpora una pipeline simile analisi, alcuni programmi sono limitati ai tipi di analisi specifiche che possono essere eseguite sui dati. Inizialmente, i dati da diverse esecuzioni è allineato, intensità del segnale viene normalizzato e picchi peptidici vengono selezionati per l'analisi.
- I due metodi più comuni sono una quantificazione basata sul conteggio spettrale o LC-MS area del picco. Abbondanzaindici sono calcolati per determinare le variazioni in abbondanza peptide tra gruppi diversi.
- Questi programmi possono essere interfacciato con algoritmi di ricerca di proteomica (Mascot, Sequest, X! Tandem) di correlare le informazioni quantificazione per l'identificazione delle proteine.
- Per garantire precisione e riproducibilità dei dati è fondamentale incorporare entrambe biologici (diversi campioni sperimentali) e tecniche (esecuzione stesso campione dello spettrometro di massa più volte) replicati di dati spettrometro di massa.
- Variazione del peptide in abbondanza e tra condizioni sperimentali può essere valutata mediante ANOVA e tracciati tramite PCA (Figura 5).
Considerazioni importanti per l'etichetta senza quantificazione. Quando si esegue l'etichetta priva di quantificazione, particolare attenzione deve essere data per assicurare la preparazione uniforme del campione, il tempo di digestione e le condizioni di LC-MS/MS come ogni campione devono essere elaborati e analizzati separatamente. A differenza di metapprocci in materia di etichettatura, abolic confronti nel label-free esperimenti sono fatti sui dati di spettrometria di massa distinta corre (a causa della mancanza di etichettatura di evitare la possibilità di correre insieme), cosicché egli debba alta riproducibilità in tutti gli aspetti di analisi dei campioni (cioè di preparazione del campione, LC e ms) e l'uso di spettrometri di massa ad alta precisione di massa.
Per tenere conto di lievi modifiche nella preparazione del campione e analisi uno standard noto può essere aggiunto ad ogni campione per facilitare la normalizzazione dei dati. Inoltre, la maggior parte dei programmi software consentono normalizzazione delle intensità di segnale (ad esempio regolando al rumore di fondo o di un analita noto abbondante) dopo l'acquisizione dei dati di conto delle differenze di iniezione, ionizzazione e frammentazione. Algoritmi di allineamento esistono nella maggior parte dei sopra citati programmi software che aiutano a correggere differenze nei profili di eluizione del peptide. L'uso di repliche biologiche e tecnico è Essenziale in questo tipo di studio, in quanto consente analisi statistiche per confermare la riproducibilità e coerenza delle variazioni osservate in abbondanza proteine.
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Representative Results
Figura 4 mette in evidenza l'utilità di questa forma di quantificazione relativa. Mostrata nel pannello di sinistra sono i singoli picchi peptide monoisotopico (sovrapposto da diversi tipi di mouse), che sono state designate come appartenenti alla proteina HMGB1 (identificato tramite ricerca nel database). Ogni picco, essenzialmente un cromatografo ionico estratta per il dato peptide, proviene da un mouse diverso. I gruppi rappresentano tre diversi stati fisiologici: basale, l'ipertrofia cardiaca e scompenso cardiaco, con tre repliche biologiche per ogni gruppo. Integrando l'area sotto la curva, una relativa abbondanza può essere calcolato. Nel pannello centrale la media di queste abbondanze è mostrato. E 'chiaro da questo tipo di analisi che l'abbondanza della proteina HMGB1 cambia durante il corso della malattia. In contrasto, i pannelli inferiori mostrano l'esempio di istone H4 che non cambia con la malattia. In entrambi i casi, i peptidi provenienti da animali della stessa phenotstato ypic mostrano profili di eluizione simili e abbondanza relativa, dimostrando la riproducibilità della preparazione del campione e LC / MS / MS.
La riproducibilità di questa tecnica è ulteriormente confermata mediante analisi delle componenti principali (PCA). Come mostrato in Figura 5, l'applicazione di ANOVA sui risultati complessivi proteoma di ciascun animale rivela un raggruppamento distinto dal fenotipo cardiaco (biologico replicati) con la più stretta associazione tra tecnica replicati (spettrometro di massa diversa corre dello stesso campione) dallo stesso animale . Questo fornisce la sicurezza che i cambiamenti osservati per abbondanza singole proteine di interesse sono infatti attribuibile alla differenza nello stato fisiologico.
Pari importanza la quantificazione e la riproducibilità dei risultati è la maggiore copertura del proteoma nucleare attivato da subfractionation nucleare. Figura 6 illustra che l'analisi dei l'intero nucleo sola non riesce a scoprire anche la maggioranza delle proteine nucleari identificate quando combinando analisi singoli scomparti separati (1.048 uniche proteine identificate in totale tra le frazioni contro 428 identificato dal nuclei intatti). Inoltre, la sovrapposizione moderati tra le diverse frazioni dimostra la rilevanza biologica di considerare questi compartimenti singolarmente per comprendere aggiunto in funzione nucleare e regolazione genica. Infine, la possibilità di frazionare specificamente estratte con acido o detergente-estratto arricchisce cromatina chiave per proteine della cromatina strutturali, come istoni, permettendo così l'analisi di spettrometria di massa più concentrati (come quelli che colpiscono modificazioni post-traduzionali) su un gruppo di proteine senza richiede anticorpi specifici per ogni variante e isoforma.
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Figura 1. Diagramma di flusso per la caratterizzazione delle proteine cardiache compartimenti nucleari sub. Cuore di topo interi sono omogeneizzati e il lisato arricchito per nuclei. I nuclei sono frazionati in nucleoplasma, detergenti estratti cromatina, e acido-estratti frazioni cromatina. Proteine da ciascuna sono isolati e separati da unidimensionale SDS-PAGE, e le bande tripsina digeriti e gestito da LC / MS / MS. Dopo base dati, privo di etichetta quantificazione viene utilizzato per identificare tendenze abbondanza per proteine nelle diverse frazioni.
Figura 2. Schema di frazionamento nucleare. Nuclei sono arricchiti da omogenato tutto il cuore attraverso un gradiente di saccarosio. Ogni campione nuclei può essere separato in nucleoplasma e detergente estratti o frazioni in un acid-estratto frazione che arricchisce di istoni.
Figura 3. Unidimensionale gel delle diverse frazioni. 20 mg di lisato tutto il cuore (WHL), nuclei intatti (Nuc), nucleoplasma (NUP), detergente-estratto cromatina (DE), e estratte con acido cromatina (AE) frazione di cuore di topo sono stati eseguiti su un unidimensionale gel SDS-PAGE (12% di acrilammide) insieme estratte con acido frazione cromatina da cellule HeLa e colorati con Oriole. Il patterning diversa abbondanza di proteine totali nei vari pesi molecolari dimostrare l'esistenza di proteomi unici per i vari comparti secondari, tra cui l'arricchimento per i basso peso molecolare istoni nel detergente-estratto cromatina che sono ulteriormente arricchiti nei estratte con acido, frazioni . Degna di nota è la natura sostanzialmente meno complessa della frazione di cellule HeLa AEs rispetto a quella dal cuore.
Figura 4. Quantificazione abbondanza relativa topi di tre diversi Stati cardiaca:. Basale (blu) ipertrofia (rosso) e guasto (verde) sono stati raccolti in triplice copia e loro campioni di proteine corse in due repliche tecnica mediante LC / MS / MS. Illustrato a sinistra sono i picchi monoisotopico per un peptide specifico (il cui spettro è mostrato sulla destra). Abbondanza relativa è stato calcolato mediante l'integrazione e la media tra le repliche di ogni stato fenotipico (pannello centrale) per confrontare l'abbondanza relativa del peptide (e la proteina da cui proviene), nei diversi stati di insufficienza cardiaca. Il pannello superiore mostra un peptide da HMGB1, la cui abbondanza è alterata nella malattia, mentre il pannello di fondo (H4) non cambia. Clicca qui per ingrandire la figura .
Figura 5. L'analisi delle componenti principali rivela riproducibilità. Analisi ANOVA per ogni mouse (3 repliche biologiche / cardiaco stato x 2 tecnico replica) tracciati per l'intensità peptide (assi) mostra il clustering di stato di malattia (basale in blu, ipertrofia in rosso, il fallimento in verde), che indica la riproducibilità dei dati di successo spec massa e significative differenze fisiologiche tra i diversi stati di malattia.
Figura 6. Caratterizzazione globale di distinti compartimenti nucleari sub. Sono stati identificati 1.048 proteine totali unici in tutti i 4 frazioni. 146 proteine erano condivisi da tutti i 4 frazioni, rispetto a 749 proteine identificate nel nucleoplasma, 380 nel detergente estratti frazione cromatina, 426 nel estratte con acido frazione cromatina, e 428 nei nuclei intatti. Il diagramma illustra la sovrapposizione Venn moderati proteine identificate tra le frazioni, evidenziando l'esistenza di regioni distinte in vivo e la capacità di questo frazionamento isolarle. Inoltre, la caratterizzazione marcatamente incompleta del proteoma nucleare totale ottenibile analizzando solo i nuclei non frazionata (arancione) giustifica ulteriore frazionamento.
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Discussion
Due metodi principali per isolamento nucleare sono stati esaminati in precedenza: 27 uno è la tecnica di omogeneizzazione Behrens tessuto liofilizzato in un solvente non acquoso e la seconda, una modifica che usiamo qui, omogeneizzazione di tessuto in una soluzione acquosa di saccarosio / soluzione salina seguita dal differenziale o centrifugazione in gradiente di densità.
Subfractionation dei nuclei mediante estrazione acido su campioni di tessuto è uno strumento importante per lo studio della cromatina che è stato utilizzato dal 1960, 28 con l'obiettivo iniziale è quello di analizzare gli istoni. Acid-estrazione protocolli sono stati sviluppati per questo scopo di purificare i componenti principali di nucleosomi istoni 29 Un limite di questi studi precedenti è l'assenza di informazioni sui non-istoni che costituiscono le proteine, e la modifica, cromatina,. Abbiamo affrontato questa sfida con l'attuale protocollo per caratterizzare distinti subfractions biologiche del nucleo e cromatina.Questo approccio, che utilizza l'estrazione detergente o estrazione acida di cromatina in parallelo, rivela la diversità di cromatina molecole regolatrici e distingue tra i livelli di regolazione endogena, in modo da servire come un valido approccio per la generazione di ipotesi.
Applicazione del stabilito acido-estrazione metodologia al miociti adulti pone alcuni ostacoli tra cui il citoscheletro denso e grande popolazione mitocondriale. Mentre le versioni di acido di estrazione sono stati utilizzati sul tessuto cardiaco con 30 gli esperimenti sono stati condotti in modo mirato per studiare le proteine note, l'attuale protocollo è stato progettato ed è stato eseguito per abilitare imparziale analisi del proteoma. Inoltre, abbiamo trovato utile per esaminare il detergente-estratto e estratte con acido, cromatina separatamente (solo 37% di sovrapposizione è stata osservata tra i proteomi di queste due frazioni) per comprendere meglio le dinamiche attraverso le quali queste popolazioni della cromatina proteine interact con DNA. Altri protocolli utilizzano tamponi a base di urea sono stati descritti anche, 31,32 che, eseguita prima estrazione acida, arricchire proteine meno strettamente legati al genoma. Oltre alle frazioni cromatina, altri hanno subfractionated nucleo di isolare il nucleolo, 33 ma subfractionation per analisi di spettrometria di massa di nuclei miocardica isolata da cuori interi non è stata riportata.
Studi shotgun proteomica su nuclei intatti, cioè non frazionata organelli-sono stati effettuati su tessuto miocardico utilizzando un approccio MudPIT. 15 Questo studio ha identificato 1.044 proteine nucleari cardiache, sulla stessa scala nostro protocollo, tuttavia essi invocato utilizzando una media di 8,5 repliche, in ogni ciclo della durata di 20 ore per rilevare bassa abbondanza proteine. Al contrario, abbiamo impiegato subfractionation, sia per aumentare il numero di proteine identificabili (senza bisogno di lunghe cromatografia-le nostre piste sono LC 85 min), mentre Importantly offrendo anche ulteriori informazioni biologiche sulla sub-nucleare localizzazione e abbondanza relativa delle proteine.
Da un cuore topo intero (circa 0,14 g) si recupera circa 1,2 mg (0,85% del totale) di proteine nei nuclei intatti. Dal nuclei intatta otteniamo il recupero seguente per ciascuna delle sub-frazioni (Nota: il valore complessivo superiore al 100% come acido-estrazione e detergente-estrazione sono fatto su cuori separati, non in serie): nucleoplasma (15%), detergenti estratto cromatina (85%), e estratte con acido cromatina (54%). In confronto, Thermo Scientific dispone di un kit (NE-PER Reagenti nucleare e citoplasmatica) che la loro scheda tecnica dice che i rendimenti proteina citosolica 1.6mg e 0,6 mg di proteina nucleare (1,5%) da 40 mg di cuore di topo con un 10% la contaminazione incrociata tra le due frazioni. Sigma ha un kit (NXTRACT, Kit CellLytic estrazione nucleare) che hanno testato su muscolo di coniglio, ma non il cuore, e recuperati da 100 mg di tessuto 0,46 mg di proteina nucleare (0,46%) in quella che viene definita la loro "nucleare grezzo pellet", con una "percentuale" di contaminazione citoplasmatica. Altre aziende, come ad esempio Epigentek offrono anche kit, però non siamo riusciti a trovare i dettagli specifici sulla arricchimento e la purezza sui loro siti web per il confronto.
Abbiamo descritto una nuova tecnica per risponde alla necessità attuale di arricchimento successo di nuclei cardiaca per studi di proteomica. Approfondiremo metodologia per frazionamento compartimento sub, che migliorano la capacità di rilevare le proteine meno abbondanti nonché consente una maggiore risoluzione, quantificazione e la determinazione della localizzazione della proteina. A tal fine, il protocollo per l'analisi di spettrometria di massa offre linee guida raccomandate, comunque caso per caso le considerazioni molto probabilmente necessarie. Per esempio, abbiamo scoperto che il gran numero di isoforme cardiache varianti istoniche con ispezione manuale similarità sequenza richiesta degli spettri da assegnare mapicchi giori e confermare di massa di ioni madre prima di essere in grado di assegnare con sicurezza gli spettri. 14 parametri di ricerca possono anche essere personalizzato per modificazioni post-traduzionali (PTM) identificazione e ottime recensioni esistono metodi di dettaglio e le preoccupazioni con l'interpretazione dei dati per l'analisi PTM (compreso l'arricchimento PTM , 34 software per PTM, 35 analisi di PTMs combinatorie, 36 frammentazione strategie alternative 37 e digestione e trattamento alternativo 38,39).
L'arricchimento e frazionamento descritto è da tutto il cuore (che è il 50-70% dei cardiomiociti in massa). Mentre questi aspetti sacrifici di specificità delle cellule che possono essere particolarmente importante per determinate famiglie di proteine nucleari, consente una sospensione molto più rapido delle proteine in buffer propriamente detti, che non è possibile con i protocolli di cellula adulta miociti isolamento. In questo modo, questa metodologia meglio conserva l'integrità of del campione contro il degrado. Tuttavia, sono anche descritte le istruzioni per l'applicazione di questo protocollo per i miociti ventricolari neonatali di ratto isolati, dal momento che entrambi i modelli microrganismo isolato cellule e intero sono strumenti necessari per lo studio insufficienza cardiaca. In principio, questo metodo può essere applicato anche a miociti adulti estratti dalla digestione enzimatica da cuori isolati-con l'avvertenza che i cambiamenti nel legame proteina che si verificano durante l'isolamento (che può durare più di un'ora) confonderà interpretazione delle osservazioni proteomica.
Abbiamo sviluppato questa metodologia per comprendere i cambiamenti nel proteoma nucleare e trucco cromatina che contribuiscono alla malattia. 14 Tuttavia altre applicazioni includono lo studio di stimoli specifici cambiamenti nella composizione del proteoma in normale fisiologia. Inoltre, sub-frazionamento offre la possibilità di un nuovo livello di caratterizzazione di come le proteine funzionano e localizzare tutta distinte regioni funzionali del nucleo.
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Disclosures
Nessun conflitto di interessi dichiarati.
Acknowledgments
Il laboratorio Vondriska è supportato anche da finanziamenti del National Institute Heart, Lung e il Sangue del NIH e la Fondazione Laubisch alla UCLA. EM è destinatario del S. Jennifer Buchwald Graduate Fellowship in Fisiologia presso la UCLA, HC è il destinatario di un American Heart Association Pre-dottorato, MP è il destinatario di un Ruth NIH Kirschstein post-dottorato, e SF è il destinatario di un NIH K99 Award.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dulbeco Modified Eagle Medium | Invitrogen | 11965 | |
| Protease pellet | Roche | 04 693 159 001 | |
| 100 μm strainer | BD Falcon | 352360 | |
| Ultracut ultramicrotome | Reichert | ||
| 100CX Transmission Electron Microscope |
JEOL USA, Inc. | ||
| Oriole | BioRad | 161-0496 | |
| Histone H2A antibody | Santa Cruz | sc-8648 | |
| Nucleoporin p62 antibody | BD Biosciences | 610498 | |
| Adenine nucleotide transporter antibody | Santa Cruz | sc-9299 | |
| BiP antibody | Santa Cruz | sc-1050 | |
| Tubulin antibody | Sigma | T1568 | |
| Histone H3 antibody | Abcam | ab1791 | |
| Fibrillarin antibody | Cell Signaling | C12C3 | |
| SNRP70 antibody | Abcam | ab51266 | |
| E2F-1 antibody | Thermo Fisher | MS-879 | |
| Retinoblastoma antibody | BD Biosciences | 554136 | |
| Hypoxia inducible factor-1 antibody | Novus Biologicals | NB100-469 | |
| BCA protein assay | Thermo Scientific | 23227 | |
| Reverse phase column | New Objective | PFC7515-B14-10 | |
| BioWorks Browser | Thermo Scientific |
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