Summary
Kütle spektrometresi gelişmeler dokuların bir dizi protein ifade ve modifikasyon yüksek verimlilik analizi sağladı. Subselüler fraksiyonasyon ve hastalık modelleri, spektrometresi ve biyoinformatik biyolojik sistemlerde yeni özellikleri ortaya çıkarabilir nicel kitle ile birlikte. Burada açıklanan yöntem, kalp hastalığı arasında bir ortamda kromatin ilişkili proteinlerin analiz eder ve diğer kolayca uygulanabilir
Abstract
Çekirdeğin içinde olan fonksiyonlar en yakından gen regülasyonu ile bağlantılı proteomlarda bulunur. Erişkin memeli kardiyomiyosit çekirdeklerinin nükleuslu hücrelerin oranı yüksek, 1 DNA ağırlıklı heterokromatik durumu nedeniyle benzersizdir ve geliştirme sırasında interfaz kalıcı bir devlet yetişkin çekirdekleri işler kardiyomiyosit-olmayan bölünmesi doğası. 2 Transkripsiyonal düzenleme ve Hastalığın sıra bu proteinlerin hastalığı sırasında meydana transkripsiyonel programları değişiklikleri kontrol nasıl bu organ, 3-5 okudu ama ne nispeten keşfedilmemiş kalır DNA paketlenmesi ve ifade sorumlu nükleer proteinler oynadığı rol ve oylandı. 6 geliştirilen yılında dünya, kalp hastalığı erkekler hem de kadınlar için ölüm bir numaralı nedenidir. nükleer proteinleri bu hastalığın ilerlemesini düzenleyen işbirliği nasıl 7 Insight güncel tedavi o ilerleyen için kritikeçenekler.
Kütle spektrometresi bu hastalıkla nasıl bu proteinlerin bolluğu değişiklikler için nükleer proteom ve göreli kantifikasyon tarafsız bir açıklama sağlayan bu soruların iletilebileceği ideal bir araçtır. Son zamanlara kadar memeli nükleer protein kompleksleri, 8-13 için çeşitli proteomik çalışmalar varken 14 kardiyak nükleer proteom inceleyen sadece bir çalışma olmuştur ve oldukça nükleer alt bölmeleri düzeyinde proteom keşfetmek yerine, tüm çekirdek olarak kabul . Büyük bir kısmı 15, bu iş sıkıntısı kardiyak çekirdeklerin tecrit zorluk kaynaklanmaktadır. Kardiyak çekirdekler miyosit daralma değiştiren kendi genel şekli. 16 Ayrıca, kardiyomiyositlerde hacmi 17 ile% 40 mitokondri olduğu ölçüde, onlar endoplazmik retikulum birden uzantıları aracılığıyla bağlı bir katı ve yoğun aktin-miyozin aygıtı içinde ortaya çıktığı Necessitadiğer organeller dışında çekirdeğin zenginleştirme tes. Burada biyolojik ilgili bölmeye kardiyak nükleer zenginleştirme ve daha fazla fraksiyonasyon için bir protokol açıklar. Ayrıca, metabolik etiketleme mümkün değildir çeşitli hayvan modelleri ve organ sistemleri in vivo deneyler için mükellef bu fraksiyonların-teknikleri etiketi ücretsiz kantitatif kütle spektroskopisi diseksiyon için detaylı yöntemleri.
Protocol
Deneysel akışı yedi önemli adımlar (Şekil 1). Kütle spektrometresi üzerinde çalıştırmak olacaktır örnekler içeren herhangi bir iş için, deneyci bir laboratuvar önlüğü, eldiven ve saç filesi giymek ve toz ve keratin kişisel dökülme kaynaklanan kontaminasyonu önlemek için özen göstermelisiniz.
1. Kalp Homojenizasyon ve Nükleer İzolasyon
Fare kalpleri homojenize edilir ve bir bozulmamış çekirdekler pelet (Şekil 2) izole edilir.
- , Yetişkin fare Kurban tüketim kalp, buz gibi soğuk PBS içinde yıkayın ve 2 ml içeren (biz Fisher Wheaton Doku Öğütücü, # 08-414-13A tercih, ancak diğer yöntemler eşit derecede iyi çalışır olabilir) cam Dounce buz üzerinde homojenize lizis tamponu (10 mM Tris, pH 7.5, 15 mM NaCI ve% 0.15 v / v Nonidet P-40 [NP-40], deiyonize su içinde artı (diferansiyel olarak çekirdek içeren organel üzerinde hücre zarı lysis oluşumunu hipotonik bir çözeltisi) proteaz ve fosfataz inhibitor karışım: 10 mM sodyum butirat, 0.1 mM phenylmethylsulfonyl fluorür [PMSF], 0.2 mM 3 VO 4, 0.1 mM NaF, 1 Roche proteaz pellet/10 ml, Na - lizis tamponu -20 ° C'de bir hafta kadar saklanabilir ). (Not: Biz kütle spektrometresi veri olarak, PBS ile kalpleri serpmek için gerekli bulmak ve analiz ağırlıklı kardiyomiyosit kan kontaminasyonu aksine kökenli [p-değeri 3.8E-22] [p değeri 5.0 olarak proteinleri tespit GO yok E-2].)
- 100 mikron süzgecinden lizat dökün ve 1.5 ml santrifüj tüp yoluyla akışını toplamak. Belirtilmediği sürece, bu noktada, örnek buz üzerinde tutulmalıdır.
- 4 ° C'de 5 dakika boyunca 4000 rpm'de santrifüje
- Süpernatantı. (Bu sitozolüne ve -80 saklanmalıdır ° C. parçalanan mitokondri içerir.) Yeniden süspanse pelet triturating tarafından 200 ul lizis tamponu. (Bu ham Nükleer pellet olduğunu.)
- Sakaroz buff 1 ml 1.5 ml'lik bir santrifüj tüpüne DolguER (% 24 sakaroz ağırlık / hacim, 10 mM Tris, pH 7.5, proteaz ve / fosfataz inhibitörü ile karışım deiyonize su içinde 15 mM NaCl - sakaroz tampon kullanımının gününde taze yapılmış olmalıdır). 4 ° C'de 10 dakika süreyle 5000 rpm'de santrifüj ve sakaroz ped üzerine yavaşça tabaka yeniden süspanse topak
- Üstüne ince bir film olarak sakaroz tampon (membran içeren) çıkarın. 200 ul buz gibi soğuk PBS / EDTA (1 mM EDTA ile 1 x PBS) ile geriye kalan topak durulayın. (Bu çekirdekler pelet ve blot batı veya elektron mikroskobu kullanımı için çözündüğünü veya sabit olabilir [adımları 4.1 ve 4.2 'ye bakınız] zenginleştirme ölçmek için.)
2. Çekirdek plazması ve Deterjan-ekstrakte kromatin Fraksiyonasyon
Ham topak gevşek çekirdekleri DNA ile ilişkili proteinler ihtiva eden bir çekirdek plazması ve deterjan ile ekstre kromatin fraksiyon ayrılır.
- 200 ul deterjan ekstraksiyon tamponu (2 adım 1.6 pelet Karışım0 mM HEPES pH 7.6, 7.5 mM MgCI2. 0.2 mM EDTA, 30 mM NaCl, 1 M üre,% 1 proteaz / fosfataz inhibitörü ile karışım deiyonize su içinde NP-40 - deterjan ekstraksiyon tampon çözeltisi) -20 ° C'de bir hafta için saklanır.
- Vortex örnek 2 kez, 10 sn her. Buz 10 dakika yerleştirin.
- 4 ° C'de 5 dakika boyunca 13,000 rpm'de santrifüje
- Süpernatantı. (Bu çekirdek plazması ve -80 ° C'de muhafaza edilmelidir). Buz gibi soğuk PBS / EDTA ile pelet durulayın. (Bu kromatin pelet olduğunu.)
- Tris, SDS, EDTA tampon azından bir hafta için hafızada saklanması - 300 ul Tris, SDS, EDTA tampon maddesi (50 mM Tris pH 7.4, 10 mM EDTA, proteaz / fosfataz inhibitörü ile karışım deiyonize su içinde% 1 SDS içinde pelet Karışım -20 ° C).
- 10 sn her DNA kırmak için 3-6 kez sonikasyon. Sonications arasındaki buz üzerinde örnek tutun.
- 4 ° C'de 5 dakika boyunca 13,000 rpm'de santrifüje Süpernatant tutun. (Süpernatant deterjan-Ayıklanan kromatin protein fractio olduğunun ve -80 ° C) sıcaklıkta muhafaza edilmelidir. Geri kalan topak az olmalıdır, ve atılabilir.
- % 10 fetal bovin serumu (FBS) ile Dulbecco'nun modifiye edilmiş Eagle ortamı (DMEM),% 1 insülin kültür ardından enzimatik sindirimi ile doğumdan hemen sonra yavruların sıçan bir gün neonatal fare ventriküler miyositlerde izolat yerine bütün izole edilmiş kalp miyositleri kullanılıyorsa transferrine sodyum selenit (ITS), ve% 1 penisilin. 24 saat sonra, serum serbest medya (yukarıdaki gibi aynı, ama FBS eksik) transfer. Hasat lizis tamponu hücreleri (1.1 listelenen), ve adım 1.3 nükleer fraksiyon başlar.
3. Asit-ekstraksiyon Fraksiyonu - DNA-bağlı protein Zenginleştirme
Histon gibi sıkıca DNA'ya bağlı proteinler için ayrı bir fraksiyon zenginleştirir.
- Adımları 1,1-2,4 tekrarlayın.
- 0,4 N sülfürik asit 400 ul kromatin pelet Karışım. Kümeleri kaldırmak için Vortex.
- 30 dk ya da overn için 4 ° C sıcaklıkta inkübeight dönerken.
- 4, 10 dakika için 16,000 x g'de santrifüjleyin ° C Nükleer tortularını çıkarmak üzere.
- Taze bir tüp supernatant aktarın.
- Trikloroasetik asit 132 ul süpernatanına açılan akıllıca ekleyin. Birkaç kez Invert. 30 dakika boyunca buz üzerinde inkübe edin.
- 4 ° C'de 10 dakika süreyle 16,000 x g'de santrifüjleyin
- Süpernatantı atın. Yavaşça buz aseton ile pelet durulayın. (Bu histon pelet olduğunu.)
- 4 ° C'de 10 dakika süreyle 16,000 x g'de santrifüjleyin
- Yıkama tekrarlayın, 3,8-3,9 adımları.
- Hava kuru pelet.
- Tris, SDS, EDTA tamponu ve 100 ul içinde pellet yeniden süspanse edin. 1 M Tris ilave edilerek pH 8 ayarlayın. (PH ayarlı olmayan bir 1 M Tris stoğu kullanın.)
- 15 dakika süreyle su banyosunda sonikasyon. Su banyosu, buz ekleyerek aşırı ısınmayı önleyin. (Bu asit-Ayıklanan fraksiyonu ve -80 ° C'de muhafaza edilmelidir)
4. Saflık Fiyatları
Western blot ve elektron mikroskobuçekirdekleri ve diğer organellerin tükenmesi başarılı zenginleştirme onaylayın. Aşağıdaki kalite kontrol testleri için tüm tipik sonuçlarını görmek için, bizim önceki yayın bakın. 18
- Western blot analizi gerçekleştirin. Histon H2A veya nucleoporin P62 (zenginleştirme doğrulamak için nükleer işaretleri gibi) ve adenin nükleotid taşıyıcı, bip ve tubulin (mitokondriyal bir işaretleyici, endoplazmik retikulum işaretleyici ve sırasıyla saflığını doğrulamak için sitoskeletal belirteç olarak) her fraksiyonu içeren Prob membran. Histon H3 veya fibrillarin (deterjan ve asit-Ayıklanan kromatin ve bozulmamış çekirdeği) ve SNRP70 veya E2F (çekirdek plazması) için çekirdekler, prob başarılı subfractionation doğrulamak için. Retinoblastom veya hipoksi indüklenebilir faktör-1 (asit-Ayıklanan fraksiyonu üzerinde deterjan-ekstre kromatin zenginleştirilmiş) için prob. HeLa hücre lizat ve bütün kalbi lizat Ek kontrol örnekleri de aynı jel çalıştırmak olabilir: Tris, SDS, ED ekleyerek HeLa hücre lizat kumandayı hazırlayınKültür çanak ve örnek toplamak için bir hücre kazıyıcı kullanarak TA tamponu. Sonikasyon ve adımları 2,6-2,7 olarak örnek santrifüj. 2 ml tampon (20 mM Tris pH 7.4, 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1 mM EGTA,% 1 Triton X-100, 2.5 mM sodyum pirofosfat, deiyonize su içinde 1 mM gliserofosfat olarak kalp homojenleştirici tarafından bütün kalp lisatı kontrol hazırlanması Proteaz ve fosfataz inhibitörü karışımı ile). Sonikasyon ve adımları 2,6-2,7 olarak santrifüj. SDS-PAGE protein örneklerinin hazırlanması için adım 5'e bakınız.
- Elektron Mikroskopi:% 2 gluteraldehit içeren lizis tamponu adım 1.6 çekirdekler pelletini tekrar ve 4 örnek düzeltmek ° C Osmik asit örnekleri durulayın, kurutmak ve epoksi reçine gömün. Bir Reichert ULTRACUT ultramicrotome kullanılarak 70 nm dilimleri kesin. JEOL 100CX Transmisyon Elektron Mikroskobu kullanılarak uranil asetat ve kurşun ve görüntü örnekleri Leke. Görüntülü malzemenin toplam alana karşı sağlam çekirdeklerin alanı ölçerek zenginleştirme ölçmek. Biz çekirdeklerin% 60-80 bulabilirsinizsağlam olması. 14.
Çekirdekler zenginleştirici karşı arındırıcı için önemli hususlar. Bu protokol hastalık sırasında genel gen düzenleme süreçlerine eğitim amacıyla kardiyak kromatin proteomik analizler için geliştirilmiştir. Bütün-proteom kütle spektrometresi deneyler tasarlama önemli bir bileşeni dinamik aralık ve düşük bolluk proteinleri tanımlamak ve karakterize etmek edememek konudur. Çekirdeklerin daha subfractionation yaptığı gibi nükleer proteom için zenginleştiren, nükleer ve kromatin özgü biyolojisi hakkında bilgi sağlama temel amacı ek olarak, bu düşük bolluk proteinleri tespit ihtimali artar. Tartışıldığı gibi Bununla birlikte, yetişkin kardiyomiyosit nükleer membran bağlanmış bir yoğun sitoskeletal bileşeni vardır. Biz tamamen bu diğer hücresel bileşenler çekirdekler saflaştırılmış olduğunu inanmıyorum. Ancak, çekirdeklerin sadece zenginleştirerek, biz elde vared analiz türlerini etkinleştirmek için kabul edilebilir eşik nitelendirdi.
Özellikle, bizim ham çekirdekler pelet saflığını değerlendirmek için EM kullanılmaktadır ve bozulmamış kabaca% 10 mitokondri çekirdeklerinin ve dinlenme enkaz olmak fraksiyonu% 60-80 bulduk. Ayrıca, sağlam çekirdeklerin nüfus önceki çalışmamızda, tanıdığımız birçok kas lifçikleriyle bu protokolün bazı proteinler (calsarcin-1) zenginleştirilmiş (Batı ile ölçülen tübülin ve aktin dahil), gerçek bir biyolojik nüfus önererek zenginleştirilmiş değil ise kardiyak çekirdeklerin bu proteinler. 19.
Buna ek olarak, bu gen ontoloji göre, bu proteinlerin tahmin rolleri, asit-Çıkartılan kromatin fraksiyonunda mevcut olduğu bulunmuştur proteinleri karşılaştırılmaktadır. Önemlisi, bu gen ontoloji analiz hesabı farklı proteinlerin göreceli bolluk (bizim Western blot verileri gibi) dikkate almaz değil, tespit edilen tüm proteinleri (zenginleştirmek sayareşit olarak ed veya değil) ortak yollar ve hücresel bölümlerin belirlenmesi. Bu yolların ve hücresel bölümlerin analizi bizim daha önceki yayınlarda bulunabilir. 18,20 En önemlisi, asit-Çıkartılan kromatin fraksiyonu içinde zenginleştirme başarısı bize erişkin fare histon miyosit 54 varyantlarının varlığı, 18 tespit izin birçoğu belirlenmesi için bir benzersiz peptid dayanıyordu ve bu zenginleştirme protokol toplam kardiyomiyosit proteom muazzam karmaşıklığı verilen olmadan böylece olasılıkla saptanabilir olmazdı. Bu, kardiyak atom çekirdeklerinden gelen tespit 1.048 proteinleri, n = 56 (% 5.3) nükleozom parçası (ilgi çekirdek bir bileşeni) olarak analiz GO açıklamalı edildi. Bütün kalp bakarak başka bir çalışmada, sadece 11 proteinler (% 0.18) nükleozom 21 parçası olmak için açıklamalı almış olup, 6.180 proteinler tanımlanmıştır. Bu, daha ileri meaningfu için protokol gücünü tariflly nükleer proteinler için zenginleştirmektedir.
5. Protein Jel ve Enzimatik Protein Digest
Proteinler kütle spektrometresi üzerinde çalıştırmak için sindirilmiş tek boyutlu SDS-PAGE ve tripsin ile ayrılır.
- Buz üzerinde örnekleri çözülme ve bicinchoninic asit (BCA) protein deneyi kullanılarak her numune için protein konsantrasyonu belirlenir.
- Tek boyutlu SDS-PAGE için -20 ° C 'de 10 dakika ve saklamak için 5x Laemmli tampon, kaynatma ile, bilinen bir konsantrasyon için örnekler seyreltilir. İki-boyutlu jeller için -20 ° C 'de üre ekstraksiyon tamponu ve depo ile, bilinen bir konsantrasyon için örnekler seyreltilir.
- Her kulvarda protein eşit miktarda yükleme seçim jel çalıştırın. Protein Western blotting (adımda olduğu gibi 4.1 'de kontrol grubu) ya da şeritler kütle spektrometri analizi için kesilmiş olabilir için kullanılmak üzere bir nitroselüloz zarına transfer edilebilir; aşağıdaki adımları bkz.
- Temiz bir kaba aktarmak için deiyonize su kullanılarak cihazdan jel çıkarın.Oriole jel leke ve ışık engellemek için alüminyum folyo ile sarın konteyner örtün. Jel en az 90 dakika süreyle bir çalkalayıcı üzerinde oda sıcaklığında inkübe izin verin.
- UV ışığı, ve bantlar görüntü üzerinde kesilecek işareti kullanarak Görüntü Oriole lekeli jel (Şekil 3). Biz toplam proteom ölçüm çalışmaları için yaklaşık 25 2 mm bantlar halinde her kulvarın kesti.
- Temiz bir yüzeye jel yerleştirin. Mühürlü tutulmuştur veya keratin kontaminasyonu engellemek için etanol ile püskürtülür sadece malzeme kullanın. Her band Kes, ve daha fazla 3 eşit parçaya dilimleyin. Kendi etiketli 1,5 ml tüp içine birlikte her grubun her üç parçalarını yerleştirin. Jel adet birkaç ay boyunca -20 ° C'de saklanabilir.
- Enzimatik sindirim için jel fişler hazırlayın. Özet jel parçalar 37 ° C'da gece boyunca tripsin kullanarak. Detaylı jel örneği protokolü için bizim önceki yayın bkz. 22. Sen tripsin yerine kimotripsin ile düşük molekül ağırlıklı bantları sindirebilir,histon kuyruklarının tripsin kapsamlı bölünme ortadan kaldırmak için.
6. Kütle Spektrometresi ve Veri Analizi
Örnekleri LC üzerinde ayrılır ve MS / MS ile analiz edilmiştir. Spektrumu protein tespiti için bir protein veri tabanı karşısında aranır.
- LC / MS / MS ile her bir örnek 10 ul çalıştırın. Biz 75 mikron ters faz kolon ile nano-akış Eskigent LC kullanın. Protein ve peptidlerin bir dizi için optimize LC işletilen kullanın. Mobil faz bir doğrusal gradyan çalıştırmak A (% 0.1 formik asit,% 2 su içinde asetonitril [ACN]), mobil faz B (% 0.1 formik asit, ACN içinde% 20 su):% 5 mobil fazB 50-60 dakika % B, daha sonra en az% 50, B% 95 B, 15 dakika% 95 ve sabit b, son olarak 10 dakika 200 nl / dak 'lık bir akış hızı kullanın. Bir veri bağımlı modunda kütle spektrometresi verileri edinin. Biz iyi 6 en bol ebeveyn iyonları parçaladı bir Thermo Orbitrap kullanın.
- Tekrar en az üç biyolojik için çalışır ve iki teknik çoğaltır. (Recommended)
- Bir arama algoritması (örneğin SEQUEST veya MASCOT gibi) aracılığı ile tercih Uniprot veritabanı karşı spektrumları aramak için; (kamuya açık seçenekleri Prowl dahil, X Tandem, SpectraST! Piyasada mevcut seçenekleri BioWorks ve Xcalibur dahil) yazılımını kullanın.
- Sistein carbamidomethylation ve metionin oksidasyonu, örnek işleme sırasında oluşturulan iki genel değişiklikler için izin vermek için arama parametrelerini değiştirerek düşünün.
- Ters veritabanı arama kullanarak bir yalancı pozitiflik oranı hesaplayınız.
- Bir eşik güven maçlar sadece kabul etmek için protein kimlik filtreleyin. Biz başlatmak için aşağıdaki parametreleri de tavsiye: Xcorr> 3 (+2),> 4 (+3),> 5 (+4); deltaCN> 0.1, uzlaşma skoru ≥ 20, ebeveyn iyon kütle toleransı 2 Da, kütle toleransı ürün iyon 0.5 Da, en az 2 benzersiz başına protein peptitleri ve en fazla 3 bölünmelere kaçırdı.
7. Etiket serbest Kantifikasyonu
Deteetiketsiz miktarının (Şekil 4) kullanılarak protein nispi bolluk rmine.
- Yazılım programları bir dizi sayımı (Prof. Yates grubu), 23 Elucidator (Microsoft), 24 elek (Thermo Scientific), 25 İskele (Proteome Software) dahil olmak üzere, kütle spektrometrisi verileri etiketsiz miktarının belirlenmesi için yayım ya da ticari olarak temin edilebilir. 26 Bu programlar, bozulmamış peptidler ya da iki ya da daha fazla durum arasında nispi bir protein miktarları ile peptid sıralama olayların sayısı, kütle spektrometrik sinyalin korelasyon amaçlamaktadır.
- Her bir program benzer bir analiz boru hattı içeriyor olsa da, bazı programları veri gerçekleştirilebilir spesifik analiz tipleri ile sınırlıdır. Başlangıçta, farklı ishal veri hizalanır, sinyal yoğunluğu normalize edilir ve peptid zirveleri analizi için seçilir.
- En yaygın iki yöntem spektral sayma veya LC-MS pik alanı esas miktar vardır. Bollukoranları farklı gruplar arasında peptit bereket değişiklikleri belirlemek için hesaplanır.
- Bu programlar protein tanımlama miktar bilgileri ilişkilendirmek için proteomik arama algoritmaları (Maskot, Sequest, X! Tandem) ile arabirim olabilir.
- Hem biyolojik (farklı deney örnekleri) ve teknik (kütle spektrometresi üzerinde birden çok kez aynı örnek çalışan) dahil etmek önemlidir verilerin doğruluğu ve tekrarlanabilirliği sağlamak için kitle spec veri çoğaltır.
- Ve deneysel koşullar arasında peptit bolluk değişimi ANOVA ile değerlendirildi ve PCA (Şekil 5) ile çizilebilir.
Etiket serbest ölçümü için önemli noktalar. Etiketi içermeyen niceliklendirme yaparken, özel önem her numune işleme ve ayrı ayrı analiz edilmelidir tutarlı örnek hazırlama, sindirim süresi ve LC-MS/MS koşulları sağlamak için verilmelidir. Met aksine(etiketleme eksikliği onları bir arada çalışan olasılığı ortadan kaldırır çünkü) abolic etiketleme yaklaşımlar, etiket içermeyen deneylerde karşılaştırmalar böylece (numune hazırlık yani, numune analizleri tüm yönleriyle yüksek tekrarlanabilirlik gerektiren, farklı kütle spektrometresi çalışan veri yapılır LC ve MS adım) ve yüksek kütle doğruluğu kütle spektrometre kullanımı.
Numune hazırlama ve analiz bilinen bir standart olarak küçük değişiklikler dikkate almak için verilerin normalleştirilmesi yardımcı olmak için her bir örnek için ilave edilebilir. Ayrıca, çoğu yazılım programları enjeksiyon, iyonizasyon ve parçalanma farklılıkları hesaba katmak için veri toplama sonra sinyal şiddetleri arasında normalleşme (arka plan gürültü veya bilinen bol analit ayarlayarak gibi) izin verir. Hizalama algoritması peptid elüsyon profilleri farklılıkları düzeltmek yardımcı yukarıda referans olarak yazılım programları çoğu bulunmaktadır. Biyolojik ve teknik çoğaltır kullanımı olup essenBu istatistiksel analizler protein bolluk içinde gözlenen değişikliklerin tekrarlanabilirlik ve tutarlılığını doğrulamak için izin vermesi, çalışmanın bu tip uzaysal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Şekil 4 Göreceli ölçüm bu formun programı vurgular. Sol paneldeki Gösterildi protein HMGB1 (veritabanı araması yoluyla tanımlanır) ait olarak atanmış tek tek izotoplu peptid zirveleri (farklı fareler bindirilmiş) vardır. Her bir tepe noktası, aslında belirli peptit için bir ekstre iyon kromatografisi, farklı bir fare gelir. Üç biyolojik her grup için tekrarlı, bazal, kardiyak hipertrofi ve kalp yetmezliği: grup üç farklı fizyolojik durumları temsil eder. Eğrinin altında kalan alan entegre edilmesiyle, bir nispi bolluk hesaplanabilir. Orta panel, bu yüzdeleri ortalama gösterilmiştir. Bu HMGB1 protein bolluk hastalığın seyri boyunca değişmekte olduğunu Bu tür analiz açıktır. Bunun tersine, alt paneller, hastalık ile değişmez histon H4 örneğini gösterir. Her iki durumda da, peptidler, aynı phenot hayvanlar gelenypic devletin numune hazırlama ve LC / MS / MS uyarlık gösteren, benzer elüsyon profilleri ve göreceli bolluk gösterir.
Bu tekniğin tekrarlanabilirliği daha temel bileşenler analizi (PCA) ile teyit edilir. Şekil 5'te gösterildiği gibi, analiz edilen her bir hayvanın toplam proteom sonuçlar varyans analizi uygulama aynı hayvan çoğaltır teknik arasındaki sıkı ilişki (farklı kütle spek aynı örnek olarak çalışır) ile kardiyak fenotip (biyolojik çoğaltır) tarafından ayrı bir kümelenme ortaya koymaktadır . Bu ilgi bireysel proteinlerin gözlenen bolluğu değişiklikler gerçekten fizyolojik durumu fark atfedilebilir olduğu güven sağlar.
Sonuçlarının ölçülmesi ve tekrarlanabilirlik kadar eşit önemde nükleer subfractionation tarafından etkinleştirilmiş nükleer proteom artan kapsama alanı. Şekil 6'nın bu analiz göstermektedir tek başına bütün çekirdek çift ayrı bölmelere (bozulmamış atom çekirdeklerinden gelen tespit 428 karşı fraksiyonlar elde edilen toplam tanımlanan 1.048 tek proteinler) tarafından bireysel analiz birleştirme sırasında tanımlanan nükleer proteinlerin çoğunluğu ortaya çıkarmak için başarısız olur. Buna ek olarak, farklı fraksiyonları arasındaki örtüşme orta ayrı ayrı fonksiyon ve nükleer gen regülasyonu ilave kavrama için göz önüne alındığında bu bölmelerin arasında biyolojik geçerliliğini göstermektedir. Son olarak, yeteneği özellikle damıtmak asit-ekstre veya histon gibi kilit kromatin yapısal proteinleri için kromatin zenginleştirir deterjan-ekstre, böylece bir protein grubunda daha odaklı kitle spektrometrik analizler (örneğin bu hedef translasyon sonrası modifikasyonlar gibi) etkinleştirmeden Her varyant ve izoformu için spesifik antikorlar gerektiren.
94fig1highres.jpg "src =" / files/ftp_upload/4294/4294fig1.jpg "/>
Şekil 1. Kardiyak nükleer denizaltıda bölümlerinde proteinlerin karakterizasyonu için akış şeması. Tüm fare kalpleri homojenize ve lizat çekirdeklerinin zenginleştirilmiştir. Çekirdekler çekirdek plazması, deterjan-Ayıklanan kromatin ve asit-Ayıklanan kromatin fraksiyonlara fraksiyonlaşma. Her bir proteinleri izole edilmiş ve tek boyutlu SDS-PAGE ile ayrılmış ve tripsin LC / MS / MS ile sindirilir ve çalıştırmak bantları. Edilir Veritabanı arama yaptıktan sonra, etiket-serbest ölçümü farklı fraksiyonları proteinler için bolca eğilimlerini tanımlamak için kullanılır.
Şekil 2. Nükleer fraksiyonlama şematik. Çekirdekler bir sükroz gradient aracılığıyla bütün kalbi homojenattan zenginleştirilmiştir. Her bir numune çekirdekler ya da çekirdek plazması ve deterjan ile ekstrakt edilen fraksiyonlar halinde ya da bir AC ayrılabilirid-Ayıklanan fraksiyonu olduğunu histon için zenginleştirir.
Şekil 3,. Farklı fraksiyonların Tek boyutlu jel. Bütün kalbi lizat 20 mikrogram (WHL), intakt çekirdekler (Nük), çekirdek plazması (UBP), fare kalp kromatin (DE) ve asit-Ayıklanan kromatin (AE) fraksiyonu deterjan-ekstre HeLa hücrelerinden asit-Ayıklanan kromatin fraksiyonu ile birlikte tek boyutlu SDS-PAGE jel (% 12 akrilamid) üzerinde çalışan ve Oriole ile boyandı. Çeşitli molekül ağırlıklarında toplam proteinin bolluğu farklı desenler daha fazla asit-Çıkartılan fraksiyonları içinde zenginleştirilmiş olan deterjan-çıkartılan kromatin olarak düşük moleküler ağırlıklı histon için zenginleştirme dahil olmak üzere, farklı alt bölmeler için eşsiz proteomlarda varlığını göstermek . Ayrıca not HeLa hücre AE fraksiyonu önemli ölçüde daha az karmaşık doğasıs kalp ile karşılaştırıldığında.
Şekil 4. Bağıl bolluk ölçümü üç farklı kardiyak devletlerin Fare:. Bazal (mavi) hipertrofisi (kırmızı) ve başarısızlık (yeşil) üç nüsha halinde toplanan ve protein örneklerinin LC / MS / MS ile çoğaltır iki teknik koştu. Belirli bir peptid (olan spektrumu sağ tarafta gösterilmektedir) için tek izotoplu pik olarak solda gösterilmiştir. Bağıl bolluk entegrasyonu ile hesaplanmakta ve kalp yetmezliği farklı ülkelerinde peptidin göreceli bolluk (ve geldiği proteini) karşılaştırmak için her fenotipik devlet (orta panel) çoğaltır arasındaki ortalama edildi. Alt panel (Histon H4) değişmez iken üst paneli, bolluk hastalıkta değiştirilmiş HMGB1, bir peptit gösterir. büyük bir rakam görmek için buraya tıklayın .
Şekil 5,. Temel bileşenler analizi tekrarlanabilirliği ortaya koymaktadır. Peptid yoğunluğu (eksen) için çizilen her fare için varyans analizi (3 / biyolojik kalp devlet x 2 teknik çoğaltır çoğaltır), (yeşil kırmızı mavi bazal, hipertrofi, başarısızlık) hastalığı devlet tarafından kümelenme gösterir kütle spek veri ve farklı hastalık durumları arasında anlamlı farklılıklar fizyolojik başarılı tekrarlanabilirlik göstermektedir.
Şekil 6. Belirgin nükleer denizaltıda bölmelerin Küresel karakterizasyonu. Hepimiz 4 fr çapında 1.048 toplam benzersiz proteinleri tespiteylemler. 146 proteinler çekirdek plazması içinde belirlendi 749 proteinleri, deterjan-Çıkartılan kromatin fraksiyonu 380, asit-Çıkartılan kromatin fraksiyonu 426, ve bozulmamış çekirdekler içinde 428 ile karşılaştırıldığında, tüm fraksiyonlar 4 tarafından paylaşılan edildi. Venn diyagramı vivo ve onları izole etmek için bu ayırma yeteneği belirgin bölgelerin varlığını vurgulayarak, fraksiyonları arasındaki tespit proteinler ılımlı örtüşme gösteriyor. Ayrıca, yalnızca fraksiyonlanmamış çekirdekler (turuncu) analiz ederek başarılabilir toplam nükleer proteomun belirgin eksik karakterizasyonu daha fraksiyonasyon haklı.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Nükleer izolasyonu için iki temel yolu önceden gözden geçirilmiştir: 27 tek bir sulu sakaroz / tuz çözeltisi içinde doku homojenleştirici bir sulu olmayan çözücü içinde liyofilize doku homojenleştirici arasında Behrens teknik ve ikinci olarak, burada kullanımı olan bir değişiklik, bir izlenen diferansiyel veya yoğunluk gradiyenti santrifüj yoluyla.
Doku örnekleri asit ekstraksiyon ile çekirdeklerin Subfractionation histon analiz olmanın orijinal amacı ile 1960, 28 beri kullanılmaktadır kromatin eğitim için önemli bir araçtır. Asit-ekstraksiyon protokolleri çekirdekli nucleosomal histon bileşenleri arındırıcı bu amaç için geliştirilen 29 bu önceki çalışmaların bir sınırlaması olmayan histon proteinleri oluşturan ve kromatin değiştirme hakkında bir bilgi bulunmaması olduğunu;. Biz mevcut protokol ile bu sorunu ele almışlardır nukleus ve kromatin farklı biyolojik altfraksiyonları karakterize.Paralel deterjan ekstraksiyon veya kromatin asit ekstraksiyonu kullanan bu yaklaşım, kromatin düzenleyici moleküller çeşitliliğini ortaya çıkarır ve dolayısıyla hipotez üretimi için güçlü bir yaklaşım olarak hizmet veren, endojen düzenleme düzeyleri birbirinden ayırır.
Yetişkin miyosit için kurulan asit ekstraksiyon yöntemi uygulamak yoğun hücre iskeleti ve büyük mitokondriyal nüfusu dahil, bazı engeller oluşturmaktadır. Asit ekstraksiyon sürümleri bütün kalp dokusu 30. kullanılmış iken deneyler denilen proteinler okumak için hedeflenmiş bir şekilde yürütülmüştür; geçerli protokol tasarlanmıştır ve tarafsız proteom analizleri etkinleştirmek için idam edilmiştir. Ayrıca, deterjan-ekstre ve asit-Ayıklanan kromatin ayrı (sadece% 37 örtüşme bu iki fraksiyonların proteomlarda arasında gözlenmiştir) iyi dinamiklerini anlamak için incelemenin yararlı buldu hangi aracılığıyla kromatin proteinleri int bu popülasyonlarınDNA ile eract. Üre bazlı tamponlar kullanılarak başka protokoller de, asit ekstraksiyonu önce gerçekleştirilir, daha az sıkı bir şekilde genomuna bağlı proteinler zenginleştirmek, 31,32 tarif edilmiştir. Kromatin fraksiyonlar ek olarak, diğer subfractionated çekirdekçik izole etmek için çekirdek, 33 fakat bütün kalpler izole miyokardiyal nüve kütle spektrometresi ile analiz için subfractionation sahip rapor edilmemiştir.
Üzerine Shotgun proteomik çalışmalar sağlam çekirdekler-yani, fraksiyone olmayan organeller-oylandı Bir mudpit yaklaşım kullanarak miyokard dokusu üzerinde yapılmıştır. 15. Bu çalışma, 1,044 nükleer kardiyak proteinleri tespit aynı ölçekte bizim protokol olarak, ancak onlar bir ortalama kullanarak dayanmıştır 8.5 düşük bolluk proteinleri tespit etmek için 20 saat süren her çalışma ile çoğaltır. Buna karşılık, bu süre importa (uzun kromatografi-bizim LC çalışır 85 dakikaya kadardır gerekmeden) iki artış tanımlanabilir protein sayısına karşı, kullanılan subfractionationntly ayrıca alt-nükleer lokalizasyon ve proteinlerin göreceli bolluk hakkında ek biyolojik bilgiler sunuyor.
Bir bütün fare kalbinde (yaklaşık 0.14 g) biz sağlam çekirdeklerin protein yaklaşık 1.2 mg (toplam% 0,85) kurtarabilirsiniz. Gönderen Sağlam çekirdekler itibaren biz altfraksiyonları her biri için aşağıdaki kurtarma ulaşmak (Not: asit ekstraksiyon ve deterjan-ekstraksiyon ayrı kalpleri değil, seri olarak yapılır gibi toplam değerleri% 100'ü): çekirdek plazması (% 15), deterjan- kromatin (% 85), ve asit Çıkartılan kromatin (% 54) ekstrakte edildi. Buna karşılık, Thermo Scientific kendi veri sayfası% 10 çapraz kontaminasyon ile arası fare kalp 40 mg verimleri 1.6mg sitozolik protein ve 0.6 mg nükleer protein (% 1.5) diyor bir kit (Nükleer ve sitoplazmik Reaktifler NE-PER) vardır İki fraksiyon. Sigma onlar tavşan kasında sınanmıştır kiti (NXTRACT, CellLytic nükleer çıkarma Takımı), ama kalbi var, ve 100 mg doku 0,4 kurtarıldıOnlar sitoplazmik kirlenme "birkaç yüzde" ile "ham Nükleer pellet" olarak adlandıracağım ne nükleer protein 6 mg (% 0.46). Böyle Epigentek gibi diğer şirketler de kitleri sunmaktadır, ancak biz karşılaştırma için kendi web sitelerinde zenginleştirme ve saflığı ile ilgili özel ayrıntılar bulmak için koyamadık.
Biz proteomik çalışmalar için kardiyak çekirdeklerin başarılı zenginleştirmek için mevcut ihtiyaç adresleri için yeni bir tekniği tanımladılar. Biz daha az bol proteinlerin yanı sıra yüksek çözünürlük, miktar ve protein lokalizasyonunun belirlenmesi için izin algılama yeteneği artar hem alt bölmesi fraksiyonasyon için metodoloji açıklanmaktadır. Bu amaçla, kütle spektrometrisi analiz için protokol tavsiye edilen kurallar Ancak duruma göre durum hususlar muhtemelen gerekli olacaktır sunmaktadır. Örneğin, biz spektrumları dizisi benzerliği gereken elle muayene ile kalp histon varyant izoformlarının sayıda ma atamak bulundujor zirveleri ve güvenle spektrumları atamak edememek önce ebeveynin iyon kütle onaylayın. 14. Arama parametreleri de post-translasyonel modifikasyonu (PTM) tanımlama ve mükemmel değerlendirmeleri için özelleştirilebilir PTM analizi (PTM zenginleştirme dahil verileri yorumlama ile ayrıntılı yöntemler ve endişeleri var , FTM için 34 yazılım, kombinatoryal FTM, 36 alternatif parçalanma stratejileri 37 ve alternatif sindirim ve işleme 38,39) 35 analizi.
Açıklanan zenginleştirme ve fraksiyonlama bütün kalbi (hangi kütlece% 50-70 kardiyomiyosit ise) mesafededir. Hücre özgüllük bu kurban açıdan nükleer proteinlerin bazı ailelerde için özellikle önemli olabilir iken, yetişkin miyosit hücre izolasyon protokolleri ile mümkün değildir uygun tamponlar, içine proteinlerin bir çok daha hızlı bir süspansiyon sağlar. Bu şekilde, bu yöntem daha iyi bütünlük o korurf bozulmaya karşı örnek. Ancak, açıklanan her iki izole hücre ve tüm organizmanın modelleri kalp yetmezliği çalışmak için gerekli araçları olduğundan, izole yenidoğan sıçan ventrikül miyositler için bu protokolü uygulamak için talimatları vardır. Prensip olarak bu yöntem ayrıca izole edilmiş kalpleri-ile ikaz izolasyon (yaklaşık bir saat boyunca sürebilir olan) sırasında meydana gelen protein bağlayıcı değişiklikler proteomik gözlemler yorumlanmasına neden olur ki ikinci enzimi özümlemesi ile ekstre yetişkin miyositler için uygulanabilir.
Biz hastalığı katkıda nükleer proteom ve kromatin makyaj değişiklikleri anlamak için bu yöntemi geliştirdi. 14. Ancak diğer uygulamalar normal fizyoloji proteom kompozisyon uyaran özgü değişiklikler okuyor içerir. Ayrıca, alt fraksiyonasyon proteinlerin çekirdeğin farklı fonksiyonel bölgelere işletmek ve yerelleştirilmesine nasıl karakterizasyonu yeni bir düzey için yeteneği sunar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Çıkar çatışması ilan etti.
Acknowledgments
Vondriska laboratuar NIH ve UCLA Laubisch Endowment Ulusal Kalp, Akciğer ve Kan Enstitüsü hibe tarafından desteklenmektedir. EM UCLA Fizyoloji Jennifer S. Buchwald Graduate Fellowship alıcısı olduğunu; HC Amerikan Kalp Derneği Pre-doktora bursu sahibidir; MP bir NIH Ruth Kirschstein Doktora Sonrası Bursu alıcı olması ve SF alıcısı bir NIH K99 Ödülü.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dulbeco Modified Eagle Medium | Invitrogen | 11965 | |
| Protease pellet | Roche | 04 693 159 001 | |
| 100 μm strainer | BD Falcon | 352360 | |
| Ultracut ultramicrotome | Reichert | ||
| 100CX Transmission Electron Microscope |
JEOL USA, Inc. | ||
| Oriole | BioRad | 161-0496 | |
| Histone H2A antibody | Santa Cruz | sc-8648 | |
| Nucleoporin p62 antibody | BD Biosciences | 610498 | |
| Adenine nucleotide transporter antibody | Santa Cruz | sc-9299 | |
| BiP antibody | Santa Cruz | sc-1050 | |
| Tubulin antibody | Sigma | T1568 | |
| Histone H3 antibody | Abcam | ab1791 | |
| Fibrillarin antibody | Cell Signaling | C12C3 | |
| SNRP70 antibody | Abcam | ab51266 | |
| E2F-1 antibody | Thermo Fisher | MS-879 | |
| Retinoblastoma antibody | BD Biosciences | 554136 | |
| Hypoxia inducible factor-1 antibody | Novus Biologicals | NB100-469 | |
| BCA protein assay | Thermo Scientific | 23227 | |
| Reverse phase column | New Objective | PFC7515-B14-10 | |
| BioWorks Browser | Thermo Scientific |
References
- Li, F., Wang, X., Capasso, J. M., Gerdes, A. M. Rapid transition of cardiac myocytes from hyperplasia to hypertrophy during postnatal development. J Mol Cell Cardiol. 28, 1737-1746 (1996).
- Rumyantsev, P. P. Interrelations of the proliferation and differentiation processes during cardiact myogenesis and regeneration. Int Rev. Cytol. 51, 186-273 (1977).
- Olson, E. N., Schneider, M. D. Sizing up the heart: development redux in disease. Genes Dev. 17, 1937-1956 (2003).
- Molkentin, J. D., Dorn, G. W. 2nd Cytoplasmic signaling pathways that regulate cardiac hypertrophy. Annu Rev. Physiol. 63, 391-426 (2001).
- Fishman, M. C., Chien, K. R. Fashioning the vertebrate heart: earliest embryonic decisions. Development. 124, 2099-2117 (1997).
- Rajabi, M., Kassiotis, C., Razeghi, P., Taegtmeyer, H. Return to the fetal gene program protects the stressed heart: a strong hypothesis. Heart Fail Rev. 12, 331-343 (2007).
- Roger, V. L., et al. Heart disease and stroke statistics--2011 update: a report from the American Heart Association. Circulation. 123, e18-e209 (2011).
- Schirmer, E. C., Florens, L., Guan, T., Yates, J. R. 3rd, Gerace, L. Nuclear membrane proteins with potential disease links found by subtractive proteomics. Science. 301, 1380-1382 (2003).
- Lambert, J. P., Mitchell, L., Rudner, A., Baetz, K., Figeys, D. A novel proteomics approach for the discovery of chromatin-associated protein networks. Mol. Cell Proteomics. 8, 870-882 (2009).
- Malik, P., et al. Cell-specific and lamin-dependent targeting of novel transmembrane proteins in the nuclear envelope. Cell Mol Life Sci. 67, 1353-1369 (2010).
- Tweedie-Cullen, R. Y., Reck, J. M., Mansuy, I. M. Comprehensive mapping of post-translational modifications on synaptic, nuclear, and histone proteins in the adult mouse brain. J. Proteome Res. 8, 4966-4982 (2009).
- Chu, D. S., et al. Sperm chromatin proteomics identifies evolutionarily conserved fertility factors. Nature. 443, 101-105 (2006).
- Uchiyama, S., et al. Proteome analysis of human metaphase chromosomes. J. Biol. Chem. 280, 16994-17004 (2005).
- Franklin, S., et al. Specialized compartments of cardiac nuclei exhibit distinct proteomic anatomy. Mol. Cell Proteomics. 10, (2011).
- Kislinger, T., et al. Global survey of organ and organelle protein expression in mouse: combined proteomic and transcriptomic profiling. Cell. 125, 173-186 (2006).
- Moore, D. H., Ruska, H. Electron microscope study of mammalian cardiac muscle cells. J. Biophys Biochem. Cytol. 3, 261-268 (1957).
- Anversa, P., Vitali-Mazza, L., Visioli, O., Marchetti, G. Experimental cardiac hypertrophy: a quantitative ultrastructural study in the compensatory stage. J. Mol. Cell Cardiol. 3, 213-227 (1971).
- Franklin, S., et al. Specialized compartments of cardiac nuclei exhibit distinct proteomic anatomy. Mol Cell. Proteomics. 10, (2011).
- Paulsson, A. K., et al. Post-translational regulation of calsarcin-1 during pressure overload-induced cardiac hypertrophy. Journal of molecular and cellular cardiology. 48, 1206-1214 (2010).
- Franklin, S., et al. Quantitative analysis of the chromatin proteome in disease reveals remodeling principles and identifies high mobility group protein b2 as a regulator of hypertrophic growth. Mol Cell Proteomics. 11, (2012).
- Gramolini, A. O., et al. Comparative proteomics profiling of a phospholamban mutant mouse model of dilated cardiomyopathy reveals progressive intracellular stress responses. Mol Cell Proteomics. 7, 519-533 (2008).
- Singh, H., Warburton, S., Vondriska, T. M., Khakh, B. S. Proteomics to Identify Proteins Interacting with P2X2 Ligand-Gated Cation Channels. J. Vis. Exp. (27), e1178 (2009).
- Park, S. K., Venable, J. D., Xu, T., Yates, J. R. 3rd A quantitative analysis software tool for mass spectrometry-based proteomics. Nat. Methods. 5, 319-322 (2008).
- Lomenick, B., et al. Target identification using drug affinity responsive target stability (DARTS). Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 106, 21984-21989 (2009).
- Kamleh, A., et al. Metabolomic profiling using Orbitrap Fourier transform mass spectrometry with hydrophilic interaction chromatography: a method with wide applicability to analysis of biomolecules. Rapid Commun. Mass Spectrom. 22, 1912-1918 (2008).
- Searle, B. C. Scaffold: a bioinformatic tool for validating MS/MS-based proteomic studies. Proteomics. 10, 1265-1269 (2010).
- Murray, K. The Basic Proteins of Cell Nuclei. Annu Rev. Biochem. 34, 209-246 (1965).
- Johns, E. W., Phillips, D. M., Simson, P., Butler, J. A. Improved fractionations of arginine-rich histones from calf thymus. Biochem. J. 77, 631-636 (1960).
- Rodriguez-Collazo, P., Leuba, S. H., Zlatanova, J. Robust methods for purification of histones from cultured mammalian cells with the preservation of their native modifications. Nucleic Acids Res. 37, e81 (2009).
- Kuehl, L., Salmond, B., Tran, L. Concentrations of high-mobility-group proteins in the nucleus and cytoplasm of several rat tissues. J. Cell Biol. 99, 648-654 (1984).
- Gronow, M., Griffiths, G. Rapid isolation and separation of the non-histone proteins of rat liver nuclei. FEBS Lett. 15, 340-344 (1971).
- Mischke, B. G., Ward, O. G. Isolation and tissue specificity of chromatin-associated proteins in Vicia faba. Can J. Biochem. 53, 91-95 (1975).
- Andersen, J. S., et al. Directed proteomic analysis of the human nucleolus. Curr. Biol. 12, 1-11 (2002).
- Zhao, Y., Jensen, O. N. Modification-specific proteomics: strategies for characterization of post-translational modifications using enrichment techniques. Proteomics. 9, 4632-4641 (2009).
- Ahrne, E., Muller, M., Lisacek, F. Unrestricted identification of modified proteins using MS/MS. Proteomics. 10, 671-686 (2010).
- Young, N. L., Plazas-Mayorca, M. D., Garcia, B. A. Systems-wide proteomic characterization of combinatorial post-translational modification patterns. Expert Rev. Proteomics. 7, 79-92 (2010).
- Guthals, A., Bandeira, N. Peptide identification by tandem mass spectrometry with alternate fragmentation modes. Mol. Cell Proteomics. , (2012).
- Wu, C., et al. A protease for 'middle-down' proteomics. Nat. Methods. , (2012).
- Tran, J. C., et al. Mapping intact protein isoforms in discovery mode using top-down proteomics. Nature. 480, 254-258 (2011).
