Summary
방법은의 hemocoel에 entomopathogenic 박테리아의 직접 분사을 이용하여 여기에서 설명한
Abstract
일반적으로 담배 hornworm으로 알려진 Manduca sexta는, 담배, 토마토 등의 solanaceous 식물에 공급, 상당한 농업 해충으로 간주됩니다. M.의 민감도 entomopathogenic 박테리아 종 1-5,뿐만 아니라 곤충의 면역 체계 6-8에 대한 사용 가능한 정보의 부의 다양한 sexta의 유충, 그리고 보류중인 게놈 시퀀스 9는 호스트 미생물의 상호 작용을 연구에 사용에 대한 좋은 모델 생물 확인 pathogenesis 중. 또한, M. sexta의 애벌레는 다른 민감한 곤충 종의 실험실 상대적으로 조작 및 유지 관리가 비교적 크고 용이합니다. 그들의 대형도 감염에 대한 호스트 응답의 분석을위한 효율적인 조직 / hemolymph 추출을 용이하게한다.
여기에 제시된 방법은 M.의 hemocoel에 박테리아의 직접 분사 (혈액 캐비티)에 대해 설명합니다 sexta의 애벌레. 이 방법단순히 주사 후 곤충 죽음에 시간을 모니터링하여 다양한 세균 종, 변종, 또는 돌연변이의 독성 특성을 분석하고 비교하는 데 사용할 수 있습니다. 이 방법은 일반적으로 곤충에 항목을 얻을 수있는 수단으로 선충류 벡터와 연결 Xenorhabdus 및 Photorhabdus 종의 pathogenicity을 연구하기 위해 개발되었습니다. Entomopathogenic의 nematodes은 일반적으로 자연 소화 나 호흡 구멍을 통해 애벌레를 감염, 그리고 곤충 hemolymph (혈액) 즉시 (10) 내로의 공생 박테리아 내용을 놓습니다. 여기에 설명 된 분사 방법은 따라서 곤충에 박테리아와 선충류의 효과를 uncoupling, 선충류 벡터의 필요성을 무시합니다. 이 방법은 nicking 11 구두 독성 assays 12을 포함 entomopathogenesis을 분석하는 기존의 다른 방법을 사용 불가능 inoculum, 내 전염성 물질의 정확한 열거 (전지 또는 단백질)을 할 수 있습니다 여기에 설명 된대로 직접 분사 방식의 유틸리티는 곤충 사망률을 모니터링하여 세균 pathogenesis를 분석하는 것입니다. 그러나,이 방법은 쉽게 M.에 감염의 효과를 연구에 사용하기 위해 확장 할 수 있습니다 sexta 면역 시스템입니다. 벌레가 체액과 세포 반응 모두를 통해 감염에 응답합니다. 체액 반응은 박테리아 - 관련 패턴 인식 등 다양한 항균 펩티드의 후속 생산 7이 포함되며, 이러한 펩티드를 인코딩 유전자의 표현은 RNA 추출 및 정량 PCR 13을 통해 직접 감염 이후에 모니터링 할 수 있습니다. 감염에 대한 세포 반응은 유괴, 캡슐화, 그리고 hemocytes 6 전염성 대리인의 phagocytosis를 포함 13, 14으로 시각화 할 수 있습니다.
Protocol
1. 곤충 달걀 살균 및 양육
- 900-1,000 ML H 2 O.에서 제공되는 한천의 첫 autoclaving 15g으로 음식을 준비 즉시 잘 실험실 믹서기에서 166g의 밀 배아식이 요법과 조화를 이루고있는 autoclaving, 혼합. 4에 알루미늄 호일에 음식을 전송 한 후 냉각 할 수있는 요리 (또는 요리)에 넣어, 단단히 포장 및 저장 ° C.
- 도착시, M. 멸균을 때때로 교반 90mm 필터 종이 유리 필터 홀더와 진공 플라스크 장치에서 2-3 분에 0.6 %의 표백제 솔루션 250 ML과 sexta 달걀.
- 세탁 당 250 ML 멸균 증류수 H 2 O로 표백 솔루션과 세척 계란 3-4 회를 배출하는 진공을 사용합니다.
- 페트리 접시 뚜껑에 배치 신선한 90mm 필터 종이에 계란을 전송하고 건조 할 수 있도록 할 때까지 함께 그들은 더 이상 스틱 (20-30 분 정도).
- 각 용기에 약 40 알을 배치, 곤충 음식을 플라스틱 용기의 바닥에 달걀을 전송(그림 1A). 달걀은 습기 유발 곰팡이 오염을 방지하기 위해식이 요법과 구분됩니다. 8 시간 짙은의 photoperiod : 16 시간의 빛으로 26 알 ° C를 유지합니다. 계란은 부화하기 전에 노란색 - 흰색으로 밝게합니다.
- 부화가 완료되면 조심스럽게 아래 (그림 1B)에 다이어트를 통해 새로운 용기로 약 25 애벌레를 각각 전송합니다. 그것은 자신의 약한 초기 개발 단계에서 그들에게 손상을주지 않도록 집게를 사용하여 긴 검은 뿔 각 유충을 데리러하는 것이 중요합니다. 위와 같이 2 일 품다. 애벌레의 죽음이이 단계에서 특이한이지만, 죽은, 또는 가능성, 발달 저하 애벌레가 관찰 될 수 있습니다. 이러한 곤충들은 더 연구에서 제외하고 냉동 희생해야합니다.
- 사람을 잡아 먹는 행동, 음식의 작은 조각 (그림 1C)과 개별 용기에 전송 애벌레를 피 이상으로 품다합니다. 곤충 개발을 모니터링, 음식을 교체 및 청소 배설물은 으세요매일 컨테이너의 t가 세 번째 애벌레의의 털을 갈다 (보통 6-9일 부화 후) 받아야까지. 이 곤충 몸 (그림 1D)를 따라 줄무늬의 각 proleg 및 증가 부각에 검은 색 훅 같은 crochets의 모습을 특징으로, 4 일 instar 애벌레의 단계입니다. 애벌레의 크기는 상당히 다양하지만, 일반적으로 4 번째 instar 단계를 입력시 0.15-0.4 g 무게 수 있습니다. 유사한 크기의 애벌레가 분사에 대한 선택해야합니다.
2. 사출에 대한 박테리아의 작성
- 당신은 테스트하고자하는 성장 단계에 표준 절차에 따라 테스트 할 수있는 박테리아 변종 (들)을 성장.
- 각 박테리아 스트레인의 펠렛 500 μl은 실온에서 13,000 rpm으로 microcentrifuge에서 2 분 동안 회전하여 테스트 할 수 있습니다.
- 한 ML 멸균 1X 인산염의 Resuspend 세포가 위 다시 생리 버퍼 (PBS) 및 펠릿.
- 0.5 ML 멸균 1X PBS 및 MEA에 Resuspend 세포정지 있는지 광학 밀도 (OD). 필요한 경우, 동일한 OD에 대한 모든 정지를 희석. 원하는 경우 멸균 성장 매체는 또한 1X PBS 대신에 세포 resuspension 및 희석에 사용할 수 있습니다.
3. 제 4 회 Instar의 애벌레의 주입
- 각 희석에 대한 새로운 피펫 팁을 사용하여 멸균 1X PBS에서 96 잘 microtiter 플레이트 6 우물에서 처음으로 세균 변형의 일련 10 배 dilutions (그림 2A)를 준비합니다. 각 잘에 세포 현탁액의 최종 볼륨이 분사 (곤충 당 10 μl) 플러스 판 20 μl inoculum (단계 3.2 3.7 참조)에 필요한 볼륨을 초과해야합니다.
- 적절한 성장 매체를 포함하는 페트리 접시 상단의 5 dilutions (10 -6까지 10 -2)에 대한 현장 10 μl 각. 장소는 중앙 (그림 2B)으로 확산되도록 판을 기울입니다.
- 에 얼음 용기에 곤충식이 요법과 배설물 및 장소 곤충을 제거약 5 분 거리에 있습니다.
- 3 회 70-100% 에탄올의 2 튜브의 각, 멸균 H 2 O (그림 2C) 중 하나 튜브 다음을 린스하여 주사기 바늘을 소독하다. 액체의 볼륨이 잠기 바늘에 충분해야합니다.
- hemocytometer를 사용하여 현미경으로 희석 세포 현탁액을 Quantitate. 원하는 inoculum에 따라 잘 맞는 microtiter (그림 2D)에서 10 μl를 그립니다.
- 견본이 곤충 95 % 에탄올로 표면, 그리고 복부 prolegs 중 하나 뒤에 (이하 45 °) 각도 곤충에 10 ML의 세포 현탁액을 주사. 펑크 용기를 내서 않도록주의를 타고 그냥 표피 층 (그림 2E) 아래의 내용을 삽입. hemolymph의 일부 손실 (일반, 녹색 파란색 액체)이 정상이지만, 사출 사이트에서 새로운 미립자과 노란색 액체가 내장 주사를 나타내는 수 있습니다. 이 경우 곤충를 희생하고 다시 할 수있는 새로운 애벌레를 얻을를 넣습니다.
- 첫 번째 주입 그룹의 각 남아있는 곤충에 대한 단계 3.6을 반복합니다. 니들 살균은 오염이 발생하지 않는 한 박테리아의 동일한 희석과 변형을 주입 각각의 곤충 사이에 필요하지 않습니다. 또한, 반복 디스펜서는 샘플 사이에 주입 볼륨에서 더 일관성에 사용할 수 있습니다.
- 박테리아의 첫 번째 변형 각 곤충을 주입 한 후,이 시간이 접시의 중앙에 세포 현탁액을 찾는하고 아래 방향으로 그 흐름 (그림 2 층) 주셔서 단계 3.2를 반복합니다. 적절한 온도에서 번호판을 배양하고 inoculum를 열거하는 식민지를 계산합니다. 이 두 번째 도금 단계는이 문서의 첫 번째와 두 번째 platings 사이의 서로 다른 식민지 번호 될 것 같은 샘플은, 주입 과정에서 오염되지 않은 것을 확인하는 데 사용됩니다.
- 반복 실험에서 박테리아의 각 변형에 대해 3.8으로 3.1 단계를 반복합니다. 마지막으로, 동생이야를 사용하여 멸균 1X PBS로 3-5 벌레를 삽입부정적인 제어 그룹으로 구출 바늘. 8 시간 짙은의 photoperiod : 16 시간의 빛으로 26 ° C에서 곤충을 품다.
- 주사 후 시간이 지남에 따라 곤충 생존을 모니터링합니다. 곤충 죽음을 자극시 자원 봉사 운동의 부족으로 특징입니다. 곤충은 종종 죽기 전에 감염 동안 식욕 감소, 설사 (물, 노란색 배설물), 및 / 또는 물 손실을 ( "땀") 전시, 이러한 특성은뿐만 아니라 지적 가치가있을 수 있습니다.
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Representative Results
곤충 사망률 분석의 대표 예는 그림 3에 그려져 있습니다. 이 실험에서, 곤충이 중 야생 유형 (ATCC19061) 또는 중순 로그 단계 (변형 당 n은 = 6 곤충)로 성장 Xenorhabdus nematophila의 감쇠 돌연변이 스트레인 (lrp 13)의 약 50 식민지 성형 단위 (CFU)를 주입했다. 곤충은 약 72 시간에 관찰, 각 timepoint에서 아직 살아 주입 곤충의 %가 기록되었습니다. 이 경우, 감쇠 변형은 곤충 살해 명확한 지연을 전시, 야생 형 스트레인 전에 어떤 돌연변이에 감염된 유충의 죽음에, 30 시간의 후 분사 내의 모든 6 애벌레를 죽였어.
그림 1. 분사에 대한 준비 곤충 양육. A) 약 40 표면 살균 계란은 함께 5온스 컵의 하단에 배치됩니다불임 곤충 다이어트는 고무 마개에 쉬고 있습니다. B) 스물 새로 부화 곤충은 바닥에 무균 곤충 다이어트와 함께 5온스 컵에 전송하고 2 일 incubated 수 있습니다. C) 곤충은 다음 하단에 무균 다이어트로 1온스 컵에 개별적으로 전송하고 성숙 할 때까지 incubated 수 있습니다. D) 넷째 instar M. 몸을 따라 눈에 잘 띄는 스트라이프 (위)과 복부 prolegs (아래)에 검은 색 crochets과 sexta의 애벌레.
그림 2. 4 일 instar M.의 주입 sexta의 애벌레. A) 박테리아가 순차적으로 96 - 웰 플레이트에 희석되어 있습니다. B) 여러 dilutions의 열 microliters은 inoculum를 열거하는 도금되어 있습니다. C) 주사기은 3 에탄올에 린스 (2 배) 및 멸균 물을 소독합니다. D) 적절한 희석에서 10 microliters은 주사기로 그려 있습니다. E) 세포 현탁액은 45 °에 주입첫 번째 복부 proleg 뒤에 각도. F) Dilutions 다시 inoculum의 두 번째 측정을 제공하기 위해 도금입니다.
그림 3. M. 대표 결과 sexta 주입 분석. 고정 단계 (10 -4 희석에서 10 μl)에 Xenorhabdus nematophila 세포의 약 50 집락 형성 단위 (CFU)은 여섯 4 일 instar M.에 주입 된 변형 당 sexta의 애벌레. 설립 독성 결함이있는 모두 야생 유형과 돌연변이 변종 (lrp)은 시간이 지남에 따라 사망률에 주입하고 벌레가 모니터되었다. 결과는 %가 시간 (시간)을 통해 곤충을 살아남은로보고됩니다. 이 곡선은 로그 순위 분석을 통해 0.000458의 P-값으로, 통계적으로 구분됩니다.
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Discussion
M.의 직접 분사 여기를 설명 entomopathogenic 박테리아와 sexta의 유충은 박테리아 독성을 분석 할 수있는 간단하고 효과적인 수단으로 제공하고 있습니다. 방법은 다른 실험 과목 및 / 또는 조건에 맞게도 매우 적응합니다. 박테리아는 주입하기 전에 여러 가지 준비 할 수 있습니다. X의 경우 nematophila은 중간 로그 단계로 영양이 풍부한 Luria-Bertani (LB) 배지에서 자란 야생 형 세포는 주사로 다음 30 시간 내에 대부분의 또는 모든 곤충을 죽이고, 일반적으로 가장 악성이다. 고정 단계에서 세포는 종종 유충을 죽일 이상 5-10 시간을. 성장 단계는 독성 영향을 미칩니다 있지만, 주입 세포의 총 수는 전형적인 inocula 20에서 20,000 CFU까지로, 16 덜 중요한 것 같습니다. 사실, Xenorhabdus 및 Photorhabdus 종의 경우, 5 CFU처럼 일부는 곤충 호스트 17을 죽일 수있는 충분한 수 있습니다. 독성의 prope을 평가하기 위하여에탄올 살균 (예 : 세균 종)에 저항 박테리아 종의 rties은 일회용 바늘은 에탄올 살균 대신 (단계 3.4)의 각 고유의 변형을 삽입하는 데 사용할 수 있습니다.
이 방법에 대한 자세한 조정 양육 및 / 또는 M.의 조작의 변화를 포함 할 수 있습니다 sexta가. 예를 들어, 곤충은 더 많은 자연 식품 소스로 토마토이나 담배 잎에서 키운 될 수 있습니다. M.의 또는 다른 발달 단계 sexta의 유충이 방법으로 assayed 할 수 있습니다. 네 번째 instar의 애벌레들은 상대적으로 큰 크기를 기준으로 선택되었지만, 작은 애벌레도이 방법으로 주입 될 수 있습니다. 다섯 번째 instar의 애벌레는 그러나 개발 단계 동안 면역 체계에 변화가 잠재적으로 데이터 분석을 복잡하게, 초기 5 일 instar의 애벌레 18보다 더 민감 후반 5 일 instar의 애벌레를 렌더링, 주입 할 수 있습니다.
마지막으로, 직접 분사방법은 다른 곤충 종에 사용하기 위해 구성 될 수있다. M.는 그러한 갤러리아 mellonella와 같은 다른 (더 민감) 모델 생물보다 감염에 덜 민감하기 때문에 sexta는 높은 병원성 종의 모델 호스트로 사용됩니다. G.는 mellonella는하지만,이 작품은 19에서 설명하는 방법으로 주입 될 수 있으며, Xenorhabdus 및 Photorhabdus 종보다 악성 검정 세균 종에 유용 할 수 있습니다.
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Disclosures
관심 없음 충돌이 선언 없습니다.
Acknowledgments
저자는 Goodrich-블레어 연구실 과거 회원 감사 할 : 사만다 오차드 (Orchard), 킴벌리 Cowles, 에린 허버트 - 트란, 그렉 리차드, 메건 Menard, 그리고 Youngjin 공원이 프로토콜의 발전에 기여. 이 작품은 국립 과학 재단 (National Science Foundation) 기금 IOS-0950873 및 건강 NRSA 교제 FAI084441Z의 국립 연구소에 의해 자금을 지원했다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 90 mm filter paper | Whatman | 1001 090 | |
| Glass filter holder | Millipore | XX1004700 | |
| Manduca sexta eggs | Carolina Biological Supply | 143880 | |
| Gypsy Moth Diet + agar | MP Biomedicals | 0296029301 | |
| 5.5 oz. plastic containers and lids | Solo Cup Company | URC55-0090 Pl4-0090 | |
| 1 oz. plastic containers and lids | DART Container Corporation | 100PC 100PCL25 | |
| 1x PBS | 137 mm NaCl, 2.7 mM KCl, 8 mM Na2HPO4, 1.46 mM KH2PO4, pH 7.4 | ||
| Syringe | Hamilton | 80208 | 30 gauge, 0.375" length, point style 2 |
References
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