Summary
Advances in massaspectrometrie toestemming hebben high throughput analyse van eiwitexpressie en modificatie in een groot aantal weefsels. Gecombineerd met subcellulaire fractionering en ziektemodellen, kwantitatieve massaspectrometrie en bioinformatica nieuwe eigenschappen kunnen onthullen in biologische systemen. De werkwijze hierin beschreven analyseert chromatine-geassocieerde eiwitten in de vaststelling van hart-en vaatziekten en is gemakkelijk toepasbaar op andere
Abstract
In de kern bevinden de proteomen waarvan de functies zijn het meest nauw verbonden met de genregulatie. Volwassen zoogdier cardiomyocyte kernen zijn uniek vanwege het hoge percentage binucleaire cellen, de overwegend een heterochromatine toestand van het DNA en de niet-delende aard van de cardiomyocyt waarin volwassen kernen maakt in een permanente staat van interfase. Twee Transcriptionele regulatie tijdens de ontwikkeling en ziekte zijn goed bestudeerd in dit orgaan, 3-5 maar wat blijft relatief onontdekt is de rol van de nucleaire eiwitten die verantwoordelijk zijn voor DNA verpakking en expressie, en hoe deze eiwitten veranderingen in transcriptie's die tijdens ziekte te bestrijden. 6 In de ontwikkelde wereld, hart-en vaatziekten is de nummer een doodsoorzaak voor zowel mannen als vrouwen. 7 Inzicht in hoe nucleaire eiwitten samen te werken om de progressie van deze ziekte te reguleren is van cruciaal belang voor het bevorderen van de huidige behandeling oOPTIES.
Massaspectrometrie is de ideale tool voor het aanpakken van deze vragen omdat het zorgt voor een onpartijdige annotatie van de nucleaire proteoom en de relatieve kwantificatie voor de manier waarop de overvloed van deze eiwitten verandert met de ziekte. Hoewel er verschillende proteomics studies voor zoogdieren nucleaire eiwit-complexen, 8-13 tot voor kort 14 is er slechts een studie naar de cardiale nucleaire proteoom, en zij van mening was de hele kern, in plaats van het verkennen van het proteoom op het niveau van de nucleaire sub compartimenten 15. In groot deel is dit gebrek aan werk te wijten aan de moeilijkheid van het isoleren van cardiale kernen. Cardiac kernen optreden binnen een starre en dichte actine-myosine inrichting waaraan zij verbonden via meerdere verlengingen van het endoplasmatisch reticulum, voorzover myocyte contractie verandert bovendien hun algemene vorm. 16 cardiomyocyten zijn 40% mitochondria vol 17 die necessitates verrijking van de kern naast de andere organellen. Hier beschrijven we een protocol voor cardiale nucleaire verrijking en verdere fractionering in biologisch relevante compartimenten. Verder hebben we detail werkwijzen voor label-free kwantitatieve massaspectrometrische dissectie van deze fracties-technieken vatbaar voor in vivo experimenten in verschillende diermodellen en orgaansystemen waar metabolische labeling niet haalbaar.
Protocol
De experimentele workflow bevat zeven belangrijke stappen (Figuur 1). Voor alle werkzaamheden waarbij monsters die zullen worden uitgevoerd op de massaspectrometer, moet er worden dragen een laboratoriumjas, handschoenen en haarnetje en zorg om besmetting tegen stof en persoonlijke vergieten van keratine te voorkomen.
1. Hart Homogenisatie en nucleaire Isolatie
Muis harten gehomogeniseerd en een intacte kernen pellet wordt geïsoleerd (Figuur 2).
- Sacrifice volwassen muis, accijnzen het hart, spoel in ijskoud PBS, en homogeniseren op ijs in glas dounce (wij geven de voorkeur aan Wheaton Tissue Grinder van Fisher, # 08-414-13A, maar andere methoden kunnen even goed werken) met 2 ml lysebuffer (een hypotone oplossing die differentieel het celmembraan lyseert de organellen zoals de nucleus) (10 mM Tris pH 7,5, 15 mM NaCl en 0,15% v / v Nonidet P-40 [NP-40] in gedeïoniseerd water plus protease en fosfatase inhibitor mengsel: 10 mM natriumbutyraat, 0,1 mM fenylmethylsulfonylfluoride [PMSF], 0,2 mM Na 3 VO 4, 0,1 mM NaF en 1 ml Roche protease pellet/10 - lysis buffer kan worden opgeslagen gedurende een week bij -20 ° C ). (Let op: Wij vinden het niet nodig om de harten perfuseren met PBS, als onze massaspectrometrie data en GO-analyse identificeren van de eiwitten als overwegend cardiomyocyten [p-waarde 3.8E-22] in oorsprong, in tegenstelling tot besmet bloed [p-waarde 5,0 E-2].)
- Pour lysaat door 100 um zeef en verzameld doorstroming in 1,5 ml centrifugebuis. Op dit punt, tenzij anders vermeld, moet monster op ijs gehouden.
- Centrifugeer bij 4.000 tpm gedurende 5 min bij 4 ° C.
- Verwijder supernatant. (Dit is het cytosol, en worden opgeslagen bij -80 ° C. Het bevat het gelyseerde mitochondria.) Hersuspendeer pellet in 200 ul lysis buffer door fijnwrijven. (Dit is de primitief nucleair pellet.)
- Vul 1,5 ml centrifugebuis met 1 ml van sucrose buffer (24% sucrose gewicht / volume, 10 mM Tris pH 7,5 en 15 mM NaCl in gedeïoniseerd water met protease / fosfatase-inhibitor mengsel - sucrose buffer moet worden vers op de dag van gebruik). Voorzichtig laag de geresuspendeerde pellet bovenop de sucrose pad en centrifugeer bij 5000 rpm gedurende 10 min bij 4 ° C.
- Verwijder de dunne film geplaatst en de sucrose pad (welke membraan). Spoel de resterende pellet met 200 ul ijskoude PBS / EDTA (1x PBS met 1 mM EDTA). (Dit is de kern pellet en kunnen oplosbaar of vastgesteld voor gebruik in western blotting of elektronenmicroscopie [Zie stappen 4.1 en 4.2] tot verrijking kwantificeren.)
2. Nucleoplasma en Wasmiddel geëxtraheerd Chromatine Fractionering
Het ruwe kernen pellet wordt gescheiden in een nucleoplasma en detergent geëxtraheerd chromatine fractie, bevattende eiwitten los geassocieerd met de DNA.
- Tritureer pellet vanaf stap 1.6 in 200 ul detergent extractiebuffer (20 mM HEPES pH 7,6, 7,5 mM MgCl2. 0,2 mM EDTA, 30 mM NaCl, 1 M ureum, 1% NP-40 in gedeïoniseerd water met protease / fosfatase-inhibitor mengsel - detergensextractie buffer kan worden opgeslagen gedurende een week bij -20 ° C).
- Vortex monster 2 keer, 10 sec per stuk. Op ijs 10 min.
- Centrifugeer bij 13.000 rpm gedurende 5 min bij 4 ° C.
- Verwijder supernatant. (Dit is het nucleoplasma en moeten worden bewaard bij -80 ° C). Spoel pellet met ijskoude PBS / EDTA. (Dit is de chromatine pellet.)
- Tritureer pellet in 300 pl Tris, SDS, EDTA buffer (50 mM Tris pH 7,4, 10 mM EDTA, 1% SDS in gedeïoniseerd water met protease / fosfatase-inhibitor mengsel - Tris, SDS, EDTA buffer kan gedurende maximaal een week -20 ° C).
- Sonificeer 3-6 keer gedurende 10 seconden elke te breken DNA. Houd monster op ijs tussen sonications.
- Centrifugeer bij 13.000 rpm gedurende 5 min bij 4 ° C. Houd het supernatant. (Supernatant is het wasmiddel-geëxtraheerde chromatine eiwit fractioneringsstabilisatien en worden bewaard bij -80 ° C). De resterende pellet moeten klein en kunnen worden weggegooid.
- Bij gebruik van geïsoleerde myocyten in plaats van het gehele hart isoleren neonatale rat ventriculaire myocyten van ratten een dag na de geboorte met enzymatische digestie, gevolgd door kweek in Dulbecco gemodificeerd Eagle medium (DMEM) met 10% foetaal bovine serum (FBS), 1% insuline -transferrine-natriumseleniet (ITS) en 1% penicilline. Na 24 uur overbrengen naar serumvrij medium (zelfde als hierboven, maar zonder FBS). Oogst cellen in lysis buffer (1,1 in), en beginnen nucleaire fractionering bij stap 1.3.
3. Acid-extractie Fractionering - DNA-gebonden eiwit Verrijking
Een aparte fractionering verrijkt voor eiwitten stevig gebonden aan het DNA, waaronder histonen.
- Herhaal de stappen 1,1-2,4.
- Tritureer de chromatine pellet in 400 pl van 0,4 N zwavelzuur. Vortex om klonten te verwijderen.
- Incubeer bij 4 ° C gedurende 30 min of overnight tijdens het roteren.
- Centrifugeer bij 16.000 xg gedurende 10 min bij 4 ° C nucleaire afval te verwijderen.
- Breng supernatant naar een nieuwe buis.
- Voeg 132 ul van trichloorazijnzuur druppelsgewijs aan de supernatant. Omkeren meerdere malen. Incubeer op ijs gedurende 30 minuten.
- Centrifugeer bij 16.000 xg gedurende 10 min bij 4 ° C.
- Gooi supernatant. Spoel pellet met ijskoude aceton. (Dit is de histone pellet.)
- Centrifugeer bij 16.000 xg gedurende 10 min bij 4 ° C.
- Herhaal wassen, stappen 3,8-3,9.
- Lucht drogen pellet.
- Resuspendeer de pellet in 100 pl Tris, SDS, EDTA buffer. Stel pH tot 8 door toevoeging van 1 M Tris. (Gebruik een 1 M Tris voorraad die niet is pH-aangepast.)
- Ultrasone trillingen in een waterbad gedurende 15 minuten. Voorkom oververhitting door het toevoegen van ijs waterbad. (Dit is het zuur geëxtraheerde fractie en moeten worden bewaard bij -80 ° C.)
4. Zuiverheid Controleer
Western blots en elektronenmicroscopiebevestigen succesvolle verrijking van kernen en uitputting van andere organellen. Om typische resultaten voor alle volgende kwaliteitscontrole testen zie, zie onze eerdere publicatie 18.
- Western blot-analyse uitvoeren. Probe membraan dat elke fractie voor histon H2A en nucleoporin p62 (zo nucleaire markers voor verrijking controleren), en adenine nucleotide transporter, BiP en tubuline (als mitochondriale marker, endoplasmatisch reticulum marker en cytoskelet marker respectievelijk zuiverheid te controleren). Om succesvol te subfractionation van de kernen, sonde controleert voor histon H3 of fibrillarin (reinigingsmiddel en zuur geëxtraheerde chromatine en intacte kernen) en SNRP70 of E2F (nucleoplasma). Probe voor retinoblastoom of hypoxia induceerbare factor-1 (verrijkt in detergent geëxtraheerd chromatine meer zuur geëxtraheerde fractie). Extra steekproeven voor controles van HeLa-cellysaat en hele hart lysaat kan ook worden uitgevoerd in dezelfde gel: Bereid HeLa cel lysaat controle door het toevoegen van Tris, SDS, EDTA buffer om de cultuur schotel en het gebruik van een cel schraper om te proeven verzamelen. Sonificeer en centrifugeer steekproef als in stappen 2,6-2.7. Bereid gehele hart lysaat controle door homogeniseren van het hart in 2 ml buffer (20 mM Tris pH 7,4, 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1 mM EGTA, 1% triton X-100, 2,5 mM natriumpyrofosfaat, 1 mM glycerofosfaat in gedeïoniseerd water met protease en fosfatase-inhibitor mengsel). Sonificeer en centrifugeer als in stappen 2,6-2,7. Zie stap 5 voor het bereiden eiwitmonsters voor SDS-PAGE.
- Elektronenmicroscopie: Resuspendeer de kernen pellet uit stap 1.6 in lysis-buffer met 2% gluteraldehyde en monster bij 4 vaststellen ° C. Spoel monsters in osmic zuur, gedehydreerd, en in te bedden in epoxyhars. Cut 70 nm plakken met een Reichert Ultracut ultramicrotoom. Stain monsters in uranylacetaat en dan lood en beeld met behulp van een JEOL 100CX Transmission Electron Microscope. Kwantificeren verrijking door meten van het oppervlak van intacte kernen versus oppervlakte materiaal afgebeeld. We vinden 60-80% van kernen naarintact zijn. 14
Belangrijke overwegingen voor het verrijken versus zuiveren kernen. Dit protocol werd ontwikkeld om proteoomanalyse van cardiale chromatine toestaat voor de bestudering van globale genregulatie processen bij ziekte. Een belangrijk onderdeel van het ontwerpen van geheel-proteoom massaspectrometrie-experimenten is de kwestie van dynamisch bereik en het kunnen identificeren en karakteriseren van lage-overvloed eiwitten. Naast het primaire doel van het verstrekken van informatie over nucleaire en chromatine-specifieke biologie, verrijkend voor de nucleaire proteoom, verhoogt de waarschijnlijkheid van het opsporen van deze low-overvloed eiwitten, net als verdere subfractionation van de kernen. Zoals besproken, de volwassen cardiomyocyten een dichte cytoskelet component aangesloten op de kernmembraan. Wij geloven niet dat we volledig hebben de kernen van deze andere cellulaire componenten gezuiverd. Echter door verrijking alleen de kernen, krijgen weed een aanvaardbare drempel van het soort analyses mogelijk beschreven.
Specifiek hebben we EM de zuiverheid van onze grove kernen pellet beoordelen en vond 60-80% van de breuk intacte kernen, mitochondria ongeveer 10%, en de rest puin. Daarnaast hebben we weten uit onze vorige studie over de intacte kernen bevolking, terwijl veel myofilamenten niet verrijkt met dit protocol (inclusief tubuline en actine zoals gemeten door Western) bepaalde eiwitten (calsarcin-1) zijn verrijkt suggereert een echte biologische populatie deze eiwitten in de cardiale kernen 19.
Bovendien hebben we de eiwitten die we gevonden dat in de zuur geëxtraheerde fractie chromatine, het voorspelde rollen van deze eiwitten door gen ontologie. Belangrijk is dat dit gen ontologie analyse geen rekening gehouden met de relatieve hoeveelheden van de verschillende eiwitten (evenals onze Western blot data) maar telt alle geïdentificeerde eiwitten (verrijkened of niet) als gelijkwaardige bij het vaststellen van gemeenschappelijke paden en cellulaire compartimenten. Analyse van deze routes en cellulaire compartimenten kan worden gevonden in onze eerdere publicaties. 18,20 Het belangrijkste is dat het succes van de verrijking in het zuur-geëxtraheerde chromatine fractie liet ons toe om de aanwezigheid van 54 histon-varianten in de volwassen muis myocyte, 18 te identificeren waarvan vele zich op een unieke peptide voor identificatie, en dus zou waarschijnlijk niet zijn aantoonbaar zonder deze verrijking protocol gezien de enorme complexiteit van de totale cardiomyocyt proteoom. Van 1.048 eiwitten identificeerden we de cardiale kernen, 56 van hen (5,3%) werden geannoteerd door GO analyse van het nucleosoom (een component van de kern plaats) zijn. Een onderzoek naar het gehele hart geïdentificeerd 6.180 eiwitten, waarvan slechts 11 eiwitten (0,18%) werden geannoteerd deel van het nucleosoom 21 worden. Dit illustreert verder de kracht van onze protocol meaningfully verrijken voor nucleaire eiwitten.
5. Eiwit Gel en Enzymatische Protein Digest
Eiwitten worden gescheiden door eendimensionale SDS-PAGE en trypsine geknipt worden uitgevoerd op de massaspectrometer.
- Ontdooien monsters op ijs en eiwitconcentratie te bepalen voor elk monster met de bicinchoninic zuur (BCA) eiwitbepaling.
- Verdun monsters met een bekende concentratie met 5x Laemmli buffer, koken gedurende 10 minuten en bij -20 ° C voor eendimensionale SDS-PAGE. Verdun monsters met een bekende concentratie ureum extractiebuffer en bij -20 ° C voor tweedimensionale gels.
- Run gel keuze laden gelijke hoeveelheid eiwit in elke baan. Eiwit kan worden overgebracht naar een nitrocellulose membraan worden gebruikt voor Western blotting (zoals met controles in stap 4,1) of banden worden gesneden voor massaspectrometrische analyse, zie volgende stappen.
- Verwijder gel van apparatuur met behulp van gedeïoniseerd water over te dragen aan een schone container.Cover gel in Oriole vlek, en wikkel de verpakking in aluminiumfolie om licht te blokkeren. Toestaan gel bij kamertemperatuur op een schudinrichting geïncubeerd ten minste 90 minuten.
- Afbeelding Oriole-gekleurde gel (figuur 3) met behulp van UV-licht, en teken waar bands zullen worden gesneden op de afbeelding. We snijden elke baan in ongeveer 25 2-mm banden voor studies meten van de totale proteoom.
- Plaats gel op een schone ondergrond. Gebruik alleen materialen die zijn gehouden verzegelde of worden bespoten met ethanol om keratine besmetting te voorkomen. Knip de band, en dan verder te snijden in 3 gelijke stukken. Leg alle drie de stukken van elke band in zijn eigen label 1,5 ml buis. Gel stukken kunnen worden opgeslagen bij -20 ° C enkele maanden.
- Bereid gel pluggen voor enzymatische vertering. Digest gel stukken met trypsine bij 37 ° C geroerd. Voor gedetailleerde gelmonster protocol zie onze vorige publicatie. 22 U kunt een laag molecuulgewicht bands verteren met chymotrypsine in plaats van trypsine,uitgebreide splitsing trypsine van histone staarten elimineren.
6. Massaspectrometrie en data-analyse
Monsters worden gescheiden op een LC en geanalyseerd door MS / MS. De spectra worden doorzocht tegen een eiwit database voor eiwitidentificatie.
- Run 10 pi van elk monster door LC / MS / MS. We gebruiken een nano-flow Eskigent LC met een 75 urn omgekeerde fasekolom. Gebruik een LC run geoptimaliseerd voor verschillende eiwitten en peptiden. Gebruik van een lineaire gradiënt van mobiele fase A (0,1% mierenzuur, 2% acetonitril [ACN] in water) mobiele fase B (0,1% mierenzuur, 20% water in ACN): 60 min van 5% mobiele fase B tot 50 % B en 15 min van 50% B tot 95% B en tenslotte 10 min bij een constante 95% B. Gebruik een stroomsnelheid van 200 nl / min. Acquire massaspectrometrie gegevens in een data-afhankelijke functie. We maken gebruik van een Thermo Orbitrap dat de top 6 meest voorkomende ouder ionen fragmenten.
- Herhaal loopt gedurende ten minste drie biologische en twee technische repliceert. (RANBEVOLEN)
- Gebruik software (in de handel beschikbare opties zijn BioWorks en Xcalibur;! Publiekelijk beschikbare opties zijn jacht, X Tandem, SpectraST) om spectra zoeken tegen de Uniprot database van keuze via een zoekalgoritme (zoals Sequest of MASCOT).
- Overwegen om zoekparameters mogelijk te maken cysteïne en methionine carbamidomethylation oxidatie, twee gemeenschappelijke aanpassingen gemaakt tijdens de monster verwerking.
- Bereken een valse meldingen met behulp van omgekeerde database zoeken.
- Filter eiwitidentificaties dat alleen voor wedstrijden van een drempel vertrouwen. Wij adviseren de volgende parameters om mee te beginnen: Xcorr> 3 (+2),> 4 (+3),> 5 (+4); deltaCN> 0,1, consensus score ≥ 20, massa tolerantie 2 Da voor ouder ion, massa tolerantie van 0,5 Da voor ion product ten minste 2 unieke peptiden per eiwit en niet meer dan 3 gemiste splitsingen.
7. Label-free Kwantificering
Determine de relatieve overvloed van eiwitten met label vrije kwantificering (Figuur 4).
- Een aantal software programma's zijn openbaar of commercieel beschikbaar voor label-free kwantificering van massaspectrometrie gegevens, inclusief Census (Prof. Yates 'groep), 23 Elucidator (Microsoft), 24 ZEEF (Thermo Scientific), 25 Steiger (Proteome Software) 26. Deze programma's beogen de massaspectrometrische signaal intact peptiden of het aantal gebeurtenissen met peptidesequentiebepaling relatieve hoeveelheden eiwit tussen twee of meer staten correleren.
- Terwijl elk programma een soortgelijke analyse pijpleiding, worden sommige programma beperkt tot de soorten specifieke analyse die kan worden uitgevoerd op de data. Aanvankelijk gegevens van verschillende runs uitgelijnd wordt signaalintensiteit genormaliseerd en peptide pieken zijn geselecteerd voor analyse.
- De twee meest voorkomende werkwijzen zijn gebaseerd op kwantificering spectrale tellen of LC-MS piekgebied. Overvloedverhoudingen worden berekend veranderingen in overvloed peptide tussen verschillende groepen te bepalen.
- Deze programma's kunnen gekoppeld worden aan proteomische zoekalgoritmen (Mascot, Sequest, X! Tandem) voor kwantificering informatie te correleren met eiwit identificatie.
- Om de nauwkeurigheid en reproduceerbaarheid van de gegevens te garanderen is het belangrijk om zowel biologische (verschillende experimentele monsters) en technische (het uitvoeren van de hetzelfde monster op de massaspectrometer meerdere keren) op te nemen replica van de massa spec gegevens.
- Variatie van peptide in overvloed en tussen experimentele omstandigheden worden beoordeeld door ANOVA en uitgezet via PCA (Figuur 5).
Belangrijke overwegingen voor label-free kwantificatie. Bij het uitvoeren van label-free kwantificatie, moet specifieke aandacht worden besteed aan de consistente monstervoorbereiding, de spijsvertering tijd en LC-MS/MS voorwaarden waarborgen elk monster moeten worden verwerkt en afzonderlijk geanalyseerd. In tegenstelling tot ontmoetteabolic etikettering benaderingen, vergelijkingen in label-free experimenten worden gedaan op de gegevens van verschillende massaspectrometrie loopt (vanwege het ontbreken van etikettering voorkomt de mogelijkheid van het runnen van hen samen), waardoor noodzakelijk hoge reproduceerbaarheid in alle aspecten van het monster analyse (dwz van het monster prep, LC en MS stappen) en het gebruik van hoge massa nauwkeurigheid massaspectrometers.
Om rekening te houden lichte veranderingen in monstervoorbereiding en analyse een bekende standaard worden toegevoegd aan elk monster om te helpen bij normalisatie van data. Bovendien, de meeste software programma's kunt normalisering van de signaal intensiteit (bijvoorbeeld door het aanpassen van voor achtergrondgeluiden of een bekende overvloedige analyt) na data-acquisitie om rekening te houden met verschillen in injectie, ionisatie en fragmentatie. Uitlijningsalgoritmen bestaan in de meeste van de hierboven genoemde software die helpen bij het corrigeren verschillen in peptide elutieprofielen. Het gebruik van biologische en technische repliceert is essentieel in dit soort onderzoek, omdat hiermee statistische analyses om te bevestigen de reproduceerbaarheid en consistentie van alle waargenomen veranderingen in eiwit overvloed.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Figuur 4 benadrukt het nut van deze vorm van relatieve kwantificatie. Getoond in het linker paneel zijn de individuele mono-isotopische peptide pieken (bedekt met verschillende muizen), die zijn aangewezen als behorend tot het eiwit HMGB1 (geïdentificeerd via database). Elke piek in wezen een ionenchromatograaf geëxtraheerd voor de gegeven peptide afkomstig is van een andere muis. De groepen vertegenwoordigen drie verschillende fysiologische toestanden: basale, cardiale hypertrofie en hartfalen, met drie biologische herhalingen voor elke groep. Door integratie van het gebied onder de curve kan een relatieve overvloed worden berekend. In het middelste paneel het gemiddelde van deze abundanties wordt weergegeven. Uit dit type analyse dat de overvloed van HMGB1 eiwit verandert in de loop van de ziekte. Daarentegen de onderste panelen tonen het voorbeeld van histon H4 dat niet verandert met de ziekte. In beide gevallen peptiden afkomstig van dieren van dezelfde phenotypic staat vertonen gelijkaardige elutieprofielen en relatieve rijkdom, het aantonen van de reproduceerbaarheid van de monstervoorbereiding en LC / MS / MS.
De reproduceerbaarheid van deze techniek wordt bevestigd met principale componenten analyse (PCA). Zoals getoond in figuur 5, de toepassing van ANOVA van de totale proteoom resultaten van elk onderzocht dier toont een duidelijke clustering van cardiale fenotype (biologische replicaten) met de kleinste associatie tussen technische repliceert (verschillende massa spec loopt van hetzelfde monster) van hetzelfde dier . Dit biedt vertrouwen dat de overvloed veranderingen die voor afzonderlijke eiwitten van belang inderdaad dat het verschil in de fysiologische toestand.
Even belangrijk als de kwantificering en reproduceerbaarheid van de resultaten is de verhoogde dekking van de nucleaire proteoom ingeschakeld nucleaire subfractionation. Figuur 6 illustreert dat analyse van de gehele kern alleen nog niet onthullen een meerderheid van de nucleaire eiwitten geïdentificeerd bij het combineren van afzonderlijke analyses van de compartimenten (1.048 unieke eiwitten identificeerden over de fracties versus 428 geïdentificeerd uit de intacte kernen). Bovendien is de matige overlap tussen de verschillende fracties toont de biologische relevantie van deze compartimenten afzonderlijk overwegen voor meer inzicht in functie en nucleaire genregulatie. Tenslotte het vermogen specifiek fractioneren zuur geëxtraheerd of detergent geëxtraheerd chromatine verrijkt voor belangrijke chromatine structurele eiwitten zoals histonen, waardoor meer gerichte massaspectrometrische analyses (zoals die welke beogen post-translationele modificaties) op een groep eiwitten zonder waarvoor specifieke antilichamen voor elke variant en isovorm.
94fig1highres.jpg "src =" / files/ftp_upload/4294/4294fig1.jpg "/>
Figuur 1. Stroomdiagram voor karakterisatie van eiwitten in cardiale nucleaire sub compartimenten. Whole muis harten worden gehomogeniseerd en het lysaat verrijkt kernen. Kernen worden gefractioneerd in nucleoplasma, detergent-geëxtraheerde chromatine, en zuur-geëxtraheerde chromatine fracties. Eiwitten uit elke geïsoleerd en gescheiden door eendimensionale SDS-PAGE, en de banden trypsine gedigereerd en geleid door LC / MS / MS. Na zoeken in gegevensbanken, wordt label-free kwantificering gebruikt om overvloed trends te identificeren voor eiwitten in de verschillende fracties.
Figuur 2. Nucleaire fractionering schema. Kernen zijn verrijkt uit ganser harte homogenaat via een sucrose gradiënt. Elke kernen monster kan worden gescheiden in nucleoplasma en wasmiddel-geëxtraheerde fracties of in een acid-geëxtraheerde fractie die verrijkt voor histonen.
Figuur 3. Eendimensionale gel van de verschillende fracties. 20 ug gehele hart lysaat (WHL), intacte kernen (Nuc), nucleoplasma (NUP), detergent geëxtraheerd chromatine (DE) en zuur geëxtraheerde chromatine (AE) fractie uit muizenhart werden uitgevoerd op een eendimensionale SDS-PAGE gel (12% acrylamide) met zuur geëxtraheerde chromatine fractie van HeLa-cellen en gekleurd met Oriole. De verschillende patronen van overvloed totaal proteïne in de verschillende molecuulgewichten toont het bestaan van proteomen unieke voor elk sub compartimenten, waaronder verrijking voor de lagere molecuulgewicht histonen in de detergent geëxtraheerd chromatine die verder verrijkt in het zuur geëxtraheerde fracties . Ook van belang is het aanzienlijk minder complexe aard van de AE-fractie van HeLa cels in vergelijking met die van het hart.
Figuur 4. Relatieve overvloed kwantificering Muizen uit drie verschillende cardiale luidt als volgt:. Basale (blauw) hypertrofie (rood) en het niet (groen) werden verzameld in drievoud en hun eiwit monsters liep in twee technische replicaten met LC / MS / MS. Links afgebeeld zijn monoisotoop pieken voor een specifiek peptide (waarvan de spectra getoond aan de rechterkant). Relatieve overvloed werd berekend door integratie en gemiddeld tussen replicaten van elke verschijningsvorm (middelste paneel) om de relatieve abundantie van de peptide (en eiwit waarvan het kwam) vergelijken de verschillende toestanden van hartfalen. Het bovenste paneel toont een peptide van HMGB1 waarvan abundantie gewijzigd ziekte, terwijl het onderste paneel (Histone H4) niet verandert. Klik hier om een grotere afbeelding te bekijken .
Figuur 5. Principale componenten analyse blijkt reproduceerbaarheid. ANOVA-analyse voor elke muis (3 biologische replicaten / cardiale toestand x 2 technische herhalingen) uitgezet voor peptide-intensiteit (assen) toont het clusteren door de ziekte van de staat (basale in blauw, hypertrofie in het rood, het falen in het groen), die geeft een succesvolle reproduceerbaarheid van de massa spec gegevens en significante fysiologische verschillen tussen de verschillende ziektebeelden.
Figuur 6. Global karakterisering van verschillende nucleaire sub vakken. We 1.048 totaal unieke eiwitten geïdentificeerd in alle 4 fracties. 146 eiwitten werden door alle vier fracties, in vergelijking tot 749 eiwitten geïdentificeerd in het nucleoplasma, 380 in de detergent geëxtraheerd chromatine fractie, 426 in het zuur geëxtraheerde fractie chromatine en 428 in de intacte kernen. De Venn diagram toont de matige overlap in geïdentificeerde eiwitten tussen de fracties nadruk het bestaan van verschillende gebieden in vivo en het vermogen van deze fractionering te isoleren. Daarnaast is de sterk onvolledige karakterisering van de totale nucleaire proteoom worden bereikt door alleen het analyseren van niet-gefractioneerde kernen (oranje) rechtvaardigt verdere fractionering.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Twee methoden voor nucleaire isolatie eerder zijn beoordeeld: 27 men de techniek van Behrens homogeniseren gelyofiliseerd weefsel in een niet-waterig oplosmiddel en de tweede een wijziging waarvan we hier homogeniseren van weefsel in een waterige sucrose / zoutoplossing gevolgd door differentiële of dichtheid-gradiënt centrifugatie.
Subfractionation van de kernen door zure extractie op weefselmonsters is een belangrijk instrument voor het bestuderen van chromatine die is sinds 1960, 28 gebruikt met de originele doel is om histonen te analyseren. Acid-extractie protocollen zijn ontwikkeld voor dit doel te zuiveren kern nucleosomale histonen onderdelen 29 Een beperking van deze eerdere studies is een gebrek aan informatie over de niet-histon-eiwitten vormen, en wijzigen, chromatine,. We hebben deze uitdaging aangenomen met het huidige protocol voor het karakteriseren van verschillende biologische subfracties van de kern en chromatine.Deze benadering, die detergensextractie of zure extractie van chromatine gebruikt in parallel, onthult de diversiteit van chromatine regulerende moleculen en maakt onderscheid tussen niveaus van endogeen regulering, waarbij die als krachtige aanpak hypothese generatie.
Het toepassen van de gevestigde zuur-extractie methode om de volwassen myocyte stelt bepaalde obstakels waaronder de dichte cytoskelet en grote mitochondriale bevolking. Hoewel versies van zuur-extractie werden gebruikt geheel hartweefsel 30 experimenten werden uitgevoerd in een doelgericht bekende eiwitten te bestuderen, het huidige protocol is ontworpen en uitgevoerd is onbevooroordeelde proteoomanalyse toestaat. Daarnaast vonden we het nuttig om te onderzoeken het wasmiddel-geëxtraheerd en zuur geëxtraheerde chromatine afzonderlijk (slechts 37% overlap werd waargenomen tussen de proteomen van deze twee fracties) om beter inzicht in de dynamiek waardoor deze populaties van chromatine-eiwitten interact met DNA. Andere protocollen met ureum gebaseerde buffers zijn ook beschreven, 31,32 die uitgevoerd voordat zuurextractie, verrijken eiwitten minder stevig gebonden aan het genoom. Naast chromatine fracties anderen subfractionated de kern naar het isoleren nucleolus, 33 maar subfractionation voor massaspectrometrische analyse van myocardiale kernen geïsoleerd van gehele hart is niet gemeld.
Shotgun proteomische studies on intacte kernen, dat wil zeggen ongefractioneerde organellen-uitgevoerd op myocardiale weefsel met een MudPIT benadering. 15 Deze studie werden 1.044 nucleaire eiwitten hart, op dezelfde schaal als ons protocol, maar ze aangevoerd met een gemiddeld 8,5 repliceert, bij elke ronde duurt 20 uur met lage overvloed eiwitten te detecteren. In tegenstelling gebruikten we subfractionation, zowel toename van het aantal identificeerbare eiwitten (zonder lange chromatografie onze LC runs zijn 85 min) terwijl importantly ook het aanbieden van aanvullende biologische gegevens over de sub-nucleaire lokalisatie en relatieve rijkdom van de eiwitten.
Van een geheel muizenhart (ongeveer 0,14 g) we terug ongeveer 1,2 mg (0,85% van totaal) eiwit in de intacte kernen. Van de intacte kernen bereiken we de volgende herstel voor elk van de subfracties (Opmerking: de totale waarde meer dan 100% als zuur-extractie en detergent-extractie worden gedaan op aparte harten, niet in serie): nucleoplasma (15%), wasmiddel- geëxtraheerd chromatine (85%) en zuur geëxtraheerde chromatine (54%). Ter vergelijking Thermo Scientific een kit (NE-PER nucleaire en cytoplasmatische reagentia) waarin opbrengsten 1,6 mg cytosolische proteïne en 0,6 mg nucleair eiwit (1,5%) de productbeschrijving zegt van 40 mg muizenhart met 10% kruisbesmetting tussen de twee fracties. Sigma heeft een kit (NXTRACT, CellLytic nucleaire Extraction Kit) die zij hebben getest op konijnen spieren, maar niet het hart, en hersteld van 100 mg weefsel 0,46 mg van nucleaire eiwit (0,46%) in wat zij hun "primitief nucleair pellet" noemen met een "paar procent" van de cytoplasmatische besmetting. Andere bedrijven, zoals Epigentek ook kits aan te bieden, maar we waren niet in staat om specifieke details over de verrijking en zuiverheid op hun websites voor de vergelijking te vinden.
Wij hebben er een nieuwe techniek richt de huidige behoefte succesvolle verrijking van cardiale kernen voor proteomische studies. We beschrijven verdere methode voor sub compartiment fractionering; verhoogt de mogelijkheid om minder overvloedige eiwitten en zorgt voor hogere resolutie, kwantificering en bepaling van lokalisatie eiwit detecteren. Daartoe het protocol voor massaspectrometrie analyse biedt aanbevolen richtlijnen echter geval per geval overwegingen zal waarschijnlijk nodig zijn. Zo vonden we dat het grote aantal cardiale histone variant isovormen met sequentieovereenkomst vereiste handmatige inspectie van de spectra te ma toewijzenJor pieken en bevestigen ouder ion mass voordat ze in staat om vol vertrouwen toe te wijzen van de spectra. 14 Zoek parameters kunnen ook worden aangepast voor post-translationele modificatie (PTM) identificatie en uitstekende recensies aanwezig detaillering methoden en zorgen met interpretatie van gegevens voor PTM analyse (inclusief PTM verrijking , 34 software voor PTMs, 35 analyse van combinatorische PTMs, 36 alternatieve fragmentatie strategieën 37 en alternatieve vertering en verwerking 38,39).
De verrijking en fractionering beschreven is van het gehele hart (dat 50-70% cardiomyocyte gewichtsprocent). Hoewel deze aspecten van offers celspecificiteit die vooral belangrijk voor bepaalde families van nucleaire eiwitten, het zorgt voor een veel snellere schorsing van de eiwitten in de juiste buffers, wat niet mogelijk is met volwassen myocyten celisolatie protocollen. Op deze manier behoudt deze methode beter de integriteit of het monster tegen afbraak. Echter, ook beschreven zijn instructies voor de toepassing van dit protocol om geïsoleerde neonatale rat ventriculaire myocyten, aangezien beide geïsoleerde cellen en hele organisme modellen zijn de benodigde instrumenten voor het bestuderen van hartfalen. In principe kan deze methode ook worden toegepast op volwassen myocyten geëxtraheerd enzymdigestie van geïsoleerde harten-met het voorbehoud dat veranderingen in eiwitbinding die tijdens de isolatie (die zich over een uur) wordt interpretatie van de proteomische opmerkingen verwarren.
We hebben deze methode om de wijzigingen in de nucleaire chromatine proteoom en make-up die bijdragen aan de ziekte begrijpen. Maar 14 andere toepassingen omvatten het bestuderen stimulus-specifieke veranderingen in proteoom samenstelling normale fysiologie. Bovendien sub-fractionering biedt de mogelijkheid voor een nieuw niveau van karakterisering van hoe de eiwitten functioneren en lokaliseren in verschillende functionele gebieden van de kern.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Geen belangenconflicten verklaard.
Acknowledgments
De Vondriska lab wordt ondersteund door subsidies van de National Heart, Lung and Blood Institute van de NIH en de Laubisch Endowment aan de UCLA. EM is ontvanger van de Jennifer S. Buchwald Graduate Fellowship voor de Fysiologie aan de UCLA, HC is de ontvanger van een American Heart Association Pre-doctorale beurs, MP is de ontvanger van een NIH Ruth Kirschstein post-doctorale beurs, en SF is de ontvanger van een NIH K99 Award.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dulbeco Modified Eagle Medium | Invitrogen | 11965 | |
| Protease pellet | Roche | 04 693 159 001 | |
| 100 μm strainer | BD Falcon | 352360 | |
| Ultracut ultramicrotome | Reichert | ||
| 100CX Transmission Electron Microscope |
JEOL USA, Inc. | ||
| Oriole | BioRad | 161-0496 | |
| Histone H2A antibody | Santa Cruz | sc-8648 | |
| Nucleoporin p62 antibody | BD Biosciences | 610498 | |
| Adenine nucleotide transporter antibody | Santa Cruz | sc-9299 | |
| BiP antibody | Santa Cruz | sc-1050 | |
| Tubulin antibody | Sigma | T1568 | |
| Histone H3 antibody | Abcam | ab1791 | |
| Fibrillarin antibody | Cell Signaling | C12C3 | |
| SNRP70 antibody | Abcam | ab51266 | |
| E2F-1 antibody | Thermo Fisher | MS-879 | |
| Retinoblastoma antibody | BD Biosciences | 554136 | |
| Hypoxia inducible factor-1 antibody | Novus Biologicals | NB100-469 | |
| BCA protein assay | Thermo Scientific | 23227 | |
| Reverse phase column | New Objective | PFC7515-B14-10 | |
| BioWorks Browser | Thermo Scientific |
References
- Li, F., Wang, X., Capasso, J. M., Gerdes, A. M. Rapid transition of cardiac myocytes from hyperplasia to hypertrophy during postnatal development. J Mol Cell Cardiol. 28, 1737-1746 (1996).
- Rumyantsev, P. P. Interrelations of the proliferation and differentiation processes during cardiact myogenesis and regeneration. Int Rev. Cytol. 51, 186-273 (1977).
- Olson, E. N., Schneider, M. D. Sizing up the heart: development redux in disease. Genes Dev. 17, 1937-1956 (2003).
- Molkentin, J. D., Dorn, G. W. 2nd Cytoplasmic signaling pathways that regulate cardiac hypertrophy. Annu Rev. Physiol. 63, 391-426 (2001).
- Fishman, M. C., Chien, K. R. Fashioning the vertebrate heart: earliest embryonic decisions. Development. 124, 2099-2117 (1997).
- Rajabi, M., Kassiotis, C., Razeghi, P., Taegtmeyer, H. Return to the fetal gene program protects the stressed heart: a strong hypothesis. Heart Fail Rev. 12, 331-343 (2007).
- Roger, V. L., et al. Heart disease and stroke statistics--2011 update: a report from the American Heart Association. Circulation. 123, e18-e209 (2011).
- Schirmer, E. C., Florens, L., Guan, T., Yates, J. R. 3rd, Gerace, L. Nuclear membrane proteins with potential disease links found by subtractive proteomics. Science. 301, 1380-1382 (2003).
- Lambert, J. P., Mitchell, L., Rudner, A., Baetz, K., Figeys, D. A novel proteomics approach for the discovery of chromatin-associated protein networks. Mol. Cell Proteomics. 8, 870-882 (2009).
- Malik, P., et al. Cell-specific and lamin-dependent targeting of novel transmembrane proteins in the nuclear envelope. Cell Mol Life Sci. 67, 1353-1369 (2010).
- Tweedie-Cullen, R. Y., Reck, J. M., Mansuy, I. M. Comprehensive mapping of post-translational modifications on synaptic, nuclear, and histone proteins in the adult mouse brain. J. Proteome Res. 8, 4966-4982 (2009).
- Chu, D. S., et al. Sperm chromatin proteomics identifies evolutionarily conserved fertility factors. Nature. 443, 101-105 (2006).
- Uchiyama, S., et al. Proteome analysis of human metaphase chromosomes. J. Biol. Chem. 280, 16994-17004 (2005).
- Franklin, S., et al. Specialized compartments of cardiac nuclei exhibit distinct proteomic anatomy. Mol. Cell Proteomics. 10, (2011).
- Kislinger, T., et al. Global survey of organ and organelle protein expression in mouse: combined proteomic and transcriptomic profiling. Cell. 125, 173-186 (2006).
- Moore, D. H., Ruska, H. Electron microscope study of mammalian cardiac muscle cells. J. Biophys Biochem. Cytol. 3, 261-268 (1957).
- Anversa, P., Vitali-Mazza, L., Visioli, O., Marchetti, G. Experimental cardiac hypertrophy: a quantitative ultrastructural study in the compensatory stage. J. Mol. Cell Cardiol. 3, 213-227 (1971).
- Franklin, S., et al. Specialized compartments of cardiac nuclei exhibit distinct proteomic anatomy. Mol Cell. Proteomics. 10, (2011).
- Paulsson, A. K., et al. Post-translational regulation of calsarcin-1 during pressure overload-induced cardiac hypertrophy. Journal of molecular and cellular cardiology. 48, 1206-1214 (2010).
- Franklin, S., et al. Quantitative analysis of the chromatin proteome in disease reveals remodeling principles and identifies high mobility group protein b2 as a regulator of hypertrophic growth. Mol Cell Proteomics. 11, (2012).
- Gramolini, A. O., et al. Comparative proteomics profiling of a phospholamban mutant mouse model of dilated cardiomyopathy reveals progressive intracellular stress responses. Mol Cell Proteomics. 7, 519-533 (2008).
- Singh, H., Warburton, S., Vondriska, T. M., Khakh, B. S. Proteomics to Identify Proteins Interacting with P2X2 Ligand-Gated Cation Channels. J. Vis. Exp. (27), e1178 (2009).
- Park, S. K., Venable, J. D., Xu, T., Yates, J. R. 3rd A quantitative analysis software tool for mass spectrometry-based proteomics. Nat. Methods. 5, 319-322 (2008).
- Lomenick, B., et al. Target identification using drug affinity responsive target stability (DARTS). Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 106, 21984-21989 (2009).
- Kamleh, A., et al. Metabolomic profiling using Orbitrap Fourier transform mass spectrometry with hydrophilic interaction chromatography: a method with wide applicability to analysis of biomolecules. Rapid Commun. Mass Spectrom. 22, 1912-1918 (2008).
- Searle, B. C. Scaffold: a bioinformatic tool for validating MS/MS-based proteomic studies. Proteomics. 10, 1265-1269 (2010).
- Murray, K. The Basic Proteins of Cell Nuclei. Annu Rev. Biochem. 34, 209-246 (1965).
- Johns, E. W., Phillips, D. M., Simson, P., Butler, J. A. Improved fractionations of arginine-rich histones from calf thymus. Biochem. J. 77, 631-636 (1960).
- Rodriguez-Collazo, P., Leuba, S. H., Zlatanova, J. Robust methods for purification of histones from cultured mammalian cells with the preservation of their native modifications. Nucleic Acids Res. 37, e81 (2009).
- Kuehl, L., Salmond, B., Tran, L. Concentrations of high-mobility-group proteins in the nucleus and cytoplasm of several rat tissues. J. Cell Biol. 99, 648-654 (1984).
- Gronow, M., Griffiths, G. Rapid isolation and separation of the non-histone proteins of rat liver nuclei. FEBS Lett. 15, 340-344 (1971).
- Mischke, B. G., Ward, O. G. Isolation and tissue specificity of chromatin-associated proteins in Vicia faba. Can J. Biochem. 53, 91-95 (1975).
- Andersen, J. S., et al. Directed proteomic analysis of the human nucleolus. Curr. Biol. 12, 1-11 (2002).
- Zhao, Y., Jensen, O. N. Modification-specific proteomics: strategies for characterization of post-translational modifications using enrichment techniques. Proteomics. 9, 4632-4641 (2009).
- Ahrne, E., Muller, M., Lisacek, F. Unrestricted identification of modified proteins using MS/MS. Proteomics. 10, 671-686 (2010).
- Young, N. L., Plazas-Mayorca, M. D., Garcia, B. A. Systems-wide proteomic characterization of combinatorial post-translational modification patterns. Expert Rev. Proteomics. 7, 79-92 (2010).
- Guthals, A., Bandeira, N. Peptide identification by tandem mass spectrometry with alternate fragmentation modes. Mol. Cell Proteomics. , (2012).
- Wu, C., et al. A protease for 'middle-down' proteomics. Nat. Methods. , (2012).
- Tran, J. C., et al. Mapping intact protein isoforms in discovery mode using top-down proteomics. Nature. 480, 254-258 (2011).
