Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Medicine
Click here for the English version

Medicine

ניתוח הכמות של Proteomes הכרומטין במחלות

Published: December 28, 2012 doi: 10.3791/4294
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1,2,3, 1,4
1Department of Anesthesiology, David Geffen School of Medicine at UCLA, 2Department of Medicine, David Geffen School of Medicine at UCLA, 3Department of Physiology, David Geffen School of Medicine at UCLA, 4Department of Internal Medicine, Nora Eccles Harrison Cardiovascular Research and Training Institute, University of Utah

Summary

התקדמות בספקטרומטריית מסות אפשרה ניתוח התפוקה הגבוהה של ביטוי חלבון ושינוי בשורה של רקמות. בשילוב עם חלוקת subcellular ומודלי מחלות, מסה כמותית ספקטרומטריית וביואינפורמטיקה יכולות לחשוף נכסים חדשים במערכות ביולוגיות. השיטה המתוארת כאן מנתחת חלבוני הכרומטין הקשורים בהגדרה של מחלות לב, והוא בקלות ישימה אחרים

Abstract

בגרעין מתגורר בproteomes שהתפקיד קשור באופן אינטימי ביותר עם רגולציה של גנים. גרעיני cardiomyocyte יונקי בוגרים הם ייחודיים בשל אחוז הגבוה של תאי binucleated, 1 המדינה בעיקר heterochromatic של ה-DNA, והאופי שאינו מפריד-של cardiomyocyte שהופך גרעינים בוגרים במצב קבוע של interphase. בקרת שעתוק 2 במהלך פיתוח ו מחלה נחקרה היטב באיבר זה, אבל מה שנשאר 3-5 נחקר יחסית היא התפקיד שמלא את החלבונים האחראים על אריזת DNA וביטוי הגרעיניים, וכיצד החלבונים הללו לשלוט שינויים בתוכניות תעתיק המתרחשים במהלך מחלה. 6 בפתחו עולם, מחלות לב היא סיבת מספר אחת לתמותה עבור גברים ונשים כאחד. 7 תובנה על איך חלבונים גרעיניים ישתפו פעולה על מנת להסדיר את ההתקדמות של מחלה זו היא קריטי לקידום הטיפול o הנוכחיתptions.

ספקטרומטריית מסה היא הכלי האידיאלי לטיפול בשאלות אלו שכן היא מאפשרת ליאור משוחד של כימות וProteome היחסי הגרעינית לכיצד השפע של חלבונים אלו שינויים עם מחלה. אמנם יש כבר כמה מחקרי proteomic למתחמי יונקים גרעיניים חלבונים, 8-13 עד לאחרונה 14 חלו רק מחקר אחד בודק Proteome הגרעיני הלב, והוא התייחס לכל הגרעין, במקום לחקור Proteome ברמה של תת מדורים גרעיניים 15. במידה רבה, מחסור זה בעבודה נובע מהקושי של בידוד גרעיני לב. גרעיני לב מתרחשים בתוך מנגנון יקטין מיוזין נוקשה וצפוף שאליו הם מחוברים באמצעות הרחבות מרובות מreticulum endoplasmic, במידה שמשנה את התכווצות myocyte הצורה הכללית שלהם. 16 בנוסף, cardiomyocytes הם 40% לפי נפח 17 המיטוכונדריה שnecessitaTES העשרת הגרעין מלבד האברונים האחרים. כאן אנו מתארים פרוטוקול להעשרה גרעינית לב וחלוקה נוספת לתאים ביולוגיים רלוונטיים-. יתר על כן, שיטות פירוט נתיחת תווית חינם כמותית המונית spectrometric של שברי טכניקות המתאימים לניסויים בגוף חיים במודלים שונים של בעלי חיים ומערכות איברים בי תיוג מטבולית הוא לא ריאלי אלה.

Protocol

העבודה הניסויית מכילה שבעה שלבים עיקריים (איור 1). לכל עבודה שיש בי דגימות שתהיה לרוץ על ספקטרומטר המסות, הנסיין צריך ללבוש חלוק מעבדה, כפפות ורשת לשיער ולטפל כדי למנוע זיהום מאבק ושפיכות אישיות של קרטין.

1. Homogenization לב ובידוד גרעיני

לבבות של העכבר homogenized וגרעיני גלולה ללא פגע מבודד (איור 2).

  1. להקריב את העכבר בוגר, בלו הלב, יש לשטוף בPBS קר כקרח, והומוגני על קרח בdounce זכוכית (אנחנו מעדיפים מטחנות ויטון רקמות מפישר, # 08-414-13A, אבל שיטות אחרות יכולות לעבוד היטב באותה מידה) המכיל 2 מ"ל של חיץ תמוגה (פתרון hypotonic שדיפרנציאלי lyses קרום התא על אברונים כולל הגרעין) (10 mM טריס pH 7.5, 15 המ"מ NaCl, ו0.15% v / v Nonidet P-40 [NP-40] במים בתוספת deionized פרוטאז ופוספטאזתערובת nhibitor: 10 בוטיראט נתרן מ"מ, 0.1 פלואוריד phenylmethylsulfonyl מ"מ [PMSF], 0.2 mM Na 3 VO 4, 0.1 המ"מ NAF ו1 הרוש פרוטאז pellet/10 מ"ל - חיץ תמוגה ניתן לאחסן לתקופה של עד שבוע אחד ב -20 ° C ). (הערה: אין אנו מוצאים לנכון אנקב את הלב עם PBS, כנתוני ספקטרומטריית המסה שלנו וללכת ניתוח לזהות את החלבונים כברובה cardiomyocyte [p-value 3.8E-22] במקור בניגוד לזיהום דם [עמ שווי 5.0 E-2]).
  2. יוצק lysate דרך מסננת מיקרומטר 100 ולאסוף לזרום בצינור צנטריפוגה מ"ל 1.5. בשלב זה, אלא אם צוין, מדגם צריך להיות כל זמן על קרח.
  3. צנטריפוגה בסל"ד 4000 למשך 5 דקות ב 4 ° C.
  4. הסרת supernatant. (זה cytosol, וצריך להיות מאוחסן ב-80 ° C. זה מכיל את המיטוכונדריה lysed.) Resuspend גלולה במאגר תמוגה μl 200 ידי triturating. (זה גולמי הגרעיני הגלולה.)
  5. מלא צינור צנטריפוגה מ"ל 1.5 עם 1 מ"ל של חובב סוכרוזאה (24% סוכרוז משקל / נפח, 10 המ"מימ טריס pH 7.5, ו15 מ"מ NaCl במי deionized עם פרוטאז / תערובת מעכב phosphatase - חיץ סוכרוז צריך להיעשות טרי ביום שימוש). בעדינות שכבת גלולת resuspended על גבי משטח סוכרוז וצנטריפוגה בסל"ד 5000 עבור 10 דקות ב 4 ° C.
  6. הסר את השכבה הדקה על גבי, כמו גם את כרית סוכרוז (המכיל קרום). שטוף את הכדור שנותר עם 200 PBS μl קר כקרח / EDTA (1x PBS עם mM EDTA 1). (זה גרעיני הגלולה וניתן solubilized או קבוע לשימוש במיקרוסקופ אלקטרונים או סופג מערבי [ראה צעדים 4.1 ו 4.2] לכמת העשרה.)

2. Nucleoplasm והיפוך חלוק דטרגנט-חולץ הכרומטין

גרעיני הגלולה הגולמית מופרדת לnucleoplasm ושבריר דטרגנט-חולץ הכרומטין, המכילה חלבונים הקשורים באופן רופף עם ה-DNA.

  1. Triturate גלולה מצעד 1.6 במאגר 200 μl דטרגנט חילוץ (20 המ"מ HEPES pH 7.6, 7.5 מ"מ MgCl 2. 0.2 המ"מ EDTA, 30 mM NaCl, 1 ז אוריאה, 1% NP-40 במי deionized עם פרוטאז / תערובת מעכב phosphatase - חיץ מיצוי חומר ניקוי ניתן לאחסן לתקופה של עד שבוע אחד ב -20 ° C).
  2. דוגמא 2 פעמים ורטקס, 10 שניות כל אחת. מניח על קרח 10 דקות.
  3. צנטריפוגה בסל"ד 13000 למשך 5 דקות ב 4 ° C.
  4. הסרת supernatant. (זה nucleoplasm וצריך להיות מאוחסן ב-80 ° C). יש לשטוף עם גלולה קרה כקרח PBS / EDTA. (זה הכרומטין הגלולה.)
  5. Triturate גלול ב 300 טריס μl, SDS, EDTA חיץ (50 mM טריס pH 7.4, 10 mM EDTA, 1% SDS במי deionized עם פרוטאז / תערובת מעכב phosphatase - טריס, SDS, EDTA חיץ אפשר לשמור עד שבוע ב -20 ° C).
  6. Sonicate 3-6 פעמים לכל 10 שניות כדי לשבור את ה-DNA. שמור מדגם על קרח בין sonications.
  7. צנטריפוגה בסל"ד 13000 למשך 5 דקות ב 4 ° C. שמור את supernatant. (Supernatant הוא חלבון הכרומטין fractio דטרגנט-חולץצריך להיות כל זמן ובn -80 ° C). הגלולה שנותרה צריכה להיות קטנה ויכולה להיות מושלכת.
  8. אם אתם משתמשים בmyocytes הבודד במקום כל הלב: מבודד myocytes חדרית עכברוש בילוד מגורי חולדות יום אחד לאחר לידה באמצעות עיכול אנזימטי, ואחריו בתרבות Dulbecco modified נשר בינוני (DMEM) עם 10% בסרום שור עוברי (FBS), אינסולין 1% סלניום-transferrin-נתרן (ITS), ו 1% פניצילין. לאחר 24 שעות, להעביר לתקשורת סרום חינם (כנ"ל, אבל חסר FBS). תאי קציר בחיץ תמוגה (המופיע ב1.1), ולהתחיל חלוקה גרעינית בשלב 1.3.

3. היפוך חלוק חומצת חילוץ - DNA בכריכת העשרת חלבון

A מעשיר נפרד חלוקה לחלבונים הדוק ל-DNA, כוללים ההיסטונים.

  1. חזור על שלבים 1.1-2.4.
  2. Triturate הכרומטין גלול ב 400 μl של חומצה גופרתית N 0.4. מערבולת להסיר גושים.
  3. לדגור על 4 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות או overnight תוך סיבוב.
  4. צנטריפוגה ב XG 16000 עבור 10 דקות ב 4 ° C כדי להסיר פסולת גרעינית.
  5. העברת supernatant לצינור טרי.
  6. הוסף 132 μl של חומצת Trichloroacetic הנפתחת חכמה supernatant. הפוך כמה פעמים. לדגור על קרח למשך 30 דקות.
  7. צנטריפוגה ב XG 16000 עבור 10 דקות ב 4 ° C.
  8. בטל supernatant. לשטוף בעדינות עם אצטון גלולה קר כקרח. (זו גלולת היסטון.)
  9. צנטריפוגה ב XG 16000 עבור 10 דקות ב 4 ° C.
  10. חזור על לשטוף, צעדים 3.8-3.9.
  11. אוויר יבש גלול.
  12. Resuspend גלול ב 100 μl של טריס, SDS, EDTA חיץ. הגדר pH עד 8 על ידי הוספת 1 M טריס. (השתמש במניות 1 ז טריס, שאינה מותאם לרמת חומציות).
  13. Sonicate באמבט מים במשך 15 דקות. למנוע התחממות יתר על ידי הוספת קרח למי אמבט. (זה אותו שבריר חומצת חילוץ וצריך להיות מאוחסן ב-80 מעלות צלזיוס)

4. בדיקת טוהר

כתמים מערביים וכן במיקרוסקופ אלקטרוניםלאשר העשרה מוצלחת של גרעינים ודלדול של אברונים אחרים. כדי לצפות בתוצאות אופייניות לכל מבחני בקרת האיכות הבאות, ראו הפרסום הקודם שלנו. 18

  1. ביצוע ניתוח כתם מערבי. קרום חללית המכיל כל שבריר לH2A היסטון או nucleoporin p62 (כסמנים גרעיניים כדי לוודא העשרה), ולטרנספורטר אדנין נוקלאוטיד, ביפ וטובולין (כסמן של המיטוכונדריה, סמן endoplasmic reticulum, וסמן cytoskeletal בהתאמה לאמת טהרה). כדי לוודא subfractionation המוצלח של הגרעינים, החללית לH3 היסטון או fibrillarin (חומרי ניקוי וגרעיני הכרומטין ושלמים חומצת חילוץ) וSNRP70 או E2F (nucleoplasm). חללית לרטינובלסטומה או מושרה היפוקסיה גורם-1 (מועשר באבקת הכרומטין-חולץ על שבריר חומצת חילוץ). דגימות בקרה נוספות של lysate תא הלה וlysate לב השלם גם ניתן להפעיל באותו הג'ל: הכן את שליטת lysate תא הלה על ידי הוספת טריס, SDS, EDחיץ ת"א למנת התרבות ובאמצעות מגרד תא כדי לאסוף דגימה. Sonicate וסרכזת מדגם כמו בשלבים 2.6-2.7. הכן שליטת lysate לב שלמה על ידי שמאחד את הלב בחיץ 2 מ"ל (20 mM טריס pH 7.4, 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1 mM EGTA, 1% Triton X-100, pyrophosphate נתרן 2.5 מ"מ, glycerophosphate 1 מ"מ במי deionized עם פרוטאז ותערובת מעכב phosphatase). Sonicate וסרכזת כמו בשלבים 2.6-2.7. ראה שלב 5 להכנת דגימות חלבון לSDS-PAGE.
  2. מיקרוסקופי אלקטרונים: Resuspend גרעיני הגלולה מ -1.6 צעד במאגר המכילים תמוגה gluteraldehyde 2% ולתקן מדגם ב 4 ° C. יש לשטוף את דגימות בחומצת osmic, לייבש, ולהטביע בשרף אפוקסי. חותך 70 פרוסות ננומטר באמצעות רייכרט Ultracut ultramicrotome. כתם דגימות בתצטטנה uranyl ולאחר מכן להוביל ותמונה באמצעות מיקרוסקופ אלקטרוני JEOL 100CX הילוכים. לכמת העשרה על ידי מדידת השטח של גרעינים שלמים לעומת שטח כולל של חומר הדמיה. אנו מוצאים 60-80% מגרעינים ללהיות שלם 14.

שיקולים חשובים עבור העשרה לעומת טיהור גרעינים. פרוטוקול זה פותח כדי לאפשר מנתח proteomic של הכרומטין לב לצורך לימוד תהליכי ויסות גני העולם במהלך מחלה. מרכיב עיקרי בעיצוב ניסויי ספקטרומטריית מסה שלם Proteome הוא הבעיה של טווח דינמי ויכולת לזהות ולאפיין חלבונים נמוכי שפע. בנוסף למטרה העיקרית של מתן מידע על ביולוגיה גרעינית והכרומטין ספציפי, המעשיר את Proteome הגרעיני, מגביר את הסבירות לזיהוי חלבונים נמוכי שפע אלה, כפי שעושה subfractionation הנוסף של הגרעינים. עם זאת, כפי שראה, cardiomyocyte המבוגר יש מרכיב cytoskeletal צפוף מחובר לקרום הגרעין. אנחנו לא מאמינים שיש לנו מטוהרי גרעינים ממרכיבים תאיים אחרים אלה לחלוטין. עם זאת, על ידי העשרה רק לגרעינים, יש לנו להשיגעורך סף מקובל כדי לאפשר את סוגי ניתוחים שתואר.

באופן ספציפי, יש לנו להשתמש EM להעריך את הטוהר של גרעיני הגלולה הגולמית שלנו ומצאתי 60-80% מהשבריר להיות גרעינים שלמים, בערך 10% מיטוכונדריה, ופסולת השאר. בנוסף, אנו יודעים מהמחקר הקודם שלנו על אוכלוסיית הגרעינים השלמות, כי בעוד myofilaments רב אינו מועשר בפרוטוקול זה (לרבות טובולין ויקטין כפי שנמדד על ידי מערב) חלבונים מסוימים (calsarcin-1) מעשירים, מה שמרמז אוכלוסייה ביולוגית אמיתית של חלבונים אלה בלב. הגרעינים 19

בנוסף, השוו את החלבונים שנמצאנו להיות נוכח בשבריר הכרומטין חומצת החילוץ, לתפקידים החזויים של חלבונים אלו על ידי אונטולוגיה גן. חשוב מכך, ניתוח אונטולוגיה גן זה אינו לוקח בחשבון את השפע היחסי של חלבונים השונים (כמו גם נתוני הכתם המערביים שלנו), אלא סופר את כל החלבונים שזוהו (להעשיראד או לא) כשווה בעת זיהוי מסלולים נפוצים ותאים סלולריים. ניתוח של המסלולים האלה ותאים סלולריים ניתן למצוא בפרסומים הקודמים שלנו. 18,20 והכי חשוב, ההצלחה של ההעשרה בשבריר הכרומטין חומצה חולץ אפשרה לנו לזהות את נוכחותם של 54 גרסות היסטון בmyocyte העכבר המבוגר, 18 רבים מהם הסתמכו על פפטיד ייחודי אחד לזיהוי, ולכן הייתי סיכוי לא היה לגלות אותו בלי פרוטוקול העשרה זה בהתחשב במורכבות העצומה של Proteome cardiomyocyte המוחלט. של 1048 חלבונים שזוהינו מגרעיני הלב, 56 מתוכם (5.3%) היו מבוארים על ידי GO ניתוח להיות חלק מהנוקלאוזום (מרכיב אחד של הגרעין של עניין). מחקר נוסף שמסתכל על כל הלב, זיהה 6,180 חלבונים, מתוכם רק 11 חלבונים (0.18%) היו מבוארים להיות חלק מ21 נוקלאוזום. עוד הדבר זה ממחיש את כוחו של הפרוטוקול שלנו לmeaningfully להעשיר לחלבונים גרעיניים.

5. ג'ל חלבון והחלבון דייג'סט אנזימתי

חלבונים מופרדים על ידי אחד ממדים SDS-PAGE וטריפסין מתעכל שיופעל בספקטרומטר המסה.

  1. הפשר דגימות על קרח ולקבוע ריכוז חלבון לכל דגימה באמצעות חומצת bicinchoninic (BCA) assay חלבון.
  2. לדלל דגימות לריכוז ידוע באמצעות חיץ Laemmli 5x, להרתיח במשך 10 דקות וחנות ב -20 ° C לSDS-PAGE חד ממדי. לדלל דגימות לריכוז ידוע באמצעות חיץ וחנות חילוץ אוריאה ב -20 ° C לג'לים דו ממדים.
  3. הפעל ג'ל של בחירת העמסת כמות זהה של חלבון בכל מסלולים. חלבון יכול להיות מועבר לממברנת ניטרוצלולוזה לשמש למערב סופג (כמו עם פקדים בשלב 4.1) או להקות ניתן לחתוך לניתוח ספקטרומטריית מסות, ראה שלבים הבאים.
  4. הסרת הג'ל ממכשיר באמצעות מי deionized להעבירו למכל נקי.כיסוי ג'ל בזהבן כתם, ומכל לעטוף ברדיד אלומיניום כדי לחסום את האור. אפשר ג'ל לדגירה בטמפרטורת חדר שבייקר ללפחות 90 דקות.
  5. ג'ל התמונה זהבן המוכתם (איור 3) באמצעות אור UV, וסימן שבו תהיינה מנותקות להקות בתמונה. אנחנו חותכים כל נתיב לכ 25 להקות 2-מ"מ ללימודי מדידת Proteome המוחלט.
  6. הנח ג'ל על משטח נקי. השתמש רק בחומרים שנשמרו אטום או רוססו באתנול על מנת למנוע זיהום קרטין. חותך את כל להקה, ואז עוד יותר לפרוס אותו לתוך 3 חתיכות שווות. מקם את כל השלוש החתיכות של כל להקה ביחד לצינור משלו שכותרתו 1.5 מ"ל. חתיכות ג'ל ניתן לאחסן ב -20 ° C למשך מספר חודשים.
  7. הכן את אטמי ג'ל לעיכול אנזימטי. חתיכות ג'ל Digest באמצעות טריפסין על 37 מעלות צלזיוס למשך הלילה. לפרוטוקול מדגם ג'ל מפורט בפרסום הקודם שלנו. אתה יכול לעכל 22 להקות משקל מולקולריות נמוכות עם chymotrypsin במקום טריפסין,לחסל המחשוף הרחב של טריפסין של זנבות היסטון.

6. ספקטרוסקופיית מסות וניתוח נתונים

דוגמאות מופרדות בLC ונותחו על ידי MS / MS. הספקטרומים חפשו מול מסד נתוני חלבון לזיהוי חלבון.

  1. הפעלת 10 μl של כל דגימה באמצעות LC / MS / MS. אנו משתמשים בננו זרימת Eskigent LC עם עמודת שלב 75 מיקרומטר הפוכה. השתמש בטווח LC המותאם למגוון רחב של חלבונים ופפטידים. מעסיק שיפוע ליניארי משלב נייד (0.1% חומצה פורמית, 2% אצטוניטריל [ACN] במים) לסלולרי שלב ב '(0.1% חומצה פורמית, מי 20% בACN): 60 דקות משלב ב' נייד 5% עד 50 B%, ולאחר מכן 15 דקות מ-B ל-B 50% 95% ולבסוף 10 דקות ב קבוע 95% ב 'השתמש בקצב זרימה של 200 nl / דקה. להשיג נתוני ספקטרומטריית מסה במצב נתונים תלויים. אנו משתמשים Orbitrap Thermo שברים את 6 יונים ההוריים הנפוצים ביותר העליונים.
  2. חזור פועל במשך לפחות שלוש ביולוגיים ושתי טכניים משכפלים. (Recommended)
  3. השתמש בתוכנה (אפשרויות זמינות מסחרי כוללות BioWorks וXcalibur;! אפשרויות בפומבי זמינות כוללות טרף, X טנדם, SpectraST) כדי לחפש ספקטרום מול מסד נתוני Uniprot של בחירה באמצעות אלגוריתם חיפוש (כגון SEQUEST או קמע).
  4. שקול שינוי פרמטרי חיפוש, כדי לאפשר carbamidomethylation ציסטאין ומתיונין חמצון, שני שינויים נפוצים שנוצרו במהלך עיבוד המדגם.
  5. חישוב שיעור חיובי כוזב באמצעות חיפוש מסד נתונים הפוך.
  6. סנן הזדהויות חלבון לקבל התאמות של אמון סף בלבד. אנו ממליצים על הפרמטרים הבאים להתחיל עם: Xcorr> 3 (2),> 4 (3),> 5 (4); deltaCN סובלנות> 0.1, ציון הקונצנזוס ≥ 20, 2 דה הסובלנות המונית ליון הורה, מסה של 0.5 דה ליוני מוצר, לפחות 2 פפטידים ייחודיים בחלבון ולא יותר מ 3 החמיצו שסעים.

7. Quantitation תווית חינם

Determine השפע היחסי של חלבונים באמצעות quantitation תווית חינם (איור 4).

  1. מספר תוכנות הם בפומבי או זמין מסחרי כדי לכמת ללא תווית של נתוני ספקטרומטריית מסה כולל המפקד (קבוצתו של פרופ 'ייטס), 23 Elucidator (Microsoft), 24 נפו (Thermo Scientific), 25 פיגום (תוכנת Proteome) 26. תוכניות אלה מכוונות כדי לתאם את אות ספקטרומטריה של פפטידים שלמים או את מספר אירועי רצף פפטיד עם כמויות חלבון יחסיות בין שתי מדינות או יותר.
  2. אמנם כל תכנית משלבת צינור ניתוח דומה, חלק מהתוכניות מוגבלות לסוגים של ניתוח ספציפי שניתן לבצע על הנתונים. בתחילה, נתוני ריצות שונות מיושרים, עוצמת אות מנורמלת ופסגות פפטיד נבחרות לניתוח.
  3. שתי השיטות הנפוצות ביותר הן כימות מבוסס על ספירת רפאים או אזור LC-MS שיא. שפעיחס זה מחושב על מנת להבחין בשינויים בשפע פפטיד בין קבוצות שונות.
  4. תוכניות אלה יכולות להיות ממשק עם אלגוריתמי חיפוש proteomic (קמע, Sequest, X! טנדם) כדי לתאם מידע כימות לזיהוי חלבון.
  5. כדי להבטיח דיוק ושחזור של הנתונים הוא חיוני כדי לשלב שני המדגמים שונים (ניסיוניים) הביולוגיים וטכניים (מפעיל אותו המדגם בספקטרומטר המסה מספר פעמים) משכפל נתוני spec המוניים.
  6. הווריאציה של שפע פפטיד ובבין תנאי ניסוי ניתן להעריך על ידי ANOVA ולהתוות דרך PCA (איור 5).

שיקולים חשובים עבור quantitation החופשי תווית. בעת ביצוע quantitation ללא תווית, תשומת לב חייבים להינתן ספציפית כדי להבטיח הכנה עקבית מדגם, זמן עיכול ותנאי LC-MS/MS כחייבת להיות מעובד כל דגימה ונותחה בנפרד. בניגוד לנפגשגישות תיוג abolic, השוואות בניסויים ללא תווית נעשות על נתונים מספקטרומטריית מסות מובחנת פועלת (בגלל חוסר התיוג obviates את האפשרות להפעיל אותם יחד), ובכך תחייבנה שחזור גבוה בכל ההיבטים של ניתוח מדגם (כלומר של מכין מדגם, צעדי MS LC ו) ושימוש בספקטרומטר מסה המונית דיוק גבוה.

כדי להסביר שינויים קלים בהכנת מדגם וניתוח סטנדרטי ידוע ניתן להוסיף לכל דגימה על מנת לסייע בנורמליזציה של נתונים. בנוסף, רוב התוכנות מאפשרות נורמליזציה של עוצמת אות (למשל, על ידי התאמה לרעשי רקע או אנליטי שפע ידוע) לאחר רכישת נתונים כדי להסביר את ההבדלים בזריקה, יינון ופיצול. אלגוריתמי יישור קיימים ברוב התוכנות שבנדון, המסייעות בתיקון הבדלים בפרופילי elution פפטיד. השימוש בביולוגי וטכני הוא משכפל אסןTial בסוג זה של מחקר, שכן היא מאפשרת ניתוחים סטטיסטיים על מנת לאשר את השחזור והעקביות של כל שינויים שנצפו בשפע חלבון.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

איור 4 מדגיש את התועלת של צורה זו של כימות יחסי. מוצגים בלוח השמאלי הן הפסגות הבודדות monoisotopic פפטיד (מעולף מעכברים שונים), שנקבעו כלשייכת לHMGB1 החלבון (מזוהה באמצעות חיפוש באתר). כל שיא, למעשה כרומטוגרף יוני חילוץ לפפטיד הנתון, מגיע מעכבר אחר. הקבוצות מייצגות את שלוש מדינות שונות פיסיולוגיות: היפרטרופיה בסיס, לב ואי ספיקת לב, עם שלוש ביולוגיים משכפל לכל קבוצה. על ידי שילוב של השטח מתחת לעקומה, שפע יחסי יכול להיות מחושב. בפנל האמצעי הממוצע של שכיחות אלה מוצג. ברור מסוג זה של ניתוח, שהשפע של חלבון HMGB1 משתנה במהלך המחלה. לעומת זאת, בפנלים התחתונים מראים דוגמה של היסטון H4 שאינו משתנה עם מחלה. בשני המקרים, פפטידים המגיעים מבעלי חיים מאותו phenotמדינת ypic להראות פרופילי elution דומים ושפע יחסי, הוכיחה את השחזור של הכנת מדגם LC / MS / MS.

השחזור של טכניקה זו הוא אישור נוסף באמצעות ניתוח מרכיבים עיקרי (PCA). כפי שניתן לראות בתרשים 5, יישום של ANOVA לתוצאות Proteome הכוללות של כל חיה נתחה מגלה אשכולות נפרדים על ידי הפנוטיפ לב (ביולוגי משכפל) עם הדוק קשר בין משכפל טכני (מפרט מסה שונה פועל באותו המדגם) מאותה החיה . זה מספק ביטחון כי השינויים שנצפו בשפע חלבונים בודדים של עניין אכן ניתן לייחס לשינוי במצב הפיזיולוגי.

חשיבות שווה ככימות והשחזור של התוצאות הוא הכיסוי המוגבר של Proteome הגרעיני מופעל על ידי subfractionation הגרעיני. האיור 6 ממחיש כי ניתוח של כל הגרעין לבד לא מצליח לחשוף רוב החלבונים הגרעיניים שזוהו בעת שילוב ניתוחים בודדים מהתאים הנפרדים (1048 חלבונים ייחודיים שזוהו בסך הכל מעבר לשברים לעומת 428 זיהו מהגרעינים השלמים) אפילו. יתר על כן, את החפיפה המתונה בין החלקים השונים מדגימה את הרלוונטיות הביולוגיות של תאים אלה שוקלים בנפרד לתובנה נוספת לתוך פונקציה גרעינית ורגולציה של גנים. לבסוף, היכולת במיוחד יופרד חומצת חילוץ או חומר הניקוי חולץ-מעשיר הכרומטין לחלבוני מפתח הכרומטין מבניים, כמו ההיסטונים, ובכך מאפשרים ניתוחי ספקטרומטריה ממוקדות יותר (כמו אלה שינויי היעד שלאחר translational) על קבוצה של חלבונים ללא דורש נוגדנים ספציפיים לכל חלופה ואיזופורם.

94fig1highres.jpg "src =" / files/ftp_upload/4294/4294fig1.jpg "/>
איור 1. תרשים זרימה לאפיון של חלבונים בתאים תת גרעיניים לבביים. לבבות עכבר שלמי homogenized וlysate מועשר לגרעינים. גרעינים הם מופרדים לnucleoplasm הכרומטין, חומרי ניקוי, חולץ, ושברי הכרומטין חומצה חולץ. חלבונים מכל מבודדים ומופרדים על ידי חד ממדי SDS-PAGE, והלהקות טריפסין מתעכל ומנוהל על ידי LC / MS / MS. אחרי החיפוש שמסד נתונים, כימות ללא תווית משמשות לזיהוי מגמות שפע לחלבונים בברים השונים.

איור 2
איור 2. חלוקה סכמטית גרעיניים. גרעינים מועשרים מhomogenate לב השלם דרך שיפוע סוכרוז. כל דגימת גרעינים או ניתן להפריד לnucleoplasm ופיצולי דטרגנט-חולצו או לacשבריר איד חילוץ שמעשיר לההיסטונים.

איור 3
איור 3. ג'ל חד ממדי של שברים השונים. של 20 מיקרוגרם lysate לב השלם (WHL), גרעינים שלמים (Nuc), nucleoplasm (Nup), חומרי ניקוי, חילוץ הכרומטין (DE), ושבריר החומצה חולץ הכרומטין (AE) מלב עכבר היו לרוץ על חד ממדי SDS-PAGE ג'ל (12 acrylamide%), יחד עם חלק הכרומטין חומצה המופק מתאי הלה ומוכתם בזהבן. דפוסים השונים של שפע של חלבון הכולל במשקלים המולקולריים השונים להוכיח את קיומו של proteomes הייחודי עבור תת מדורים השונים, לרבות העשרה לההיסטונים המשקל נמוך המולקולריים בחומר הניקוי הכרומטין-חולץ אשר מועשרים נוסף בשברי חומצה חולץ . כן, יש לציין הוא הטבע המורכב באופן משמעותי פחות משבריר AE מתא הלהזה בהשוואה לזו מהלב.

איור 4
איור 4. כימות שפע יחסי עכברים משלוש מדינות שונות לב:. היפרטרופיה בסיסית (כחול) (אדום) וכישלון (ירוק) נאספו בשלושה עותקים ודגימות חלבונם רצו לשתיים טכניים משכפל ידי LC / MS / MS. מוצגות מהשמאל הם פסגות monoisotopic לפפטיד ספציפי (ספקטרום שמוצג בצד ימין). שפע יחסי חושב על ידי ממוצע בין אינטגרציה ומשכפל של כל מדינה הפנוטיפי (פנל באמצע) כדי להשוות את השפע היחסי של הפפטיד (החלבון ושממנו בא) במצבים השונים של אי ספיקת לב. הפנל העליון מראה פפטיד מHMGB1, שפע שהוא שינה במחלה, ואילו הלוח התחתון (H4 היסטון) אינו משתנה. לחץ כאן לצפייה בדמות גדולה.

איור 5
איור 5. ניתוח המרכיבים עיקרי מגלה שחזור. ניתוח ANOVA לכל עכבר (3 ביולוגיים משכפל / לב מדינת x 2 טכניים משכפל) להתוות לעצמת פפטיד (צירים) מציג אשכולות במצב מחלה (בסיס בכחול, היפרטרופיה באדום, כישלון בירוק), אשר מציין שחזור מוצלח של נתוני spec ההמוניים וההבדלים פיסיולוגיים משמעותיים בין מצבי מחלה השונות.

איור 6
איור 6. גלובל אפיון של תת מדורים גרעיניים שונים. זיהינו 1,048 חלבונים ייחודיים כלל על פני כל 4 frפעולות. 146 חלבונים היו משותפים לכל 4 השברים, בהשוואה ל 749 חלבונים שזוהו בnucleoplasm, 380 בשבריר הכרומטין דטרגנט-החילוץ, 426 בשבריר הכרומטין חומצת החילוץ, ו428 בגרעינים השלמים. דיאגרמת ון מתארת ​​את החפיפה המתונה בחלבונים שזוהו בין השברים, המדגישה את קיומם של אזורים שונים בגוף חי ואת היכולת של חלוקה זו לבודד אותם. בנוסף, האפיון בולט החלקי של Proteome הגרעיני הכולל השגה על ידי ניתוח גרעיני unfractionated (כתום) רק מצדיק חלוקה נוספת.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

שתי שיטות עיקריות לבידוד גרעיני כבר נבדקו בעבר: 27 אחד היא טכניקת הרנס של מאחד רקמת lyophilized בממס בלתי מימי ושנייה, שינוי שאנו משתמשים כאן, מאחדים רקמה בתמיסת מלח סוכרוז / מימי אחרי בהפרש או צנטריפוגה צפיפות שיפוע.

Subfractionation של הגרעינים על ידי מיצוי חומצה על דגימות רקמה הוא כלי חשוב ללימוד הכרומטין אשר שמש מאז 1960, 28 במטרתה המקורית הייתה לנתח ההיסטונים. פרוטוקולי חומצת חילוץ פותחו למטרה זו של טיהור רכיבי ליבת ההיסטונים nucleosomal 29 הגבלה של המחקרים הקודמים אלה הוא העדר המידע על החלבונים שאינם מהווה היסטון, ושינוי, הכרומטין;. יש לנו לטפל באתגר הזה עם הפרוטוקול הנוכחי לאפיון subfractions הביולוגי המובהק של הגרעין והכרומטין.גישה זו, המשתמשת בחומרים ניקוי או בחילוץ חילוץ חומצה של הכרומטין במקביל, חושפת את המגוון של מולקולות רגולטוריות הכרומטין ומבחינה בין הרמות של ויסות אנדוגני, ובכך משמשת כגישה חזקה לדור השערה.

יישום המתודולוגיה הוקם חומצת החילוץ לmyocyte המבוגר מציב מכשולים מסוימים הכוללים את cytoskeleton הצפופים והאוכלוסייה גדולה של המיטוכונדריה. בעוד גרסות של חומצת שאיבה נעשו שימוש ברקמת לב כל 30 הניסויים שנערכו באופן ממוקד למחקר חלבונים ידועים; הפרוטוקול הנוכחי תוכנן ובוצע כדי לאפשר ניתוח Proteome משוחד. בנוסף, מצא את זה מועיל לבחון חומר ניקוי חילוץ והכרומטין בנפרד חומצת חילוץ (רק 37% חפיפה נצפתה בין proteomes של שני שברים אלה) כדי להבין טובים יותר את הדינמיקה שדרכו אוכלוסיות אלה של הכרומטין החלבונים interact עם ה-DNA. פרוטוקולים אחרים באמצעות חוצצי אוריאה מבוססת גם תוארו, 31,32 ש, לבצע לפני מיצוי חומצה, להעשיר את החלבונים הקשורים פחות חזק לגנום. בנוסף לשברי הכרומטין, לאחרים יש subfractionated הגרעין לבודד את הגרעינון, 33 אבל subfractionation לניתוח ספקטרומטריית מסות של גרעיני שריר לב מבודד מכל לב לא דווח.

מחקרי proteomic רובה על שלמות גרעינים, כלומר, האברונים-בוצע על רקמת שריר לב באמצעות גישת MudPIT unfractionated 15. מחקר זה זיהה 1,044 חלבונים לבביים גרעיניים, באותו הקנה המידה כמו הפרוטוקול שלנו, אולם הם הסתמכו על שימוש ממוצע של 8.5 משכפלים, עם כל סיבוב שנמשך 20 שעות כדי לזהות חלבונים נמוכי שפע. בניגוד לכך, אנו מועסקים subfractionation, לשניהם עלייה במספר חלבונים הניתנים לזיהוי (ללא צורך הממושך כרומטוגרפיה ריצות LC הן 85 דקות), בעוד importantly גם מציע מידע ביולוגי נוסף על לוקליזציה משנה הגרעיני ושפע יחסי של החלבונים.

מלב עכבר כולו (0.14 כ ז) להתאושש כ -1.2 מ"ג (0.85% בסך הכל) של חלבון בגרעין בשלמותה. מהגרעינים השלמים שנשיג את ההתאוששות הבאה עבור כל אחד מsubfractions (הערה: הערכים כלל יעלו על 100% כחומצת חילוץ וחומר ניקוי השאיבה נעשים בלבבות נפרדים, לא בסדרה): Nucleoplasm (15%), חומרי ניקוי, חילוץ הכרומטין (85%), והכרומטין חומצת חילוץ (54%). לשם השוואה, Thermo Scientific יש ערכה (NE-PER ריאגנטים גרעיניים וcytoplasmic) שגיליון הנתונים שלהם אומר חלבון תשואות 1.6mg cytosolic וחלבון גרעיני מ"ג 0.6 (1.5%) לעומת 40 מ"ג של לב עכבר עם 10% זיהום צולב בין שני השברים. סיגמא יש ערכה (קיט NXTRACT, CellLytic גרעיני הפקה) שהם נבדקו על שריר ארנבת, אך לא בלב, והתאושש מרקמת 100 מ"ג 0.46 מ"ג של חלבון גרעיני (0.46%) במה שהם מכנים "גרעין הגלולה הגולמית" שלהם עם "כמה אחוזים" של זיהום cytoplasmic. חברות אחרות, כמו גם Epigentek מציעות ערכות, עם זאת אנו לא הצלחנו למצוא פרטים ספציפיים על ההעשרה והטהרה באתרי האינטרנט שלהם לשם השוואה.

כבר תארנו בטכניקה חדשנית לכתובות הצורך הנוכחי להעשרה מוצלחת של גרעיני לב ללימודי proteomic. בנוסף, אנו מתארים מתודולוגיה לחלוקת תא משנה, שהן מגדילה את היכולת לזהות חלבונים פחות בשפע, כמו גם מאפשר לרזולוציה, כימות ונחישות של לוקליזציה חלבון גבוהה יותר. לשם כך, הפרוטוקול לניתוח ספקטרומטריית מסה מציע הנחיות מומלצות, אולם שיקולי מקרה לפי מקרה הסביר להניח שיהיו צורך. לדוגמה, מצא כי המספר הגדול של isoforms החלופה היסטון הלבבי עם בדיקת רצף הדמיון נדרש ידנית של הספקטרום כדי להקצות maפסגות Jor ולאשר המוניים יון הורה בטרם תוכל בביטחון להקצות את הספקטרום. 14 פרמטרי חיפוש יכולים גם להיות מותאמות לשינוי לאחר translational (PTM) זיהוי וביקורות מצוינות קיימות שיטות המפרט וחששות עם נתונים לפרשנות לניתוח PTM (כולל העשרת PTM , 34 תוכנה עבור PTMs, 35 הניתוח PTMs קומבינטורית, 36 אסטרטגיות חלופיות פיצול 37 ועיכול והעיבוד 38,39 אלטרנטיביים).

ההעשרה והחלוקה תארה היא מכל הלב (שהוא cardiomyocyte 50-70% על ידי מסה). בעוד היבטים של הספציפיות תא הקרבות זה שעשויים להיות חשובים במיוחד למשפחות מסוימות של חלבונים גרעיניים, היא מאפשרת הרבה יותר מהירה השעיה של החלבונים לתוך מאגרים תקינים, דבר שאינו אפשרי עם פרוטוקולי בידוד מבוגרים myocyte סלולרי. בדרך זו, במתודולוגיה זו טובה יותר שומרת על שלמות oו המדגם נגד שפלה. עם זאת, תארו גם הן הוראות ליישום פרוטוקול זה כדי myocytes חדרית המבודדת ילוד חולדה, שכן שני דגמי האורגניזם מבודד תאים וכל כלים דרושים ללימוד אי ספיקת לב. בעיקרון בשיטה זו יכולה להיות מיושמת גם על myocytes המבוגר חולץ על ידי עיכול אנזים מלבה-עם מבודד האזהרה כי שינויים בקשרי חלבונים המתרחשים במהלך הבידוד (שיכול להימשך יותר משעה) יהיו רודפים את הפרשנות של תצפיות proteomic.

פתחנו מתודולוגיה זו כדי להבין את השינויים בProteome הגרעיני ואיפור הכרומטין שתורמים למחלה. אולם 14 יישומים אחרים כוללים לימוד שינויים לגירוי ספציפיים בהרכב Proteome בפיזיולוגיה נורמלית. בנוסף,-חלוקה תת מציעה את היכולת לרמה חדשה של אפיון של כמה החלבונים לפעול ולמקם על פני אזורים פונקציונליים שונים של הגרעין.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

אין ניגודי האינטרסים הכריזו.

Acknowledgments

Vondriska המעבדה נתמכת על ידי מענקים מהמכון הלאומי ללב, ריאות ודם של NIH וLaubisch הקרן ב-UCLA. א"מ הוא נמען של ג'ניפר ס וכוואלד בוגרת המלגה לפיזיולוגיה באוניברסיטת קליפורניה; HC הוא הנמען של מלגת איגוד לב אמריקנית קדם דוקטורט; MP הוא הנמען של מלגת Kirschstein רות NIH פוסט דוקטורט; וSF הוא הנמען של פרס K99-NIH.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Dulbeco Modified Eagle Medium Invitrogen 11965
Protease pellet Roche 04 693 159 001
100 μm strainer BD Falcon 352360
Ultracut ultramicrotome Reichert
100CX Transmission Electron
Microscope		 JEOL USA, Inc.
Oriole BioRad 161-0496
Histone H2A antibody Santa Cruz sc-8648
Nucleoporin p62 antibody BD Biosciences 610498
Adenine nucleotide transporter antibody Santa Cruz sc-9299
BiP antibody Santa Cruz sc-1050
Tubulin antibody Sigma T1568
Histone H3 antibody Abcam ab1791
Fibrillarin antibody Cell Signaling C12C3
SNRP70 antibody Abcam ab51266
E2F-1 antibody Thermo Fisher MS-879
Retinoblastoma antibody BD Biosciences 554136
Hypoxia inducible factor-1 antibody Novus Biologicals NB100-469
BCA protein assay Thermo Scientific 23227
Reverse phase column New Objective PFC7515-B14-10
BioWorks Browser Thermo Scientific

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Li, F., Wang, X., Capasso, J. M., Gerdes, A. M. Rapid transition of cardiac myocytes from hyperplasia to hypertrophy during postnatal development. J Mol Cell Cardiol. 28, 1737-1746 (1996).
  2. Rumyantsev, P. P. Interrelations of the proliferation and differentiation processes during cardiact myogenesis and regeneration. Int Rev. Cytol. 51, 186-273 (1977).
  3. Olson, E. N., Schneider, M. D. Sizing up the heart: development redux in disease. Genes Dev. 17, 1937-1956 (2003).
  4. Molkentin, J. D., Dorn, G. W. 2nd Cytoplasmic signaling pathways that regulate cardiac hypertrophy. Annu Rev. Physiol. 63, 391-426 (2001).
  5. Fishman, M. C., Chien, K. R. Fashioning the vertebrate heart: earliest embryonic decisions. Development. 124, 2099-2117 (1997).
  6. Rajabi, M., Kassiotis, C., Razeghi, P., Taegtmeyer, H. Return to the fetal gene program protects the stressed heart: a strong hypothesis. Heart Fail Rev. 12, 331-343 (2007).
  7. Roger, V. L., et al. Heart disease and stroke statistics--2011 update: a report from the American Heart Association. Circulation. 123, e18-e209 (2011).
  8. Schirmer, E. C., Florens, L., Guan, T., Yates, J. R. 3rd, Gerace, L. Nuclear membrane proteins with potential disease links found by subtractive proteomics. Science. 301, 1380-1382 (2003).
  9. Lambert, J. P., Mitchell, L., Rudner, A., Baetz, K., Figeys, D. A novel proteomics approach for the discovery of chromatin-associated protein networks. Mol. Cell Proteomics. 8, 870-882 (2009).
  10. Malik, P., et al. Cell-specific and lamin-dependent targeting of novel transmembrane proteins in the nuclear envelope. Cell Mol Life Sci. 67, 1353-1369 (2010).
  11. Tweedie-Cullen, R. Y., Reck, J. M., Mansuy, I. M. Comprehensive mapping of post-translational modifications on synaptic, nuclear, and histone proteins in the adult mouse brain. J. Proteome Res. 8, 4966-4982 (2009).
  12. Chu, D. S., et al. Sperm chromatin proteomics identifies evolutionarily conserved fertility factors. Nature. 443, 101-105 (2006).
  13. Uchiyama, S., et al. Proteome analysis of human metaphase chromosomes. J. Biol. Chem. 280, 16994-17004 (2005).
  14. Franklin, S., et al. Specialized compartments of cardiac nuclei exhibit distinct proteomic anatomy. Mol. Cell Proteomics. 10, (2011).
  15. Kislinger, T., et al. Global survey of organ and organelle protein expression in mouse: combined proteomic and transcriptomic profiling. Cell. 125, 173-186 (2006).
  16. Moore, D. H., Ruska, H. Electron microscope study of mammalian cardiac muscle cells. J. Biophys Biochem. Cytol. 3, 261-268 (1957).
  17. Anversa, P., Vitali-Mazza, L., Visioli, O., Marchetti, G. Experimental cardiac hypertrophy: a quantitative ultrastructural study in the compensatory stage. J. Mol. Cell Cardiol. 3, 213-227 (1971).
  18. Franklin, S., et al. Specialized compartments of cardiac nuclei exhibit distinct proteomic anatomy. Mol Cell. Proteomics. 10, (2011).
  19. Paulsson, A. K., et al. Post-translational regulation of calsarcin-1 during pressure overload-induced cardiac hypertrophy. Journal of molecular and cellular cardiology. 48, 1206-1214 (2010).
  20. Franklin, S., et al. Quantitative analysis of the chromatin proteome in disease reveals remodeling principles and identifies high mobility group protein b2 as a regulator of hypertrophic growth. Mol Cell Proteomics. 11, (2012).
  21. Gramolini, A. O., et al. Comparative proteomics profiling of a phospholamban mutant mouse model of dilated cardiomyopathy reveals progressive intracellular stress responses. Mol Cell Proteomics. 7, 519-533 (2008).
  22. Singh, H., Warburton, S., Vondriska, T. M., Khakh, B. S. Proteomics to Identify Proteins Interacting with P2X2 Ligand-Gated Cation Channels. J. Vis. Exp. (27), e1178 (2009).
  23. Park, S. K., Venable, J. D., Xu, T., Yates, J. R. 3rd A quantitative analysis software tool for mass spectrometry-based proteomics. Nat. Methods. 5, 319-322 (2008).
  24. Lomenick, B., et al. Target identification using drug affinity responsive target stability (DARTS). Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 106, 21984-21989 (2009).
  25. Kamleh, A., et al. Metabolomic profiling using Orbitrap Fourier transform mass spectrometry with hydrophilic interaction chromatography: a method with wide applicability to analysis of biomolecules. Rapid Commun. Mass Spectrom. 22, 1912-1918 (2008).
  26. Searle, B. C. Scaffold: a bioinformatic tool for validating MS/MS-based proteomic studies. Proteomics. 10, 1265-1269 (2010).
  27. Murray, K. The Basic Proteins of Cell Nuclei. Annu Rev. Biochem. 34, 209-246 (1965).
  28. Johns, E. W., Phillips, D. M., Simson, P., Butler, J. A. Improved fractionations of arginine-rich histones from calf thymus. Biochem. J. 77, 631-636 (1960).
  29. Rodriguez-Collazo, P., Leuba, S. H., Zlatanova, J. Robust methods for purification of histones from cultured mammalian cells with the preservation of their native modifications. Nucleic Acids Res. 37, e81 (2009).
  30. Kuehl, L., Salmond, B., Tran, L. Concentrations of high-mobility-group proteins in the nucleus and cytoplasm of several rat tissues. J. Cell Biol. 99, 648-654 (1984).
  31. Gronow, M., Griffiths, G. Rapid isolation and separation of the non-histone proteins of rat liver nuclei. FEBS Lett. 15, 340-344 (1971).
  32. Mischke, B. G., Ward, O. G. Isolation and tissue specificity of chromatin-associated proteins in Vicia faba. Can J. Biochem. 53, 91-95 (1975).
  33. Andersen, J. S., et al. Directed proteomic analysis of the human nucleolus. Curr. Biol. 12, 1-11 (2002).
  34. Zhao, Y., Jensen, O. N. Modification-specific proteomics: strategies for characterization of post-translational modifications using enrichment techniques. Proteomics. 9, 4632-4641 (2009).
  35. Ahrne, E., Muller, M., Lisacek, F. Unrestricted identification of modified proteins using MS/MS. Proteomics. 10, 671-686 (2010).
  36. Young, N. L., Plazas-Mayorca, M. D., Garcia, B. A. Systems-wide proteomic characterization of combinatorial post-translational modification patterns. Expert Rev. Proteomics. 7, 79-92 (2010).
  37. Guthals, A., Bandeira, N. Peptide identification by tandem mass spectrometry with alternate fragmentation modes. Mol. Cell Proteomics. , (2012).
  38. Wu, C., et al. A protease for 'middle-down' proteomics. Nat. Methods. , (2012).
  39. Tran, J. C., et al. Mapping intact protein isoforms in discovery mode using top-down proteomics. Nature. 480, 254-258 (2011).

Tags

רפואה גיליון 70 ביולוגיה מולקולרית אימונולוגיה גנטיקה גנומיקה פיזיולוגיה חלבונים דנ"א הכרומטין מחלות לב וכלי דם פרוטאומיקה ספקטרומטריית מסות
ניתוח הכמות של Proteomes הכרומטין במחלות
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Monte, E., Chen, H., Kolmakova, M.,… More

Monte, E., Chen, H., Kolmakova, M., Parvatiyar, M., Vondriska, T. M., Franklin, S. Quantitative Analysis of Chromatin Proteomes in Disease. J. Vis. Exp. (70), e4294, doi:10.3791/4294 (2012).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter