Summary
Достижения в области масс-спектрометрии позволило высокой пропускной анализ экспрессии белка и изменения в целый ряд тканей. В сочетании с субклеточных фракционирования и болезни модели, количественные масс-спектрометрии и биоинформатика может выявить новые свойства в биологических системах. Метод, описанный здесь анализ хроматин-ассоциированных белков в условиях болезни сердца и легко применим и к другим
Abstract
В ядре находятся протеомов, функции которых наиболее тесно связана с генной регуляции. Взрослых млекопитающих ядер кардиомиоцитов являются уникальными в связи с высоким процентом двуядерных клеток, 1 преимущественно гетерохроматиновых состояния ДНК, и без деления характера кардиомиоцитов взрослого, который оказывает ядер в постоянном состоянии интерфазы 2. Регуляция транскрипции в процессе разработки и Болезнь была хорошо изучена в этом органе, 3-5, а то, что остается относительно неисследованной является роль, которую играют ядерные белки, отвечающие за упаковку ДНК и экспрессии, и как эти белки контролировать изменения в транскрипционной программы, которые происходят во время болезни. 6 В развитых мира, болезнь сердца является причиной номер один смертности для мужчин, так и женщин. 7 Insight о том, как ядерные белки сотрудничать регулировать прогрессирование этого заболевания имеет решающее значение для продвижения современного лечения Options.
Масс-спектрометрия является идеальным инструментом для решения этих вопросов, поскольку оно позволяет объективно аннотации ядерного протеома и относительное количественное о том, как обилие этих белков изменяется с болезнью. Хотя было несколько протеомных исследований для млекопитающих ядерные белковые комплексы, 8-13 до недавнего времени 14 было только одно исследование изучения сердечных ядерной протеома, и это считается всего ядра, а не изучения протеома на уровне отсеков АПЛ 15. В значительной степени этот недостаток работы связано с трудностью выделения сердечной ядер. Сердечная ядер происходит в жесткой и плотной актин-миозин аппарат, к которому они подключены через несколько расширений эндоплазматической сети, в той степени, миоцитов изменяет сокращение их общей форме 16. Кроме того, кардиомиоцитов на 40% митохондрий по объему 17, который necessitaTES обогащения ядро отдельно от других органелл. Здесь мы опишем протокол для сердечной обогащению урана и дальнейшего фракционирования в биологически соответствующие отсеки. Кроме того, мы подробно методы этикетки без количественного масс-спектрометрического рассечение этих фракций, методы поддаются в естественных условиях эксперименты в различных животных моделях и систем органов, где метаболические маркировке не представляется возможным.
Protocol
Экспериментальные рабочий процесс содержит семь основных этапов (рис. 1). Для любых работ, связанных с образцами, которые будут работать на масс-спектрометре, экспериментатор должен носить халат, перчатки и волосы чистые и заботиться, чтобы избежать загрязнения от пыли и личных пролития кератина.
1. Усреднение сердца и ядерной изоляции
Мышь сердца гомогенизируют и нетронутой ядер гранул выделяется (рис. 2).
- Жертва взрослой мыши, акцизы сердце, промыть в ледяной PBS, и гомогенизируют на льду в стеклянной Dounce (мы предпочитаем Grinder Wheaton Ткань из Фишера, № 08-414-13A, но и другие методы могут одинаково хорошо работать), содержащий 2 мл буфера для лизиса (гипотонический раствор, который дифференциально лизирует клеточных мембран органелл над включая ядро) (10 мМ Трис, рН 7,5, 15 мМ NaCl и 0,15% об / об Nonidet P-40 [NP-40] в деионизированной воде плюс протеазы, фосфатазы и яnhibitor смесь: 10 мМ бутират натрия, 0,1 мМ фенилметилсульфонилфторида [PMSF], 0,2 мМ Na 3 VO 4, 0,1 мМ NaF и 1 Roche протеазы pellet/10 мл - лизис буфера может храниться до одной недели при -20 ° C ). (Примечание: мы не считаем необходимым заливать сердца PBS, так как наши данные масс-спектрометрии и GO анализа идентифицировать белки, преимущественно кардиомиоцитов [р-значение 3.8E-22] по происхождению, в отличие от крови загрязнений [стр. значения 5,0 E-2]).
- Залить лизата через 100 мкм сито и собирают потока через трубку в 1,5 центрифуги мл. На данный момент, если не указано, образцы должны храниться на льду.
- Центрифуга при 4000 оборотов в минуту в течение 5 мин при 4 ° C.
- Удалить супернатант. (Это цитозоле, и должны храниться при температуре -80 ° C. Он содержит лизированных митохондрий.) Ресуспендируют осадок в 200 мкл буфера для лизиса путем растирания. (Это примитивное ядерное гранул).
- Заполните 1,5 мл центрифужные пробирки с 1 мл сахарозы баффэр (24% веса сахарозы / объем, 10 мМ Трис, рН 7,5, и 15 мМ NaCl в деионизированной воде с протеазы / ингибиторы фосфатазы смеси - сахароза буфер должен быть свежим в тот день использования). Аккуратно слой Ресуспендированный осадок на верхней площадке сахарозы и центрифуге при 5000 оборотов в минуту в течение 10 мин при 4 ° C.
- Удалить тонкую пленку на верхней, так и сахарозы площадки (которые содержат мембраны). Промойте оставшиеся гранулы с 200 мкл ледяной PBS / EDTA (1x PBS с 1 мМ EDTA). (Это ядер гранул и могут быть растворены или фиксированный для использования в вестерн-блоттинга или электронной микроскопии [См. шаги 4.1 и 4.2] для количественного обогащения.)
2. Нуклеоплазму и моющих средств экстрагируют хроматина Фракционирование
Сырой ядра гранулы разделены на нуклеоплазму и моющих средств экстрагируют хроматина фракции, содержащие белки слабо связаны с ДНК.
- Осадок растирают с шагом 1,6 в 200 мкл буфера для экстракции моющих средств (20 мМ HEPES рН 7,6, 7,5 мМ MgCl 2. 0,2 мМ ЭДТА, 30 мМ NaCl, 1 М мочевины, 1% NP-40 в деионизированной воде с протеазы / ингибиторы фосфатазы смеси - буфер моющим средством извлечения может храниться до одной недели при температуре -20 ° C).
- Vortex образца в 2 раза, 10 сек каждый. Место на льду 10 мин.
- Центрифуга при 13000 оборотов в минуту в течение 5 мин при 4 ° C.
- Удалить супернатант. (Это нуклеоплазму и должны храниться при температуре -80 ° C). Промойте осадок ледяной PBS / EDTA. (Это хроматина гранул).
- Растирают осадок в 300 мкл Трис, SDS, ЭДТА буфере (50 мМ Трис, рН 7,4, 10 мМ ЭДТА, 1% SDS в деионизированной воде с протеазы / ингибиторы фосфатазы смеси - Трис, SDS, ЭДТА буфере может храниться до одной недели -20 ° C).
- Разрушать ультразвуком 3-6 раза в течение 10 секунд каждый, чтобы разбить ДНК. Храните образцы на льду между sonications.
- Центрифуга при 13000 оборотов в минуту в течение 5 мин при 4 ° C. Держите супернатант. (Супернатант моющего средства экстракты белка хроматина fractioп и должны храниться при температуре -80 ° C). Оставшийся осадок должна быть небольшой и может быть отброшено.
- При использовании изолированного миоцитов, а не от всего сердца: Изоляция новорожденных миоциты желудочка крысы из крысят один день после рождения использованием ферментативного расщепления, затем культуру в Дульбекко изменения Eagle среде (DMEM) с добавлением 10% эмбриональной телячьей сыворотки (FBS), 1% инсулина -трансферрин-селенит натрия (СТС), и 1% пенициллина. Через 24 часа, трансфер в сыворотке свободных средств массовой информации (такой же, как и выше, но не хватает FBS). Урожай клеток в буфере для лизиса (перечисленных в 1,1), и начать ядерную фракционирования на шаге 1.3.
3. Acid-экстракция Фракционирование - ДНК-связанных обогащения белком
Отдельные обогащает фракционирования белков тесно связан с ДНК, в том числе гистонов.
- Повторите шаги 1.1-2.4.
- Растирают хроматина осадок в 400 мкл 0,4 N серной кислоты. Vortex, чтобы удалить сгустки.
- Инкубировать при температуре 4 ° С в течение 30 мин или overnРАВО при вращении.
- Центрифуга при 16000 х г в течение 10 мин при 4 ° С для удаления ядерным мусором.
- Передача супернатант в новую пробирку.
- Добавить 132 мкл трихлоруксусной кислоты по каплям к супернатант. Обратить несколько раз. Инкубировать на льду в течение 30 мин.
- Центрифуга при 16000 х г в течение 10 мин при 4 ° C.
- Удалите супернатант. Аккуратно промойте осадок ледяной ацетон. (Это гистонов гранул).
- Центрифуга при 16000 х г в течение 10 мин при 4 ° C.
- Повторите мыть, шаг 3,8-3,9.
- Air-сухих гранул.
- Ресуспендируют осадок в 100 мкл Трис, SDS, EDTA буфер. Установить рН до 8 путем добавления 1 М Трис. (Используйте 1 М Трис акций, которые не рН с поправкой).
- Разрушать ультразвуком в водяной бане в течение 15 мин. Предотвращение перегрева путем добавления льда в воду ванны. (Это кислотно-извлеченного фракции и должны храниться при температуре -80 ° С)
4. Проверить чистоту
Западные кляксы и электронной микроскопииподтвердить успешное обогащение ядер и истощение других органелл. Чтобы увидеть типичные результаты для всех следующих тестов контроля качества, пожалуйста, см. нашу предыдущую публикацию 18.
- Выполните Вестерн-блоттинга. Зонд мембраной, содержащей каждой фракции для гистона H2A или nucleoporin p62 (как ядерные маркеры для проверки обогащение), и для аденина нуклеотидных транспортер, BiP и тубулина (как митохондриальных маркеров, эндоплазматический ретикулум маркером, и цитоскелета маркера соответственно для проверки чистоты). Чтобы убедиться в успешном subfractionation ядер, зонд для гистона H3 или фибрилларин (моющие средства и кислоты, экстракты хроматина и нетронутой ядер) и SNRP70 или E2F (нуклеоплазму). Зонд для ретинобластомы или гипоксии индуцируемый фактор-1 (обогащенный моющее средство экстракции хроматина за кислотно-извлеченного фракции). Дополнительные образцы контроля HeLa лизат клеток и целого лизат сердца также может быть запущен в том же геле: Подготовка HeLa клеточный лизат контроль, добавляя Tris, SDS, EDTA буфера блюдо культуры и с помощью мобильного скребок для сбора образцов. Разрушать ультразвуком и центрифугируют образца, как в шагах 2.6-2.7. Подготовить весь контроль лизат сердце гомогенизации сердца в 2 мл буфера (20 мМ Трис, рН 7,4, 150 мМ NaCl, 1 мМ ЭДТА, 1 мМ EGTA, 1% тритона Х-100, 2,5 мМ пирофосфат натрия, 1 мМ глицерофосфата в деионизированной воде протеазы и смеси ингибиторов фосфатазы). Разрушать ультразвуком и центрифугируют, как в шагах 2.6-2.7. См. шаг 5 для подготовки образцов белка для SDS-PAGE.
- Электронная микроскопия: Ресуспендируют ядра гранулы с шагом 1,6 в буфере для лизиса, содержащего 2% gluteraldehyde и исправить образца при 4 ° C. Промыть образцов в осмиевой кислоты, обезвоживают, и вставлять в эпоксидной смоле. Вырезать 70 нм срезов при использовании Reichert Ultracut ультрамикротомом. Пятно образцов в уранилацетатом, а затем свинца и изображения, используя JEOL 100CX просвечивающего электронного микроскопа. Количественная обогащения измерения площади нетронутой ядер по сравнению с общей площадью материал образа. Мы находим 60-80% ядернеповрежденными 14.
Важные соображения по обогащению сравнению с очисткой ядра. Данный протокол был разработан для протеомных анализа сердечного хроматина с целью изучения глобальных процессов регуляции генов во время болезни. Одним из основных компонентов разработки целого протеома экспериментов масс-спектрометрии является вопрос о динамическом диапазоне и быть в состоянии идентифицировать и охарактеризовать низкой обилие белков. В дополнение к основной целью предоставления информации по ядерной и хроматина конкретных биологии, обогащая для ядерных протеома, увеличивает вероятность обнаружения этих низких изобилие белков, так же как и дальнейшее subfractionation ядер. Однако, как уже говорилось, взрослых кардиомиоцитов имеет плотную цитоскелета компонента, подключенного к ядерной мембране. Мы не считаем, что мы полностью очищенного ядра от этих других клеточных компонентов. Тем не менее, обогащая только для ядер, у нас есть получитьред приемлемый порог для того, чтобы виды анализов описаны.
В частности, мы использовали EM оценить чистоту нашего сырья ядра гранулы и обнаружил, 60-80% доли в неповрежденными ядер, примерно на 10% митохондрий, а остальное мусор. Кроме того, мы знаем из нашего предыдущего исследования на интактной населения ядер, что, хотя многие миофиламентов не обогащенные этим протоколом (в том числе тубулина и актина, как измеряется западных) определенных белков (calsarcin-1) обогащаются, предлагая истинный биологический населения этих белков в сердечной ядер 19.
Кроме того, мы сравнили белки мы обнаружили, чтобы быть в кислотно-извлеченного хроматина фракции, к прогнозируемой роли этих белков ген онтологии. Важно отметить, что этот анализ генов онтология не принимать во внимание относительное содержание различных белков (так же как и наши западные данным блот), а подсчитывает все белка идентифицирован (обогатитьред или нет) как равных при определении общих путей и клеточных отсеках. Анализ этих путей и клеточных отсеках можно найти в наших предыдущих публикациях. 18,20 Самое главное, что успех обогащения в кислотно-извлеченные фракции хроматина позволил нам выявить наличие 54 вариантов гистонов у взрослых кардиомиоцитов мышей, 18 многие из которых опирается на один уникальный пептид для идентификации, и, таким образом, вероятно, не были обнаруживаются без этого обогащения протокола, учитывая огромные сложности всего протеома кардиомиоцитов. Из 1048 мы идентифицировали белки от сердечного ядер, из них 56 (5,3%) были комментариями GO анализ, чтобы быть частью нуклеосом (одного из компонентов ядра проценты). Другое исследование, глядя на все сердца, определили 6180 белков, из которых только 11 белков (0,18%) были аннотированный быть частью нуклеосом 21. Это еще раз свидетельствует о силе нашего протокола к meaningfuLLY обогащения ядерных белков.
5. Гель белков и ферментных белков Digest
Белки отделить от одномерного SDS-PAGE и трипсин расщепляют будет работать на масс-спектрометре.
- Разморозить образцы на льду и определить концентрацию белка для каждого образца с помощью bicinchoninic кислоты (BCA) анализа белка.
- Развести образцы с известной концентрацией использовании 5x буфера Laemmli, кипятить в течение 10 мин и хранят при температуре -20 ° С в течение одного-мерном SDS-PAGE. Развести образцы известной концентрации с использованием мочевины буфера для экстракции и хранят при -20 ° C в течение двух-мерных гели.
- Выполнить геля выбора загрузки равное количество белка в каждой полосе. Белки могут быть перенесены на нитроцеллюлозные мембраны, которые будут использоваться для вестерн-блоттинга (как и управления в шаге 4,1) или полосы могут быть сокращены для масс-спектрометрического анализа, см. следующие действия.
- Удалите гель от устройства с использованием деионизированной воды, чтобы перевести его на чистый контейнер.Крышка гель в Иволга пятно, и оберните контейнер в алюминиевую фольгу, чтобы блокировать свет. Разрешить гель для инкубации при комнатной температуре на шейкере в течение не менее 90 мин.
- Изображение Иволга-окрашенный гель (рис. 3) с помощью УФ-света, и отметьте, где полосы будут сокращены на изображении. Режем каждой полосе приблизительно в 25 2-мм полосы для исследования измерения полного протеома.
- Поместите гель на чистую поверхность. Используйте только материалы, которые хранились запечатанные или опрыскивают этанола для предотвращения загрязнения кератина. Вырезать из каждой группы, а затем дополнительно нарезать его на 3 равные части. Поместите все три части каждой полосы вместе в своей маркировкой 1,5 мл трубки. Гель части могут храниться при температуре -20 ° С в течение нескольких месяцев.
- Подготовка геля пробки для ферментативного расщепления. Дайджест гель части, используя трипсин при 37 ° С в течение ночи. Для подробного протокола образец геля см. наши предыдущие публикации. 22 Вы можете переварить низким молекулярным весом полосы с химотрипсин вместо трипсина,для устранения обширных расщепления трипсином в гистона хвосты.
6. Масс-спектрометрия и анализ данных
Образцы разделяли на LC и проанализированы MS / MS. Спектры искали против белка, базы данных для идентификации белков.
- Выполнить по 10 мкл каждого образца через LC / MS / MS. Мы используем нано-поток Eskigent LC с 75 мкм колонке с обращенной фазой. Используйте перспективе LC оптимизированы для целого ряда белков и пептидов. Применять линейный градиент от подвижной фазы (0,1% муравьиной кислоты, 2% ацетонитрила [ACN] в воде) для подвижной фазы B (0,1% муравьиной кислоты, 20% воды в ACN): 60 мин с 5% мобильного B фазы до 50 % B, то 15 мин от 50% В до 95% B и, наконец, 10 мин при постоянном 95% B. Используйте скорость потока 200 л / мин. Приобретать масс-спектрометрии данных в зависимости от данных режиме. Мы используем Orbitrap Thermo, что фрагменты Топ 6 самых распространенных ионов родителей.
- Повторите работает, по крайней мере, три биологические и два технических повторов. (Recommended)
- Используйте программное обеспечение (коммерчески доступные опции включают BioWorks и Xcalibur;! Публично доступных опций включает Prowl, X Tandem, SpectraST) для поиска спектров в базе данных Uniprot выбор с помощью алгоритма поиска (например, SEQUEST или талисман).
- Рассмотреть вопрос об изменении параметров поиска, чтобы обеспечить carbamidomethylation цистеин и метионин окисления, два общих модификаций, созданные во время обработки образцов.
- Рассчитать процент ложных срабатываний с использованием обратного поиска по базе данных.
- Фильтр белка идентификации принимать только матчи порог доверия. Мы рекомендуем следующие параметры для начала: Xcorr> 3 (+2),> 4 (+3),> 5 (+4); deltaCN> 0,1, консенсус баллов ≥ 20, масса толерантности 2 Da для родительских ионов, массы толерантности от 0,5 Da продукта иона, по крайней мере, 2 уникальных пептидов, белков и в не более 3 пропустил раскол.
7. Этикетка без количественного
Детеrmine относительное содержание белков с использованием этикетки без количественного определения (рис. 4).
- Количество программ являются публично или коммерчески доступных для этикетки без количественного массовой спектрометрии данных, включая переписи населения (группа проф Yates), 23 Elucidator (Microsoft), 24 сито (Thermo Scientific), 25 Эшафот (Proteome Software) 26. Эти программы направлены на коррелируют масс-спектрометрического сигнала нетронутым пептиды или число пептидных последовательностей событий с относительными величинами белка между двумя или более государствами.
- Хотя каждая программа включает в себя аналогичный трубопровод анализ некоторых программ ограничен типа конкретного анализа, которые можно выполнять с данными. Изначально данные из различных трасс выравнивается, интенсивность сигнала нормирована и пептидных пики отобранных для анализа.
- Два наиболее распространенных методов количественной основе спектрального учета или LC-MS площади пика. ИзобилиеКоэффициенты рассчитываются для определения изменений в пептидных обилие между различными группами.
- Эти программы могут быть сопряжены с протеомных алгоритмы поиска (Mascot, SEQUEST, X! Tandem), коррелируют количественной информации идентификации белков.
- Для обеспечения точности и воспроизводимости данных очень важно включать в себя как биологические (различные экспериментальные образцы) и технические (под управлением той же пробы на масс-спектрометре несколько раз) повторов массу данных спец.
- Изменение пептида и изобилие в экспериментальных условиях можно судить по ANOVA и построены с помощью PCA (рис. 5).
Важные соображения для печати этикеток без количественного анализа. При выполнении этикетки без количественного, особое внимание должно быть уделено обеспечению последовательной подготовки образца, время переваривания и LC-MS/MS условий каждого образца должны быть обработаны и проанализированы отдельно. В отличие от встретилисьabolic подходов маркировке, этикетке сравнения в свободной эксперименты выполнены на данных из различных масс-спектрометрии работает (из-за отсутствия маркировки исключает возможность запуска их вместе), что требует высокой воспроизводимости во всех аспектах анализа образца (т.е. пробоподготовки, LC и MS шагов) и использования спектрометры с высокой точностью массы массы.
Чтобы учесть незначительные изменения в пробоподготовки и анализа известных стандартов могут быть добавлены к каждому образцу для оказания помощи в нормализации данных. Кроме того, большинство программ позволяют нормализации интенсивности сигналов (например, с учетом особенностей фонового шума или известных обильные аналита) после сбора данных для учета различий в инъекции, ионизации и фрагментации. Выравнивание алгоритмы существуют в большинстве вышеуказанном патенте программ, которые помогают в устранении различий в профилях элюции пептидов. Использование биологических и технических повторяет является по существупространственной В этом типе исследования, так как позволяет статистического анализа для подтверждения воспроизводимости и последовательность любых наблюдаемых изменений белка изобилия.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Рисунок 4 подчеркивается полезность этой формы относительного количественного определения. Показанный на левой панели находятся отдельные пики моноизотопном пептид (обложил из разных мышей), которые были обозначены как принадлежащие к белка HMGB1 (определяется через поиск в базе данных). Каждый пик, по существу, извлеченные ионный хроматограф для данного пептида, происходит из другой мыши. Группы представляют собой три различных физиологических состояниях: базальный, гипертрофии сердца и сердечной недостаточности, с тремя биологическими повторяет для каждой группы. Благодаря интеграции площадь под кривой, относительное изобилие может быть вычислена. В середине панели среднее из этих содержаний показано. Как видно из такого анализа, что обилие белка HMGB1 меняется в течение болезни. В отличие от нижней панели показано на примере гистона Н4, которая не меняется с болезнью. В обоих случаях, пептиды ближайшие от животных одного и того же phenotypic состояния показывают, что аналогичные профили элюции и относительной численности, что свидетельствует о воспроизводимости пробоподготовки и LC / MS / MS.
Воспроизводимость этого метода дополнительно подтверждена с помощью анализа главных компонент (PCA). Как показано на рисунке 5, применение дисперсионного анализа к общей протеома результаты каждого животного проанализированы виден четкий кластеризации сердечной фенотип (биологических повторах) с крутых связь между техническим повторяет (различные спецификации масса работает одного и того же образца) от того же животного . Это дает уверенность, что обилие изменений, наблюдаемых в отдельных белков интерес действительно связано с разницей в физиологическом состоянии.
Не менее важно, как количественная и воспроизводимость результатов является увеличение охвата ядерного протеома включен по ядерной subfractionation. Рисунок 6 показывает, что анализ все ядра Только не в состоянии раскрыть даже большинство ядерных белков определены при объединении отдельных анализов из отдельных отсеков (одна тысяча сорок восемь уникальных белков, выявленных в общем через фракций по сравнению с 428 определены с нетронутыми ядер). Кроме того, умеренное перекрытие между различными фракциями свидетельствует о биологической значимости рассмотрении этих отсеках индивидуально для дополнительного понимания ядерной функции и регуляции генов. Наконец, способность специфически фракционирования кислоты экстрагируют или моющего средства экстрагируют хроматина обогащает ключевых структурных белков хроматина, такие как гистоны, что позволяет больше внимания масс-спектрометрического анализа (такие, как те, что целевая пост-трансляционных модификаций) на группу белков, без требующим специфических антител для каждого варианта и изоформы.
94fig1highres.jpg "SRC =" / files/ftp_upload/4294/4294fig1.jpg "/>
Рисунок 1. Блок-схема для характеристики белка в сердечной отсеков АПЛ. Всего сердца мыши гомогенизируют и лизат обогащенные для ядер. Ядра фракционированный в нуклеоплазму, моющие средства, извлеченные хроматина, и кислотно-извлеченные фракции хроматина. Белки друг от изолированных и разделенных одномерной SDS-PAGE, и полосы трипсин расщепляют и управляет LC / MS / MS. После поиска в базе данных, метка без количественного используется для выявления тенденций обилие белков в разных фракций.
Рисунок 2. Ядерная схема фракционирования. Ядра обогащены из цельного гомогената сердца с помощью градиента сахарозы. Каждый ядер образца может быть либо разделено на нуклеоплазму и моющих средств, извлеченных фракций или в переменномID-извлеченные фракции, которая обогащает для гистонов.
Рисунок 3. Одномерные гель различных фракций. 20 мкг целом лизат сердца (WHL), неповрежденные ядра (КНУ), нуклеоплазмы (ПНЕ), моющие средства экстрагируют хроматина (DE), и кислотно-извлеченного хроматина (AE) фракция мышь сердца проводились на одномерной SDS-PAGE гель (12% акриламида), наряду с кислотой извлеченный фракции хроматина из клеток HeLa и окрашивали Иволга. Различных паттерна обилие общего белка в различных молекулярных масс продемонстрировать существование уникального протеомов для разных подгрупп отсеков, включая обогащение нижней молекулярная масса гистонов в моющем экстракты хроматина, которые в дальнейшем обогащенный кислотой извлеченные фракции . Также следует отметить значительно менее сложным характером фракции AE от клетки HeLaа по сравнению с от сердца.
Рисунок 4. Относительное количественное обилие мышей из трех различных сердечных состояниях:. Базальные (синий) гипертрофия (красный) и неудачи (зеленый) были собраны в трех экземплярах и их образцы белка побежал в двух технических размножается LC / MS / MS. С левой являются моноизотопном пики для конкретного пептида (спектры которых показано справа). Относительная численность была рассчитана путем интеграции и среднее между повторов каждого фенотипического состояния (средняя панель), чтобы сравнить относительное содержание пептида (и белок, из которого она пришла) в различных состояниях сердечной недостаточности. На верхней панели показывает пептид из HMGB1, чьи обилие изменяется в болезни, в то время как нижняя панель (гистона Н4) не изменится. Нажмите, чтобы увеличить показатель .
Рисунок 5. Анализ главных компонент показывает, воспроизводимость. ANOVA анализ для каждой мыши (3 биологических повторяет / сердечного состояния х 2 технических повторов) построены для пептида интенсивности (оси) показывает, кластеризации болезненного состояния (базальной в синем, красном гипертрофии, отказ в зеленый цвет), которая указывает на успешное воспроизводимость массовых данных спецификации и значительные физиологические различия между различными болезненными состояниями.
Рисунок 6. Глобальная характеристика различных отсеков АПЛ. Мы определили 1048 уникальных белков, общая для всех 4 Шрдействия. 146 белков были общими для всех 4 фракции, по сравнению с 749 белков, выявленных в нуклеоплазму, 380 в моющем экстракты хроматина фракция, 426 в кислотно-извлеченного хроматина фракции, и 428 в интактных ядрах. Диаграммы Венна показывает умеренное перекрытие в определенных белков между фракциями, подчеркнув существование различных регионах в естественных условиях и способность этого фракционирования изолировать их. Кроме того, заметно неполной характеристике полного ядерного протеома достижимо лишь на анализе нефракционированного ядер (оранжевый) оправдывает дальнейшее фракционирование.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Два основных методов ядерной изоляции были рассмотрены ранее: 27 одно Беренс техники гомогенизации лиофилизированных тканей в неводных растворителей и второй, модификация, которую мы используем здесь, гомогенизации ткани в водный сахароза / солевой раствор следует дифференциальной или градиент плотности центрифугирования.
Subfractionation ядер кислотой добычи на образцах ткани является важным инструментом для изучения хроматина, который был использован с 1960 года, 28 с оригинальным цель состоит в том, чтобы проанализировать гистонов. Acid-экстракция протоколы были разработаны для этой цели очищения основных компонентов нуклеосомной гистонов 29 A ограничение этих предыдущих исследований является отсутствие информации о негистоновых белков составляющих и изменения, хроматин;. Мы обратились с этой проблемой текущего протокола Для характеристики различных биологических субфракций ядра и хроматина.Этот подход, который использует добычи моющего средства или кислотной экстракции хроматина в параллельном, показывает разнообразие хроматина регуляторных молекул и различие между уровнем эндогенного регулирования, тем самым служа надежным подходом к гипотезе поколения.
Применение установленных кислоты добычи методологии для взрослых миоцитов создает определенные препятствия, в том числе плотных цитоскелета и большой митохондриальной населения. В то время как версии кислоты добычи были использованы на все ткани сердца 30 эксперименты проводились целенаправленно изучать известных белков, текущий протокол разработан и выполнен с тем чтобы беспристрастный анализ протеома. Кроме того, мы обнаружили, что полезно для изучения моющих средств экстрагируют и кислотно-извлеченного хроматина отдельно (только 37% перекрытием наблюдается между протеомов из этих двух фракций), чтобы лучше понять динамику, через которые эти группы населения белков хроматина Interact с ДНК. Другие протоколы с использованием мочевины на основе буферов также были описаны, 31,32 которого, выполнена до кислоту добычи, обогащения белками менее тесно связаны с геномом. В дополнение к хроматина фракции, у других subfractionated ядра, чтобы изолировать ядрышка, 33, но subfractionation для масс-спектрометрического анализа инфаркта ядра изолированы от всего сердца не сообщалось.
Ружье протеомных исследований на интактных ядер, то есть нефракционированного органелл-были проведены на ткани миокарда использованием MudPIT подход. 15 Это исследование выявило 1044 ядерной сердечной белков, в том же масштабе, как наш протокол, однако они опирались на использование в среднем 8,5 повторяет, с каждого запуска продолжительностью 20 часов для обнаружения низких изобилие белков. В противоположность этому, мы использовали subfractionation, как увеличение числа идентифицировать белки (без необходимости длительного хромато-LC наших трасс 85 мин), а ввозаntly также предлагает дополнительную биологическую информацию о суб-ядерной локализации и относительное обилие белков.
От всего сердца мыши (примерно 0,14 г) мы возвращаемся примерно 1,2 мг (0,85% от общего числа) белка в интактных ядрах. Из нетронутыми ядер мы достигаем следующих восстановления для каждого из субфракций (Примечание: общая стоимость превышает 100%, поскольку кислоты добычи и моющие средства для экстракции делается на отдельных сердцах, а не в серии): нуклеоплазму (15%), моюще- извлекается хроматина (85%) и кислотно-извлеченного хроматина (54%). Для сравнения, Thermo Scientific имеется комплект (NE-PER ядра и цитоплазмы реагенты), которые их спецификации говорит дает 1.6mg цитозольных белков и 0,6 мг ядерного белка (1,5%) из 40 мг мыши сердце с 10% перекрестного заражения две фракции. Sigma имеет комплект (NXTRACT, CellLytic ядерной набора для экстракции), который они испытали на мышц кролика, но не сердцем, и оправился от 100 мг ткани 0,46 мг ядерного белка (0,46%) в том, что они называют их «примитивное ядерное гранулах» с «несколько процентов» цитоплазматических загрязнений. Другие компании, такие как Epigentek также предлагаем комплекты, однако мы не смогли найти конкретные данные по обогащению и чистоты на своих сайтах для сравнения.
Мы описали новую технику адреса текущей необходимостью для успешного обогащения сердечной ядер для протеомных исследований. Мы также описали методологию к югу фракционирования отсек, который, как увеличивается способность обнаруживать менее обильным белков, а также позволяет более высокое разрешение, количественной оценке и определении локализации белков. Для этого протокола для масс-спектрометрического анализа предлагает несколько рекомендаций, однако от случая к случаю соображений скорее всего, будет необходимо. Например, мы обнаружили, что большое число сердечных изоформ гистонов вариант с сходство последовательностей требует ручной проверки спектров назначить маДжор пики и подтвердить масса родительского иона прежде чем он сможет уверенно назначить спектров. 14 параметров поиска можно также настроить для пост-трансляционной модификации (PTM) выявление и отличные отзывы существуют подробные методы и проблемы с интерпретацией данных для анализа PTM (включая обогащение PTM , 34 программ для PTMs, 35 Анализ PTMs комбинаторной, 36 альтернативных стратегий фрагментации 37 и альтернативная пищеварения и обработки 38,39).
Обогащение и фракционирование описал от всего сердца (которая составляет 50-70% кардиомиоцитов по массе). Хотя это жертвы аспекты клеточной специфичности, который может быть особенно важно для некоторых семейств ядерных белков, это позволяет гораздо быстрее приостановлении белков в надлежащем буфера, что невозможно со взрослыми миоцитов протоколов изоляторе. Таким образом, эта методика лучше сохраняет целостность оF образца от деградации. Тем не менее, также описанные инструкции для применения этого протокола в изолированных неонатальных кардиомиоцитов желудочков крыс, так как оба изолированных клеток и целого организма моделей являются необходимыми инструментами для изучения сердечной недостаточности. В принципе этот метод может быть применен и к взрослым миоцитов экстрагируют фермент переваривания из изолированных сердцах с оговоркой, что изменения связывания с белками, которые происходят во время изоляции (который может длиться более часа) будут путать интерпретации протеомных наблюдений.
Мы разработали эту методику, чтобы понять изменения в ядерной протеома и хроматина макияж, которые способствуют заболевания. 14 Однако другие приложения включают изучение стимул-специфические изменения в состав протеома в нормальной физиологии. Кроме того, к югу от фракционирования предоставляет возможность для нового уровня характеристик, как работают белки и локализовать через различные функциональные области ядра.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Нет конфликта интересов объявлены.
Acknowledgments
Vondriska лаборатории при поддержке грантов от Национального института сердца, легких и крови NIH и Laubisch фонда в Лос-Анджелесе. EM является получателем Дженнифер С. Бухвальд стипендий в области физиологии в Лос-Анджелесе; HC является лауреатом Американской Ассоциации Сердца предварительного докторских стипендий; MP является получателем NIH Рут Kirschstein пост-докторские стипендии и SF является получателем NIH K99 Award.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dulbeco Modified Eagle Medium | Invitrogen | 11965 | |
| Protease pellet | Roche | 04 693 159 001 | |
| 100 μm strainer | BD Falcon | 352360 | |
| Ultracut ultramicrotome | Reichert | ||
| 100CX Transmission Electron Microscope |
JEOL USA, Inc. | ||
| Oriole | BioRad | 161-0496 | |
| Histone H2A antibody | Santa Cruz | sc-8648 | |
| Nucleoporin p62 antibody | BD Biosciences | 610498 | |
| Adenine nucleotide transporter antibody | Santa Cruz | sc-9299 | |
| BiP antibody | Santa Cruz | sc-1050 | |
| Tubulin antibody | Sigma | T1568 | |
| Histone H3 antibody | Abcam | ab1791 | |
| Fibrillarin antibody | Cell Signaling | C12C3 | |
| SNRP70 antibody | Abcam | ab51266 | |
| E2F-1 antibody | Thermo Fisher | MS-879 | |
| Retinoblastoma antibody | BD Biosciences | 554136 | |
| Hypoxia inducible factor-1 antibody | Novus Biologicals | NB100-469 | |
| BCA protein assay | Thermo Scientific | 23227 | |
| Reverse phase column | New Objective | PFC7515-B14-10 | |
| BioWorks Browser | Thermo Scientific |
References
- Li, F., Wang, X., Capasso, J. M., Gerdes, A. M. Rapid transition of cardiac myocytes from hyperplasia to hypertrophy during postnatal development. J Mol Cell Cardiol. 28, 1737-1746 (1996).
- Rumyantsev, P. P. Interrelations of the proliferation and differentiation processes during cardiact myogenesis and regeneration. Int Rev. Cytol. 51, 186-273 (1977).
- Olson, E. N., Schneider, M. D. Sizing up the heart: development redux in disease. Genes Dev. 17, 1937-1956 (2003).
- Molkentin, J. D., Dorn, G. W. 2nd Cytoplasmic signaling pathways that regulate cardiac hypertrophy. Annu Rev. Physiol. 63, 391-426 (2001).
- Fishman, M. C., Chien, K. R. Fashioning the vertebrate heart: earliest embryonic decisions. Development. 124, 2099-2117 (1997).
- Rajabi, M., Kassiotis, C., Razeghi, P., Taegtmeyer, H. Return to the fetal gene program protects the stressed heart: a strong hypothesis. Heart Fail Rev. 12, 331-343 (2007).
- Roger, V. L., et al. Heart disease and stroke statistics--2011 update: a report from the American Heart Association. Circulation. 123, e18-e209 (2011).
- Schirmer, E. C., Florens, L., Guan, T., Yates, J. R. 3rd, Gerace, L. Nuclear membrane proteins with potential disease links found by subtractive proteomics. Science. 301, 1380-1382 (2003).
- Lambert, J. P., Mitchell, L., Rudner, A., Baetz, K., Figeys, D. A novel proteomics approach for the discovery of chromatin-associated protein networks. Mol. Cell Proteomics. 8, 870-882 (2009).
- Malik, P., et al. Cell-specific and lamin-dependent targeting of novel transmembrane proteins in the nuclear envelope. Cell Mol Life Sci. 67, 1353-1369 (2010).
- Tweedie-Cullen, R. Y., Reck, J. M., Mansuy, I. M. Comprehensive mapping of post-translational modifications on synaptic, nuclear, and histone proteins in the adult mouse brain. J. Proteome Res. 8, 4966-4982 (2009).
- Chu, D. S., et al. Sperm chromatin proteomics identifies evolutionarily conserved fertility factors. Nature. 443, 101-105 (2006).
- Uchiyama, S., et al. Proteome analysis of human metaphase chromosomes. J. Biol. Chem. 280, 16994-17004 (2005).
- Franklin, S., et al. Specialized compartments of cardiac nuclei exhibit distinct proteomic anatomy. Mol. Cell Proteomics. 10, (2011).
- Kislinger, T., et al. Global survey of organ and organelle protein expression in mouse: combined proteomic and transcriptomic profiling. Cell. 125, 173-186 (2006).
- Moore, D. H., Ruska, H. Electron microscope study of mammalian cardiac muscle cells. J. Biophys Biochem. Cytol. 3, 261-268 (1957).
- Anversa, P., Vitali-Mazza, L., Visioli, O., Marchetti, G. Experimental cardiac hypertrophy: a quantitative ultrastructural study in the compensatory stage. J. Mol. Cell Cardiol. 3, 213-227 (1971).
- Franklin, S., et al. Specialized compartments of cardiac nuclei exhibit distinct proteomic anatomy. Mol Cell. Proteomics. 10, (2011).
- Paulsson, A. K., et al. Post-translational regulation of calsarcin-1 during pressure overload-induced cardiac hypertrophy. Journal of molecular and cellular cardiology. 48, 1206-1214 (2010).
- Franklin, S., et al. Quantitative analysis of the chromatin proteome in disease reveals remodeling principles and identifies high mobility group protein b2 as a regulator of hypertrophic growth. Mol Cell Proteomics. 11, (2012).
- Gramolini, A. O., et al. Comparative proteomics profiling of a phospholamban mutant mouse model of dilated cardiomyopathy reveals progressive intracellular stress responses. Mol Cell Proteomics. 7, 519-533 (2008).
- Singh, H., Warburton, S., Vondriska, T. M., Khakh, B. S. Proteomics to Identify Proteins Interacting with P2X2 Ligand-Gated Cation Channels. J. Vis. Exp. (27), e1178 (2009).
- Park, S. K., Venable, J. D., Xu, T., Yates, J. R. 3rd A quantitative analysis software tool for mass spectrometry-based proteomics. Nat. Methods. 5, 319-322 (2008).
- Lomenick, B., et al. Target identification using drug affinity responsive target stability (DARTS). Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 106, 21984-21989 (2009).
- Kamleh, A., et al. Metabolomic profiling using Orbitrap Fourier transform mass spectrometry with hydrophilic interaction chromatography: a method with wide applicability to analysis of biomolecules. Rapid Commun. Mass Spectrom. 22, 1912-1918 (2008).
- Searle, B. C. Scaffold: a bioinformatic tool for validating MS/MS-based proteomic studies. Proteomics. 10, 1265-1269 (2010).
- Murray, K. The Basic Proteins of Cell Nuclei. Annu Rev. Biochem. 34, 209-246 (1965).
- Johns, E. W., Phillips, D. M., Simson, P., Butler, J. A. Improved fractionations of arginine-rich histones from calf thymus. Biochem. J. 77, 631-636 (1960).
- Rodriguez-Collazo, P., Leuba, S. H., Zlatanova, J. Robust methods for purification of histones from cultured mammalian cells with the preservation of their native modifications. Nucleic Acids Res. 37, e81 (2009).
- Kuehl, L., Salmond, B., Tran, L. Concentrations of high-mobility-group proteins in the nucleus and cytoplasm of several rat tissues. J. Cell Biol. 99, 648-654 (1984).
- Gronow, M., Griffiths, G. Rapid isolation and separation of the non-histone proteins of rat liver nuclei. FEBS Lett. 15, 340-344 (1971).
- Mischke, B. G., Ward, O. G. Isolation and tissue specificity of chromatin-associated proteins in Vicia faba. Can J. Biochem. 53, 91-95 (1975).
- Andersen, J. S., et al. Directed proteomic analysis of the human nucleolus. Curr. Biol. 12, 1-11 (2002).
- Zhao, Y., Jensen, O. N. Modification-specific proteomics: strategies for characterization of post-translational modifications using enrichment techniques. Proteomics. 9, 4632-4641 (2009).
- Ahrne, E., Muller, M., Lisacek, F. Unrestricted identification of modified proteins using MS/MS. Proteomics. 10, 671-686 (2010).
- Young, N. L., Plazas-Mayorca, M. D., Garcia, B. A. Systems-wide proteomic characterization of combinatorial post-translational modification patterns. Expert Rev. Proteomics. 7, 79-92 (2010).
- Guthals, A., Bandeira, N. Peptide identification by tandem mass spectrometry with alternate fragmentation modes. Mol. Cell Proteomics. , (2012).
- Wu, C., et al. A protease for 'middle-down' proteomics. Nat. Methods. , (2012).
- Tran, J. C., et al. Mapping intact protein isoforms in discovery mode using top-down proteomics. Nature. 480, 254-258 (2011).
