Summary
Framsteg inom masspektrometri har tillåtit hög genomströmning analys av proteinuttryck och modifiering i en mängd vävnader. Kombinerat med subcellulär fraktionering och modeller sjukdom, kvantitativ masspektrometri och bioinformatik kan avslöja nya egenskaper i biologiska system. Det häri beskrivna förfarandet analyserar kromatin-associerade proteiner i inställningen av hjärtsjukdomar och är lätt tillämpas på andra
Abstract
I kärnan bor på proteom vars funktioner är mest intimt förknippade med genreglering. Vuxen däggdjur cardiomyocyte kärnor är unika på grund av den höga andelen binucleated celler, 1 den övervägande heterochromatic tillstånd DNA, och icke delande natur cardiomyocyte som gör vuxna kärnor i ett permanent tillstånd av interfas. 2 Transkriptionsreglering under utveckling och sjukdom har studerats i detta organ, 3-5, men det som återstår relativt outforskat är den roll som spelas av nukleära proteiner som är ansvariga för DNA-förpackning och uttryck och hur dessa proteiner kontrollerar förändringar i transkriptionella program som inträffar under sjukdom. I utvecklade 6 världen är hjärtsjukdom den vanligaste dödsorsaken för både män och kvinnor. 7 insikt om hur kärnproteiner samverkar för att reglera utvecklingen av denna sjukdom är avgörande för att föra den aktuella behandlingen o= Val.
Masspektrometri är det perfekta verktyget för ta itu med dessa frågor, eftersom det möjliggör en opartisk anteckning av kärn proteomet och relativa kvantifiering för hur överflöd av dessa proteiner förändras med sjukdom. Även om det har gjorts flera proteomik studier för däggdjur nukleära proteinkomplex, 8-13 tills nyligen 14 har det varit bara en studie för att undersöka hjärtats nukleära proteom, och det ansåg hela kärnan, snarare än att utforska proteomet i nivå med nukleära sub fack . 15 Till stor del är denna brist på arbete på grund av svårigheten att isolera hjärt kärnor. Hjärt kärnor sker inom en styv och tät aktin-myosin apparat som de är anslutna via flera förlängningar från det endoplasmatiska retiklet, i den utsträckning som myocyt kontraktion förändrar deras totala form. 16 Dessutom, kardiomyocyter är 40% mitokondrier volym 17 vilken necessitaTES anrikning av kärnan bortsett från de andra organeller. Här beskriver vi ett protokoll för hjärt anrika uran och ytterligare fraktionering i biologiskt relevanta delar. Dessutom har vi detalj metoder för märkning utan kvantitativa masspektrometrisk dissektion av dessa fraktioner-tekniker som lämpar sig för in vivo-experiment i olika djurmodeller och organsystem där metabolisk märkning inte är möjlig.
Protocol
Den experimentella arbetsflödet innehåller sju stora steg (Figur 1). För varje arbete med prover som ska köras på masspektrometern bör försöksledaren bära labbrock, handskar och hårnät och vara noga med att undvika kontamination från damm och personlig utsöndring av keratin.
1. Hjärta Homogenisering och Nuclear Isolering
Mus hjärtan homogeniseras och en intakt kärnor pelleten isoleras (figur 2).
- Offra vuxen mus, punktskatt hjärtat, skölj i iskallt PBS och homogenisera på is i glas Dounce (vi föredrar Wheaton Tissue Grinder från Fisher, # 08-414-13A, men andra metoder kan fungera lika bra) innehållande 2 ml lysbuffert (en hypoton lösning som differentiellt lyserar cellmembranet över organellerna inklusive kärnan) (10 mM Tris pH 7,5, 15 mM NaCl och 0,15% vol / vol Nonidet P-40 [NP-40] i avjoniserat vatten plus proteas och fosfatas inhibitor blandning: 10 mM natriumbutyrat, 0,1 mM fenylmetylsulfonylfluorid [PMSF], 0,2 mM Na 3 VO 4, 0,1 mM NaF och 1 Roche proteas pellet/10 ml - lysbuffert kan lagras upp till en vecka vid -20 ° C ). (Obs! Vi tycker inte att det är nödvändigt att perfundera hjärtan med PBS, som våra uppgifter masspektrometri och GO analys identifiera proteiner som huvudsakligen cardiomyocyte [p-värde 3.8E-22] ursprung i motsats till blodsmitta [p-värde 5,0 E-2].)
- Häll lysat genom 100 fim sil och samla flöde genom i 1,5 ml centrifugrör. Vid denna punkt, om inte annat anges, bör provet hållas på is.
- Centrifugera vid 4.000 rpm under 5 minuter vid 4 ° C.
- Avlägsna supernatanten. (Detta är i cytosolen, och bör förvaras vid -80 ° C. Den innehåller den lyserade mitokondrier.) Återsuspendera pelleten i 200 | il lysbuffert genom triturering. (Detta är den råa nukleära pelleten.)
- Fyll 1,5 ml tub centrifug med 1 ml sackaros buffer (24% sackaros vikt / volym, 10 mM Tris, pH 7,5, och 15 mM NaCl i avjoniserat vatten med proteas / fosfatasinhibitor blandning - sackarosbuffert bör göras färskt på dagen för användning). Försiktigt skiktet återsuspenderade pelleten ovanpå sackaros dynan och centrifugera på 5.000 varv per minut under 10 minuter vid 4 ° C.
- Avlägsna den tunna filmen ovanpå samt sackaros dynan (som innehåller membran). Skölj den återstående pelleten med 200 pl iskall PBS / EDTA (1 x PBS med 1 mM EDTA). (Detta är kärnorna pelleten och kan solubiliseras eller fixeras för användning i western blotting eller elektronmikroskopi [Se steg 4,1 och 4,2] att kvantifiera anrikning.)
2. Nucleoplasm och diskmedel, extraherade Chromatin fraktionering
Den råa kärnor pelleten separeras i en nucleoplasm och detergent-extraherat kromatin fraktion, innehållande proteiner löst associerade med DNA.
- Finfördela pellets från steg 1,6 i 200 ul tvättmedel extraktionsbuffert (20 mM HEPES pH 7,6, 7,5 mM MgClj 2. 0,2 mM EDTA, 30 mM NaCl, 1 M urea, 1% NP-40 i avjoniserat vatten med proteas / fosfatasinhibitor blandning - detergentextraktion buffert kan förvaras i upp till en vecka vid -20 ° C).
- Vortex prov 2 gånger, 10 sek vardera. Placera på is 10 min.
- Centrifugera vid 13.000 rpm i 5 minuter vid 4 ° C.
- Avlägsna supernatanten. (Detta är nucleoplasm och bör förvaras vid -80 ° C). Skölj pellets med iskall PBS / EDTA. (Detta är kromatin pelleten.)
- Finfördela pelleten i 300 pl Tris, SDS, EDTA-buffert (50 mM Tris, pH 7,4, 10 mM EDTA, 1% SDS i dejoniserat vatten med proteas / fosfatasinhibitor blandning - Tris, SDS, EDTA-buffert kan förvaras upp till en vecka vid -20 ° C).
- Sonikera 3-6 gånger under 10 sekunder vardera för att bryta upp DNA. Håll provet på is mellan sonications.
- Centrifugera vid 13.000 rpm i 5 minuter vid 4 ° C. Håll supematanten. (Supernatanten detergent extraherade kromatin-proteinet fraction och bör hållas vid -80 ° C). Den återstående pelleten bör vara liten och kan kastas.
- Om användning av isolerade myocyter i stället för hela hjärtat: Isolera neonatala myocyter råtta ventrikulära från råttungar en dag efter födseln med enzymatisk digerering, följt av odling i Dulbeccos modifierade Eagle-medium (DMEM) med 10% fetalt bovint serum (FBS), 1% insulin -transferrin-natriumselenit (ITS), och 1% penicillin. Efter 24 timmar, överföring till serumfria medier (samma som ovan, men saknar FBS). Harvest celler i lyseringsbuffert (listade i 1,1) och börja kärnkraft fraktionering vid steg 1,3.
3. Syra-extraktion Fraktionering - DNA-bundna protein Enrichment
Ett separat fraktionering berikar för proteiner tätt bundna till DNA, inklusive histoner.
- Upprepa steg 1,1-2,4.
- Triturera kromatinet pelleten i 400 pl av 0,4 N svavelsyra. Vortex att avlägsna klumpar.
- Inkubera vid 4 ° C under 30 min eller overnight samtidigt roterar.
- Centrifugera vid 16.000 xg under 10 minuter vid 4 ° C för att avlägsna skräp nukleär.
- Överför supernatanten till ett nytt rör.
- Lägg 132 pl triklorättiksyra droppvis till supernatanten. Invertera flera gånger. Inkubera på is under 30 minuter.
- Centrifugera vid 16.000 xg under 10 minuter vid 4 ° C.
- Släng supernatanten. Försiktigt skölja pellets med iskall aceton. (Detta är den histon pelleten.)
- Centrifugera vid 16.000 xg under 10 minuter vid 4 ° C.
- Upprepa tvätta, steg 3,8-3,9.
- Lufttorka pellet.
- Återsuspendera pelleten i 100 pl Tris, SDS, EDTA-buffert. Ställ pH till 8 genom tillsats av 1 M Tris. (Använd en 1 M Tris bestånd som inte är pH-justerade.)
- Sonikera i vattenbad under 15 min. Förhindra överhettning genom att lägga is på vattenbad. (Detta är den syra-extraherade fraktionen och bör förvaras vid -80 ° C)
4. Renhet Check
Western blöts och elektronmikroskopibekräfta lyckad anrikning av kärnor och utarmning av andra organeller. Om du vill se typiska resultat för alla följande analyser kvalitetskontroll, se vår tidigare publikation. 18
- Utför Western blot-analys. Sond membran innehållande varje fraktion för histon H2A eller nucleoporin P62 (som nukleära markörer för att kontrollera anrikning), och för adeninnukleotid transportör, BiP och tubulin (som en mitokondriell markör, endoplasmatiskt reticulum markör, och cytoskelett markör respektive att verifiera renhet). För att verifiera framgångsrik subfraktionering av kärnor, sonden för histon H3 eller fibrillarin (rengöringsmedel och syraextraherade kromatin och intakt kärnor) och SNRP70 eller E2F (nucleoplasm). Prob för retinoblastom eller hypoxi inducerbara faktor-1 (berikad i detergent extraherade-kromatin över syraextraherade fraktion). Ytterligare stickprovskontroller av HeLa-cellysat och hela hjärtat lysat kan också köras i samma gel: Förbered HeLa kontroll cellysat genom att lägga Tris, SDS, EDTA-buffert till kultur skålen och använda en cell skrapa för att samla prov. Sonikera och centrifugera provet som i steg 2,6-2,7. Bered hela kontrollsystemet hjärta lysat genom homogenisering hjärtat i 2 ml buffert (20 mM Tris, pH 7,4, 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1 mM EGTA, 1% Triton X-100, 2,5 mM natriumpyrofosfat, 1 mM glycerofosfat i avjoniserat vatten med proteas och fosfatasinhibitor blandning). Sonikera och centrifugera som i stegen 2,6-2,7. Se steg 5 för framställning proteinprover för SDS-PAGE.
- Elektronmikroskopi: Resuspendera kärnor pellets från steg 1,6 i lyseringsbuffert innehållande 2% glutaraldehyd och fixa prov vid 4 ° C. Skölj prover i osmiumsyra, torkar och bädda in i epoxiharts. Skär 70 nm segment med en Reichert Ultracut ultramikrotom. Stain prover i uranylacetat och därefter bly och bild med en JEOL 100CX transmissionselektronmikroskop. Kvantifiera anrikning genom att mäta ytan av intakta kärnor kontra total yta av material avbildat. Vi finner 60-80% av kärnor tillvara intakta. 14
Viktiga överväganden för berikande kontra rena kärnor. Detta protokoll har utvecklats för att möjliggöra proteomik analyser av hjärt kromatin för att studera globala processer genreglering under sjukdom. En viktig del av utformningen av hela proteom experiment masspektrometri är frågan om dynamik och kunna identifiera och karakterisera låg förekomst proteiner. Utöver det primära målet att ge information om kärnkraft och kromatin-specifik biologi, berikande för den nukleära proteomet ökar sannolikheten att upptäcka dessa låg överflöd proteiner, liksom ytterligare subfraktionering av kärnorna. Men som diskuterats, har vuxna cardiomyocyte en tät cytoskelett komponent ansluten till det nukleära membranet. Vi tror inte att vi helt har renat kärnorna från dessa andra cellulära komponenter. Emellertid, genom att berika endast för kärnorna, har vi erhållaed en acceptabel tröskel för att de typer av analyser som beskrivs.
Specifikt har vi använt EM för att bedöma renheten av vår råolja kärnor pellets och hittade 60-80% av fraktionen vara intakt kärnor, ungefär 10% mitokondrier och resten skräp. Dessutom vet vi från vår tidigare studie på den intakta kärnor befolkningen, att medan många myofilaments inte berikas av detta protokoll (inklusive tubulin och aktin mätt med västerländska) vissa proteiner (calsarcin-1) är berikade, vilket tyder på en verklig biologisk population av dessa proteiner i hjärt kärnor. 19
Dessutom har vi jämfört de proteiner vi funnit att vara närvarande i den syraextraherade kromatin fraktion, de förutsagda roller dessa proteiner genom Genontology. Det är viktigt att inte ta denna Genontology analysen inte hänsyn till den relativa förekomsten av de olika proteinerna (liksom våra Western blot data) utan räknar alla identifierade proteiner (berikaed eller inte) som lika när fastställa gemensamma vägar och cellulära fack. Analys av dessa vägar och cellulära fack finns i våra tidigare publikationer. Viktigast 18,20, framgång anrikning i syraextraherade kromatin fraktion tillät oss att identifiera närvaron av 54 histon varianter i den vuxna möss myocyt, 18 av vilka många åberopat en unik peptid för identifiering och därmed sannolikt inte har upptäckas utan denna anrikning protokoll tanke på den enorma komplexitet totala cardiomyocyte proteom. Av de 1.048 proteinerna som vi identifierat från hjärt kärnorna var 56 av dem (5,3%) med kommentarer av GO analys att vara en del av det nukleosomen (en del av kärnan av intresse). En annan studie tittar på hela hjärtat, identifierade 6.180 proteiner, av vilka endast 11 proteiner (0,18%) var kommenterade att vara en del av nukleosomen 21. Det visar på styrkan i vår protokollet till meaningfully anrika nukleära proteiner.
5. Protein Gel och Enzymatisk protein Digest
Proteiner separerades genom endimensionell SDS-PAGE och trypsin digererade att köras på masspektrometern.
- Tina prover på is och bestämma proteinkoncentrationen för varje prov med användning av bicinkoninsyra (BCA)-proteinanalys.
- Späd prover med en känd koncentration med 5x Laemmli-buffert, koka i 10 min och förvara vid -20 ° C under en endimensionell SDS-PAGE. Späd prover till en känd koncentration med buffert urea extraktion och förvara vid -20 ° C under tvådimensionella geler.
- Run gel av val lastning lika mängd protein i varje spår. Protein kan överföras till ett nitrocellulosamembran som ska användas för Western blotting (såsom med kontroller i steg 4,1) eller band kan skäras för masspektrometrianalys, se följande steg.
- Ta gel från apparater med avjoniserat vatten för att överföra det till en ren behållare.Täck gel i Oriole fläcken, och linda behållare i aluminiumfolie för att blockera ljus. Tillåt gelén att inkubera vid rumstemperatur på en skakanordning under minst 90 minuter.
- Bild Oriole-färgad gel (Figur 3) med UV-ljus, och markera var banden klipps på bilden. Vi skär varje bana i cirka 25 2-mm band för studier som mäter den totala proteom.
- Placera gelen på en ren yta. Använd endast material som har hållits förseglad eller sprayas med etanol för att förhindra keratin kontaminering. Klipp ut varje band, och sedan ytterligare skär den i 3 lika stora bitar. Placera alla tre delar av varje band ihop till sitt märkt egen 1,5 ml rör. Gel bitar kan lagras vid -20 ° C under flera månader.
- Förbered gel pluggar för enzymatisk digerering. Smälta gelstyckena användning av trypsin vid 37 ° C över natten. För detaljerad gelprov protokoll se vår tidigare publikation. 22 Du kan smälta lågmolekylära banden med kymotrypsin i stället för trypsin,att eliminera trypsin omfattande klyvning av histon svansar.
6. Masspektrometri och dataanalys
Prover separerades på en LC och analyserades med MS / MS. Spektra söks mot ett protein databas för identifiering av proteiner.
- Run 10 pl av varje prov genom LC / MS / MS. Vi använder en nano-flöde Eskigent LC med en 75 | im kolonn med omvänd fas. Använd en LC körning optimerad för en rad av protein och peptider. Anställa en linjär gradient från mobil fas A (0,1% myrsyra, 2% acetonitril [ACN] i vatten) till mobil fas B (0,1% myrsyra, 20% vatten i ACN): 60 min från 5% mobil fas B till 50 % B, därefter 15 min från 50% B till 95% B och slutligen 10 min vid konstant 95% B. Använd en flödeshastighet av 200 Nl / min. Hämta data masspektrometri i en data-beroende läge. Vi använder en Thermo Orbitrap att fragment de bästa 6 mest förekommande moderjoner.
- Upprepa går minst tre biologiska och två tekniska replikat. (Recommended)
- Använd programvara (kommersiellt tillgängliga inkluderar BioWorks och Xcalibur,! Offentligt tillgängliga alternativ inkluderar STRYKA OMKRING, X Tandem, SpectraST) för att söka spektra mot UniProt databas val via en sökalgoritm (t.ex. SEQUEST eller MASCOT).
- Överväga att ändra sökparametrar för att möjliggöra cystein carbamidomethylation och metionin oxidation, två vanliga modifieringar som skapats under provet bearbetning.
- Beräkna ett falskt positivt takt med omvänd databassökning.
- Filtrera protein identifiering endast emot matcher en tröskel förtroende. Vi rekommenderar följande parametrar till att börja med: Xcorr> 3 (2),> 4 (3),> 5 (4), deltaCN> 0,1, konsensus poäng ≥ 20, massa tolerans 2 Da för moderjon, massa tolerans av 0,5 Da för produkt jon, minst 2 unika peptider per protein och högst 3 missade klyftor.
7. Etikett-fri Kvantifiering
Determine den relativa förekomsten av proteiner med användning av etikett-fri kvantifiering (figur 4).
- Ett antal program har offentligt eller kommersiellt tillgängliga för etikett-fri kvantifiering av masspektrometri data inklusive folkräkning (professor Yates 'grupp), 23 Elucidator (Microsoft), 24 sikt (Thermo Scientific), 25 Scaffold (Proteome Software). 26 Dessa program syftar till att korrelera masspektrometrisk signal intakta peptider eller antalet peptidsekvensering händelser med relativt protein kvantiteter mellan två eller flera stater.
- Medan varje program innehåller en liknande analys rörledning, vissa program begränsas till de typer av specifik analys som kan utföras på data. Initialt, är data från olika körningar inriktade, är signalintensitet normaliseras och peptid toppar väljs för analys.
- De två vanligaste metoderna är kvantifiering baserad på spektral räkning eller LC-MS topparea. Överflödnyckeltal beräknas för att bestämma förändringar i peptid-överflöd mellan olika grupper.
- Dessa program kan samverka med proteomik sökalgoritmer (Mascot, Sequest, X! Tandem) att korrelera kvantifiering information proteinidentifiering.
- För att säkerställa noggrannhet och reproducerbarhet av de uppgifter är det viktigt att införliva både biologiska (olika experimentella prover) och tekniska (kör samma prov på masspektrometern flera gånger) kopior av Masspektrum uppgifter.
- Variation av peptid överflöd i och mellan experimentella förhållanden kan bedömas genom ANOVA och ritas via PCA (Figur 5).
Viktiga överväganden för märkning utan kvantifiering. När du utför etikett-fri kvantifiering, måste särskild uppmärksamhet ägnas åt att säkerställa konsekvent provberedning, koktiden och LC-MS/MS villkor som varje prov måste bearbetas och analyseras separat. I motsats till METabolic märkning metoder, jämförelser i etiketten-fria experiment görs på data från distinkt masspektrometri kör (eftersom avsaknaden av märkning undanröjer möjligheten att köra dem tillsammans), vilket nödvändiggör hög reproducerbarhet i alla aspekter av provanalys (dvs. prov prep, LC och MS steg) och användning av hög massa massa noggrannhet spektrometrar.
Att ta hänsyn till små förändringar i provberedning och analys en känd standard kan sättas till varje prov för att hjälpa till normalisering av data. Dessutom de flesta program tillåter normalisering av signalintensiteter (t.ex. genom att anpassa sig till bakgrundsljud eller en känd riklig analyt) efter datainsamling för att ta hänsyn till skillnader i injektion, jonisering och fragmentering. Alignment algoritmer finns i de flesta av de ovan refererade program som hjälper till att korrigera skillnader i peptid elueringsprofiler. Användningen av biologiska och tekniska replikat är essendande i denna typ av studie, eftersom det tillåter statistiska analyser för att bekräfta reproducerbarheten och konsistens eventuella observerade förändringar i protein överflöd.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Figur 4 belyser användbarheten av denna form av relativ kvantifiering. Visas i den vänstra panelen är de individuella monoisotopisk peptid toppar (överlagras från olika möss), som har utsetts som tillhör protein HMGB1 (identifierad genom databassökning). Varje topp, väsentligen en extraherade jonkromatograf för den givna peptiden, kommer från en annan mus. Grupperna representerar tre olika fysiologiska tillstånd: basal, hjärthypertrofi och hjärtsvikt, med tre biologiska replikat för varje grupp. Genom att integrera ytan under kurvan, kan en relativ överflöd beräknas. I mitten panelen medelvärdet av dessa abundances visas. Det framgår av denna typ av analys att överflöd av HMGB1 proteinet förändras under loppet av sjukdomen. I motsats, bottenpanelema visar exempel histon H4 som inte ändras med sjukdom. I båda fallen, peptider som kommer från djur av samma phenotypic tillstånd visar liknande elueringsprofiler och relativ förekomst, vilket visar reproducerbarheten för provberedning och LC / MS / MS.
Reproducerbarheten hos denna teknik är ytterligare bekräftats med användning huvudsakliga komponenter (PCA). Såsom visas i figur 5, visar applicering av ANOVA den totala proteom resultaten av varje djur som analyseras en distinkt kluster av hjärt fenotyp (biologiskt replikat) med den tätaste sambandet mellan teknisk replikat (olika masspektrum körningar av samma prov) från samma djur . Detta ger förtroende att överflöd observerade förändringarna för enskilda proteiner av intresse är verkligen tillskrivas skillnaden i det fysiologiska tillståndet.
Av lika stor betydelse som kvantifieringen och reproducerbarhet av resultaten är den ökade täckningen av det nukleära proteomet möjliggörs av nukleär subfraktionering. Figur 6 illustrerar att analysen av hela kärnan ensamt misslyckas med att avslöja även en majoritet av de nukleära proteinerna identifieras när kombinera individuella analyser från de separata facken (1.048 unika proteiner som identifierats i totalt över fraktionerna kontra 428 identifieras från den intakta kärnor). Dessutom visar de moderata överlappningen mellan de olika fraktionerna den biologiska relevansen av att betrakta dessa avdelningar individuellt för extra inblick i kärn funktion och genreglering. Slutligen, förmågan att specifikt fraktionera syraextraherade eller rengöringsmedel-extraherade kromatin berikar för viktiga kromatin strukturella proteiner, såsom histoner, vilket möjliggör mer fokuserade masspektrometriska analyser (såsom de som riktar post-translationella modifieringar) på en grupp av proteiner utan kräver specifika antikroppar för varje variant och isoform.
94fig1highres.jpg "src =" / files/ftp_upload/4294/4294fig1.jpg "/>
Figur 1. Flödesschema för karakterisering av proteiner i hjärtat nukleära sub fack. Hela mus hjärtan homogeniseras och lysatet berikat för kärnor. Kärnor fraktioneras i nucleoplasm, tvättmedel-extraherade kromatin, och syra-extraherade fraktionerna kromatin. Proteiner från varje isoleras och separeras med endimensionell SDS-PAGE och banden trypsin digererade och drivs genom LC / MS / MS. Efter databassökning, är etiketten utan kvantifiering används för att identifiera förekomst trender för proteiner i de olika fraktionerna.
Figur 2. Nuclear fraktionering schema. Kärnor anrikas från hela hjärtat homogenat via en sackarosgradient. Varje kärnor prov kan antingen separeras i nucleoplasm och diskmedel-extraherade fraktioner eller i en acID-extraherade fraktionen som berikar för histoner.
Figur 3. Endimensionell gel av de olika fraktionerna. 20 pg av hela hjärtat lysat (WHL), intakta kärnor (Nuc), nucleoplasm (NUP), tvättmedel-extraherat kromatin (DE), och syra-extraherade kromatin (AE) fraktionen från mushjärta kördes på en endimensionell SDS-PAGE-gel (12% akrylamid) tillsammans med syraextraherade kromatin fraktion från HeLa-celler och färgades med Oriole. De olika mönstring av överflöd av totalt protein i de olika molekylvikterna visar att det finns unika proteom för de olika sub fack, inklusive berikning för lägre molekylvikt histoner i tvättmedel extraherade kromatin som vidare anrikas i syraextraherad fraktioner . Också av notera är betydligt mindre komplicerade AE fraktionen från HeLa-cells jämfört med den från hjärtat.
Figur 4. Relativ överflöd kvantifiering Möss från tre olika hjärt lydelse:. Basala (blå) hypertrofi (röd) och underlåtenhet (grön) samlades i tre exemplar och deras proteinprover sprang i två tekniska replikat med LC / MS / MS. Visas till vänster är de monoisotopisk topparna för en specifik peptid (vars spektra visas till höger). Relativ överflöd beräknades genom integration och genomsnitt mellan replikat av varje fenotypisk status (mitten panelen) för att jämföra den relativa abundansen av peptiden (och proteinet varifrån den kom) i de olika länderna på hjärtsvikt. Den övre panelen visar en peptid från HMGB1, vars förekomst ändras i sjukdom, medan bottenpanelen (histon H4) inte ändrar. Klicka här för att se större bild .
Figur 5. Principalkomponentanalys analys visar reproducerbarhet. ANOVA-analys för varje mus (3 biologiska replikat / hjärt tillstånd x 2 tekniska replikat) plottas för peptid intensitet (axlar) visar klustring av sjukdomstillstånd (basal i blått, hypertrofi i rött, misslyckande i grönt), vilket indikerar lyckad reproducerbarhet Masspektrum data och viktiga fysiologiska skillnader mellan de olika sjukdomstillstånd.
Figur 6. Den globala karakterisering av olika nukleära sub fack. Vi identifierade 1.048 totalt unika proteiner i alla 4 FRåtgärder. 146 proteiner delas av alla 4 fraktioner, jämfört med 749 proteiner som identifierats i nucleoplasm, 380 i tvättmedel extraherade kromatin fraktion, 426 i syraextraherade kromatinet fraktion och 428 i den intakta kärnor. Den Venndiagram visar de moderata överlappning i identifierade proteiner mellan fraktionerna, belyser förekomsten av olika regioner i vivo och förmågan hos denna fraktionering att isolera dem. Dessutom motiverar markant ofullständig karakterisering av den totala nukleära proteomet uppnås genom att endast analysera ofraktionerat kärnor (orange) ytterligare fraktionering.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Två huvudsakliga metoder för kärn isolering har granskats tidigare: 27 en är Behrens teknik homogenisering lyofiliserat vävnad i ett icke-vattenhaltigt lösningsmedel och andra, en modifiering som vi använder här, homogenisering vävnad i en vattenbaserad sackaros / saltlösning följt genom differentiell eller densitet-centrifugering.
Subfraktionering av kärnorna genom syraextraktion på vävnadsprov är ett viktigt verktyg för att studera kromatin som har använts sedan 1960, 28 med det ursprungliga målet är att analysera histoner. Syra-extraktion protokoll utvecklades för detta mål att rena centrala nucleosomal histoner komponenter är en frånvaro av information om icke-histonproteiner utgör, och ändrar, kromatin 29 En begränsning av dessa tidigare studier,. Vi har tagit upp denna utmaning med det nuvarande protokollet för karakterisering distinkta biologiska underfraktioner av kärnan och kromatin.Detta tillvägagångssätt, som använder tvättmedel utvinning eller syraextraktion av kromatin parallellt, avslöjar mångfalden av kromatin regulatoriska molekyler och skiljer mellan nivåerna av endogent förordningen och därmed fungerar som en robust strategi för hypotes generation.
Tillämpa etablerade syra-extraktion metod för vuxna myocyt innebär vissa hinder, inklusive täta cytoskelettet och stora mitokondrie befolkning. Även versioner av syra-extraktion har använts på hela hjärtvävnad 30 experimenten utfördes på ett målinriktat sätt för att studera kända proteiner, det nuvarande protokollet är utformad och har genomförts för att möjliggöra opartisk proteomanalys. Dessutom fann vi det fördelaktigt att undersöka tvättmedel-extraheras och syraextraherad kromatin separat (endast 37% överlappning observerades mellan proteom dessa två fraktioner) för att bättre förstå dynamiken genom vilka dessa populationer av kromatin proteiner interact med DNA. Andra protokoll använder ureabaserade buffertar har också beskrivits, 31,32 som utförs före syraextraktion, berika proteinerna mindre hårt bundna till genomet. Förutom kromatin fraktioner, andra har subfractionated kärnan att isolera kärnsystemet, 33 men subfraktionering för masspektrometri analys av hjärtinfarkt kärnor isolerad från hela hjärtan har inte rapporterats.
Shotgun proteomik studier intakta kärnor, det vill säga ofraktionerat organeller-har utförts på hjärtmuskelvävnad med en MudPIT metod. 15 Denna studie identifierade 1.044 nukleära hjärt proteiner, i samma skala som vår protokoll, men de förlitade sig på att använda ett genomsnitt av 8,5 replikat, för varje gång varar 20 timmar för att upptäcka låga överflöd proteiner. Däremot använde vi subfraktionering, att både öka antalet identifierbara proteiner (utan att behöva lång kromatografi-vår LC körningar är 85 minuter) medan importntly också erbjuda ytterligare biologisk information på sub-nukleära lokalisering och relativ förekomst av proteinerna.
Från en hel mus hjärta (ca 0,14 g) vi återhämta ungefär 1,2 mg (0,85% av det totala) av protein i intakta kärnor. Från den intakta kärnor vi uppnå följande återhämtningen för varje subfraktionerna (Obs! de totala värdena överstiger 100% som syra-extraktion och diskmedel-utvinning sker på separata hjärtan, inte i serie): Nucleoplasm (15%), tvättmedel, extraherades kromatin (85%), och syra-extraherade kromatin (54%). Som jämförelse har Thermo Scientific ett kit (NE-PER nukleära och cytoplasmiska reagenser) som deras datablad säger ger 1,6 mg cytosoliskt protein och 0,6 mg nukleärt protein (1,5%) från 40 mg mus hjärta med en 10% korskontaminering mellan de två fraktionerna. Sigma har ett kit (NXTRACT, CellLytic Nuclear Extraction Kit) som de har testats på kanin muskler, men inte hjärta och återhämtat sig från 100 mg vävnad 0,46 mg nukleärt protein (0,46%) i vad de kallar sin "rå kärnkraft pellets" med en "några procent" av cytoplasmisk förorening. Andra företag, som Epigentek erbjuder även byggsatser, men vi kunde inte hitta specifika detaljer om anrikning och renheten på sina webbplatser för jämförelse.
Vi har beskrivit en ny teknik för att tar det aktuella behovet för framgångsrik anrikning av hjärt kärnor för proteomik studier. Vi beskriver vidare metodik för sub fack fraktionering, som både ökar möjligheten att upptäcka mindre rikliga proteiner samt möjliggör högre upplösning, kvantifiering och bestämning av protein lokalisering. I detta syfte har protokollet för masspektrometri analys rekommenderade riktlinjer, men från fall till fall överväganden kommer sannolikt att bli nödvändiga. Till exempel fann vi att det stora antalet hjärt histon variant isoformer med sekvens krävs likhet manuell inspektion av spektra att tilldela maJor toppar och bekräfta massa moderjon innan du kan tryggt tilldela spektra. kan 14 sökparametrar också anpassas för post-translationell modifiering (PTM) identifiering och utmärkta recensioner finns detalj beskriver metoder och problem med tolkning av data för PTM-analys (inklusive PTM anrikning , 34 programvara för PTMs, 35 analys av kombinatoriska PTMs, 36 alternativa fragmentering strategier 37 och alternativa matsmältning och bearbetning 38,39).
Anrikning och fraktionering beskrivs är från hela hjärtat (som är 50-70% cardiomyocyte vikt). Även om detta uppoffringar aspekter av cellspecificitet som kan vara särskilt viktigt för vissa familjer av nukleära proteiner, möjliggör det en mycket snabbare upphängning av proteinerna i rätt buffertar, vilket inte är möjligt med vuxna myocyt protokoll cellisolering. På detta sätt, bevarar denna metod bättre integritet of provet mot nedbrytning. Men också beskrivs är instruktioner för att tillämpa detta protokoll till isolerade neonatala myocyter råtta ventrikulära, eftersom båda isolerade celler och hela organismen modeller är nödvändiga verktyg för att studera hjärtsvikt. I princip denna metod kan också tillämpas på vuxna myocyter extraherade från enzymdigestion från isolerade hjärtan-med förbehållet att förändringar i protein bindning som inträffar under isoleringen (som kan sträcka sig över en timme) kommer förbrylla tolkningen av proteomik observationer.
Vi utvecklade denna metod för att förstå förändringarna i den nukleära proteomet och kromatin smink som bidrar till sjukdomen. 14 Men andra användningsområden studerar stimulus-specifika förändringar i proteom sammansättning i normal fysiologi. Dessutom erbjuder sub-fraktionering möjligheten för en ny nivå av karakterisering av hur proteiner fungerar och lokalisera olika distinkta funktionella regioner av kärnan.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Inga intressekonflikter deklareras.
Acknowledgments
Den Vondriska Lab stöds av anslag från National Heart, Lung and Blood Institute av NIH och Laubisch Endowment vid UCLA. EM är mottagare av Jennifer S. Buchwald Graduate Fellowship i fysiologi vid UCLA, HC är mottagare av ett American Heart Association doktorander Fellowship, MP är mottagare av en NIH Ruth Kirschstein postdoktorala stipendiet, och SF är mottagare av en NIH K99 Award.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dulbeco Modified Eagle Medium | Invitrogen | 11965 | |
| Protease pellet | Roche | 04 693 159 001 | |
| 100 μm strainer | BD Falcon | 352360 | |
| Ultracut ultramicrotome | Reichert | ||
| 100CX Transmission Electron Microscope |
JEOL USA, Inc. | ||
| Oriole | BioRad | 161-0496 | |
| Histone H2A antibody | Santa Cruz | sc-8648 | |
| Nucleoporin p62 antibody | BD Biosciences | 610498 | |
| Adenine nucleotide transporter antibody | Santa Cruz | sc-9299 | |
| BiP antibody | Santa Cruz | sc-1050 | |
| Tubulin antibody | Sigma | T1568 | |
| Histone H3 antibody | Abcam | ab1791 | |
| Fibrillarin antibody | Cell Signaling | C12C3 | |
| SNRP70 antibody | Abcam | ab51266 | |
| E2F-1 antibody | Thermo Fisher | MS-879 | |
| Retinoblastoma antibody | BD Biosciences | 554136 | |
| Hypoxia inducible factor-1 antibody | Novus Biologicals | NB100-469 | |
| BCA protein assay | Thermo Scientific | 23227 | |
| Reverse phase column | New Objective | PFC7515-B14-10 | |
| BioWorks Browser | Thermo Scientific |
References
- Li, F., Wang, X., Capasso, J. M., Gerdes, A. M. Rapid transition of cardiac myocytes from hyperplasia to hypertrophy during postnatal development. J Mol Cell Cardiol. 28, 1737-1746 (1996).
- Rumyantsev, P. P. Interrelations of the proliferation and differentiation processes during cardiact myogenesis and regeneration. Int Rev. Cytol. 51, 186-273 (1977).
- Olson, E. N., Schneider, M. D. Sizing up the heart: development redux in disease. Genes Dev. 17, 1937-1956 (2003).
- Molkentin, J. D., Dorn, G. W. 2nd Cytoplasmic signaling pathways that regulate cardiac hypertrophy. Annu Rev. Physiol. 63, 391-426 (2001).
- Fishman, M. C., Chien, K. R. Fashioning the vertebrate heart: earliest embryonic decisions. Development. 124, 2099-2117 (1997).
- Rajabi, M., Kassiotis, C., Razeghi, P., Taegtmeyer, H. Return to the fetal gene program protects the stressed heart: a strong hypothesis. Heart Fail Rev. 12, 331-343 (2007).
- Roger, V. L., et al. Heart disease and stroke statistics--2011 update: a report from the American Heart Association. Circulation. 123, e18-e209 (2011).
- Schirmer, E. C., Florens, L., Guan, T., Yates, J. R. 3rd, Gerace, L. Nuclear membrane proteins with potential disease links found by subtractive proteomics. Science. 301, 1380-1382 (2003).
- Lambert, J. P., Mitchell, L., Rudner, A., Baetz, K., Figeys, D. A novel proteomics approach for the discovery of chromatin-associated protein networks. Mol. Cell Proteomics. 8, 870-882 (2009).
- Malik, P., et al. Cell-specific and lamin-dependent targeting of novel transmembrane proteins in the nuclear envelope. Cell Mol Life Sci. 67, 1353-1369 (2010).
- Tweedie-Cullen, R. Y., Reck, J. M., Mansuy, I. M. Comprehensive mapping of post-translational modifications on synaptic, nuclear, and histone proteins in the adult mouse brain. J. Proteome Res. 8, 4966-4982 (2009).
- Chu, D. S., et al. Sperm chromatin proteomics identifies evolutionarily conserved fertility factors. Nature. 443, 101-105 (2006).
- Uchiyama, S., et al. Proteome analysis of human metaphase chromosomes. J. Biol. Chem. 280, 16994-17004 (2005).
- Franklin, S., et al. Specialized compartments of cardiac nuclei exhibit distinct proteomic anatomy. Mol. Cell Proteomics. 10, (2011).
- Kislinger, T., et al. Global survey of organ and organelle protein expression in mouse: combined proteomic and transcriptomic profiling. Cell. 125, 173-186 (2006).
- Moore, D. H., Ruska, H. Electron microscope study of mammalian cardiac muscle cells. J. Biophys Biochem. Cytol. 3, 261-268 (1957).
- Anversa, P., Vitali-Mazza, L., Visioli, O., Marchetti, G. Experimental cardiac hypertrophy: a quantitative ultrastructural study in the compensatory stage. J. Mol. Cell Cardiol. 3, 213-227 (1971).
- Franklin, S., et al. Specialized compartments of cardiac nuclei exhibit distinct proteomic anatomy. Mol Cell. Proteomics. 10, (2011).
- Paulsson, A. K., et al. Post-translational regulation of calsarcin-1 during pressure overload-induced cardiac hypertrophy. Journal of molecular and cellular cardiology. 48, 1206-1214 (2010).
- Franklin, S., et al. Quantitative analysis of the chromatin proteome in disease reveals remodeling principles and identifies high mobility group protein b2 as a regulator of hypertrophic growth. Mol Cell Proteomics. 11, (2012).
- Gramolini, A. O., et al. Comparative proteomics profiling of a phospholamban mutant mouse model of dilated cardiomyopathy reveals progressive intracellular stress responses. Mol Cell Proteomics. 7, 519-533 (2008).
- Singh, H., Warburton, S., Vondriska, T. M., Khakh, B. S. Proteomics to Identify Proteins Interacting with P2X2 Ligand-Gated Cation Channels. J. Vis. Exp. (27), e1178 (2009).
- Park, S. K., Venable, J. D., Xu, T., Yates, J. R. 3rd A quantitative analysis software tool for mass spectrometry-based proteomics. Nat. Methods. 5, 319-322 (2008).
- Lomenick, B., et al. Target identification using drug affinity responsive target stability (DARTS). Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 106, 21984-21989 (2009).
- Kamleh, A., et al. Metabolomic profiling using Orbitrap Fourier transform mass spectrometry with hydrophilic interaction chromatography: a method with wide applicability to analysis of biomolecules. Rapid Commun. Mass Spectrom. 22, 1912-1918 (2008).
- Searle, B. C. Scaffold: a bioinformatic tool for validating MS/MS-based proteomic studies. Proteomics. 10, 1265-1269 (2010).
- Murray, K. The Basic Proteins of Cell Nuclei. Annu Rev. Biochem. 34, 209-246 (1965).
- Johns, E. W., Phillips, D. M., Simson, P., Butler, J. A. Improved fractionations of arginine-rich histones from calf thymus. Biochem. J. 77, 631-636 (1960).
- Rodriguez-Collazo, P., Leuba, S. H., Zlatanova, J. Robust methods for purification of histones from cultured mammalian cells with the preservation of their native modifications. Nucleic Acids Res. 37, e81 (2009).
- Kuehl, L., Salmond, B., Tran, L. Concentrations of high-mobility-group proteins in the nucleus and cytoplasm of several rat tissues. J. Cell Biol. 99, 648-654 (1984).
- Gronow, M., Griffiths, G. Rapid isolation and separation of the non-histone proteins of rat liver nuclei. FEBS Lett. 15, 340-344 (1971).
- Mischke, B. G., Ward, O. G. Isolation and tissue specificity of chromatin-associated proteins in Vicia faba. Can J. Biochem. 53, 91-95 (1975).
- Andersen, J. S., et al. Directed proteomic analysis of the human nucleolus. Curr. Biol. 12, 1-11 (2002).
- Zhao, Y., Jensen, O. N. Modification-specific proteomics: strategies for characterization of post-translational modifications using enrichment techniques. Proteomics. 9, 4632-4641 (2009).
- Ahrne, E., Muller, M., Lisacek, F. Unrestricted identification of modified proteins using MS/MS. Proteomics. 10, 671-686 (2010).
- Young, N. L., Plazas-Mayorca, M. D., Garcia, B. A. Systems-wide proteomic characterization of combinatorial post-translational modification patterns. Expert Rev. Proteomics. 7, 79-92 (2010).
- Guthals, A., Bandeira, N. Peptide identification by tandem mass spectrometry with alternate fragmentation modes. Mol. Cell Proteomics. , (2012).
- Wu, C., et al. A protease for 'middle-down' proteomics. Nat. Methods. , (2012).
- Tran, J. C., et al. Mapping intact protein isoforms in discovery mode using top-down proteomics. Nature. 480, 254-258 (2011).
