Summary
Den her beskrevne metode anvender direkte injektion af insektspecifikke bakterier i hemocoel af
Abstract
Manduca sexta, almindeligvis kendt som tobak hornworm, betragtes som en betydelig landbrugs skadedyr, fodring på planter af natskyggefamilien, herunder tobak og tomat. Modtageligheden af M. sexta-larver til en række insektspecifikke bakteriearter 1-5, samt mangfoldighed af oplysninger om insekt immunsystem 6-8, og den verserende genomsekvens 9 gør det til en god model organisme til anvendelse ved undersøgelse host-mikrobe interaktioner under patogenese. Desuden M. sexta-larver er relativt store og nemme at manipulere og opretholde i laboratoriet i forhold til andre modtagelige insekter. Deres store størrelse også muliggør en effektiv væv / hæmolymfe ekstraktion til analyse af værtens respons på infektion.
Fremgangsmåden præsenteres her beskriver direkte injektion af bakterier ind i hemocoel (blod hulrum) i M. sexta-larver. Denne fremgangsmådekan anvendes til at analysere og sammenligne de virulente egenskaber ved forskellige bakterielle arter, stammer, eller mutanter ved blot at overvåge den tid, at insektet dør efter injektion. Denne metode blev udviklet til at studere patogeniciteten af Xenorhabdus og Photorhabdus species, som typisk vedrører med nematode vektorer som et middel til at få adgang til det insekt. Insektspecifikke nematoder typisk inficere larver via naturlige fordøjelsesforstyrrelser eller respiratoriske åbninger, og frigive deres symbiotiske bakterielle indhold i insekt hemolymph (blod) kort efter 10. Injektionen her beskrevne fremgangsmåde omgår behovet for et nematode vektor, således frakobling af virkningerne af bakterier og nematode på insektet. Denne fremgangsmåde tillader nøjagtig tælling af infektiøst materiale (celler eller protein) i inokulum, hvilket ikke er muligt med andre eksisterende metoder til analyse entomopathogenesis, herunder nicking 11 og oral toksicitet assays 12 Anvendeligheden af den direkte indsprøjtning som beskrevet her er at analysere bakteriel patogenese ved at overvåge insekt dødelighed. Imidlertid kan denne fremgangsmåde let udvides til anvendelse ved undersøgelse af virkningerne af infektion på M. sexta immunsystem. Insektet reagerer på infektion via både humorale og cellulære responser. Den humorale reaktion indbefatter anerkendelse af bakteriel-associerede mønstre og efterfølgende produktion af forskellige antimikrobielle peptider 7, ekspressionen af gener kodende for disse peptider kan overvåges efter direkte infektion via RNA-ekstraktion og kvantitativ PCR 13. Den cellulære respons på infektion involverer rodknolddannelse, indkapsling, og fagocytose af infektiøse agenser fra hæmocytter 6 13, 14.
Protocol
1. Insekt Egg Sterilisation og opdræt
- Forbered kost ved først autoklavering 15 g af den ydede agar i 900-1.000 ml H 2 O. Umiddelbart efter autoklavering, blandes med 166 g hvedekim kost og blend godt i en laboratorieblender. Hældes i en skål (eller retter) til afkøling, derefter overføre kost til aluminiumsfolie, wrap stramt, og opbevar ved 4 ° C.
- Ved ankomsten, sterilisere M. sexta æg med 250 ml 0,6% blegemiddelopløsning i 2-3 min i et glas filterholder og termokande apparat med en 90 mm filter papir, under jævnlig omrøring.
- Tænde vakuum for at dræne blegemiddelopløsning og vask æg 3-4 gange med 250 ml sterilt destilleret H2O per vask.
- Overføre æggene til frisk 90 mm filterpapir anbragt i en petriskål låg og lad dem tørre, indtil de ikke længere holde sammen (ca. 20-30 min).
- Overføre æggene til bunden af plastbeholdere med insekt kost, anbringelse omkring 40 æg i hver beholder(Figur 1A). Æg adskilles fra kosten for at forhindre fugt-induceret svampekontamination. Vedligehold æg ved 26 ° C med en 16 timers lys: 8 timers mørke fotoperiode. Æg vil lysere til en gul-hvid farve før udklækning.
- Når udklækning er fuldstændig, omhyggeligt overføre omkring 25 larver hver til nye beholdere med diæt på bunden (figur 1 B). Det er vigtigt at samle op hver larve af den lange sorte horn hjælp pincet for at undgå at skade dem under deres skrøbelige tidlige udviklingsstadier. Inkuber i 2 dage som ovenfor. Mens larvernes død er usædvanligt på dette stadium, kan nogle døde eller, mere sandsynligt, udviklingsmæssigt forkrøblede larver overholdes. Sådanne insekter udelukkes fra yderligere undersøgelse og aflivet ved frysning.
- For at undgå kannibalistiske adfærd, transfer larver til individuelle beholdere med små stykker af fødevarer (figur 1C) og inkuberes som ovenfor. Overvåg insekt udvikling, der erstatter mad og rengøring afføring out af containere hver anden dag, indtil de gennemgår den tredje larve molt (normalt 6-9 dage efter klækning). Dette er den 4. instar larvestadiet, kendetegnet ved fremkomsten af sorte kroglignende crochets på hver proleg og større vægt på striber langs insekt organ (figur 1D). Larverne kan variere betydeligt i størrelse, men typisk vejer 0,15 til 0,4 g ved ankomsten til 4. instar scene. Larver af tilsvarende størrelse bør vælges til injektion.
2. Fremstilling af bakterier til injektion
- Vokser den bakterielle stamme (r), der skal testes i overensstemmelse med standardprocedurer til vækstfasen du ønsker at teste.
- Pellet 500 pi af hver bakteriel stamme, der skal testes ved centrifugering i 2 minutter i en mikrocentrifuge ved 13.000 rpm ved stuetemperatur.
- Resuspender cellerne i 1 ml steril 1X phosphatpufret saltopløsning (PBS) og pelleten igen som ovenfor.
- Resuspender celler i 0,5 ml steril 1 x PBS og MEAKontroller den optiske densitet (OD) af suspensionen. Fortynd alle suspensioner til samme OD, om nødvendigt. Sterile vækstmedier kan også anvendes til celle resuspension og fortynding i stedet for 1 x PBS, om ønsket.
3. Injektion af 4. stadiums larver
- Fremstille serielle 10 gange fortyndinger af den første bakteriestamme i 6 brønde i en 96-brønds mikrotiterplade i steril 1 x PBS under anvendelse af en ny pipettespids for hver fortynding (figur 2A). Det endelige volumen af cellesuspension i hver brønd bør overstige den mængde der kræves til injektion (10 pi pr insekt) plus 20 pi til pladen inokulum (se trin 3.2 og 3.7).
- Spot 10 ul hver gang i 5 fortyndinger (10 -2 til 10 -6) øverst på en Petri-plade indeholdende et passende vækstmedium. Vip pladen, således at pletterne bredte sig til centrum (figur 2B).
- Fjern insekt kost og afføring og placere insekter i containere på is ica 5 min.
- Steriliser sprøjtenålen ved skylning 3 gange hver i 2 rør med 70-100% ethanol, efterfulgt af et rør af sterilt H2O (figur 2C). Volumenet af væske skal være tilstrækkelig til at nedsænke nålen.
- Kvantitere de fortyndede cellesuspensioner under et mikroskop med et hæmocytometer. Afhængigt af den ønskede inokulum, 10 ul trække den relevante mikrotiterbrønden (figur 2D).
- Podepinden insektet overflade med 95% ethanol, og injicere 10 ml cellesuspension ind i insektekspressionsvektoren i en vinkel (mindre end 45 °) bag en af de abdominale prolegs. Pas på ikke at punktere tarmen og injicere indholdet lige under epidermislaget (Figur 2E). Mens nogle tab af hemolymph (klar, grøn-blå væske) er normal, partikler og gul væske kommer ud fra injektionsstedet er tegn på tarmen punktering. Hvis dette sker, ofre insekt og få en ny larve at replacere det.
- Gentag trin 3,6 for hver resterende insekt i den første injektion gruppe. Needle sterilisering er ikke nødvendig mellem hver insekt injiceret med den samme fortynding og stamme af bakterier, medmindre der forekommer forurening. Alternativt kan en gentaget dispenser anvendes til mere ensartet injektionsvolumen blandt prøverne.
- Efter indsprøjtning hver insekt med den første bakteriestamme, gentages trin 3.2, denne gang spotting cellesuspensioner i midten af pladen og lade dem flyde mod bunden (figur 2F). Pladerne inkuberes ved passende temperatur og tælle kolonier at optælle inokulum. Dette andet pletteringstrin anvendes til at kontrollere, at prøverne ikke blev kontamineret under injektionsprocessen, da dette vil resultere i forskellige kolonier numre mellem den første og anden platings.
- Gentag trin 3,1 ved 3,8 for hver stamme af bakterier i eksperimentet. Endelig injicere 3-5 insekter med steril 1 x PBS under anvendelse af en sterile nål som negativ kontrolgruppe. Inkuber insekter ved 26 ° C med en 16 timers lys: 8 timers mørke fotoperiode.
- Overvåge insekt overlevelse over tid efter injektion. Insect død karakteriseres som en mangel på frivillig bevægelse ved stimulering. Insekter udviser ofte appetit tab, diarré (våde, gul ekskrementer), og / eller væsketab ("sveden") under infektion forud for dødsfaldet, idet disse egenskaber kan være værd at bemærke så godt.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Et repræsentativt eksempel på et insekt dødelighed assay er vist i figur 3.. I dette eksperiment blev insekter injiceret med cirka 50 kolonidannende enheder (CFU) af enten vildtype (ATCC19061) eller en attenueret mutant stamme (LRP 13) af Xenorhabdus nematophila dyrket til mid-log fase (n = 6 insekter pr stamme). Insekter blev observeret i ca 72 timer, og procentdelen af injiceret insekter stadig i live ved hvert tidspunkt registreres. I dette tilfælde udviste den svækkede stamme en tydelig forsinkelse i insekt aflivning af vildtypestammen dræbte alle 6 larver inden for 30 timer efter injektion, før dødsfaldet af en mutant-inficerede larver.
Fig. 1. Insekt opdræt som forberedelse til injektion. A) ca 40 overflade-steriliserede æg er placeret i bunden af en 5 ounce kop medsterile insekt kost hviler på en gummiprop. B) Tyve nyklækkede insekter overføres til 5 ounce kopper med sterilt insekt diæt på bunden og inkuberet i 2 dage. C) Insekter er næste overføres enkeltvis til en ounce kopper med sterile kost på bunden og inkuberes indtil de udløber. D) Fjerde stadium M. sexta larver med prominente striber langs kroppen (øverst) og sorte crochets på den abdominale prolegs (nederst).
Figur 2. Injektion af 4. stadium M. sexta-larver. A) Bakterier seriefortyndet i en plade med 96 brønde. B) Ti mikroliter flere fortyndinger udplades at optælle inoculum. C) Sprøjten steriliseres med 3 skylninger i ethanol (2x) og sterilt vand. D) Ti mikroliter fra den pågældende fortynding trækkes op i sprøjten. E) Cellesuspensionen injiceres i en 45 °vinkel bag den første abdominale proleg. F) Fortyndinger igen udpladet for at tilvejebringe et andet mål for inoculum.
Figur 3. Repræsentativt resultat af M. sexta injektion assay. Omkring 50 kolonidannende enheder (CFU) af Xenorhabdus nematophila celler i stationær fase (10 pi fra 10 -4 fortynding) blev injiceret i seks 4. stadium M. sexta-larver pr stamme. Både vildtype og en mutantstamme (LRP) med en etableret virulens defekt blev injiceret og de insekter monitoreret for mortalitet over tid. Resultater rapporteres som procent overlevende insekter over tid (i timer). Disse kurver er statistisk forskellige, med en p-værdi på 0.000458 via log-rank analyse.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Den direkte injektion af M. sexta-larver med insektspecifikke bakterier, som beskrevet her, tjener som et enkelt og effektivt middel til at analysere bakteriel virulens. Fremgangsmåden er også meget fleksibel til forskellige forsøgspersoner og / eller betingelser. Bakterier kan fremstilles på forskellige måder før injektion. I tilfælde af X. nematophila, vildtypeceller dyrket i næringsrige Luria-Bertani (LB) medium til mid-log fase, er typisk de mest virulente, dræbe de fleste eller alle insekter inden for 30 timer efter injektion. Celler i stationær fase ofte tage 5-10 timer længere tid at dræbe larverne. Selvom vækstfase påvirker virulens, det totale antal injicerede celler synes at være mindre vigtigt 16, med typiske inokula i området fra 20 til 20.000 CFU. Faktisk, i tilfælde af Xenorhabdus og Photorhabdus species så få som 5 CFU er tilstrækkelig til at dræbe insektet host 17. For at vurdere virulens properties af bakterier, der er resistente over for ethanol sterilisering (f.eks Bacillus-arter), kan engangsnåle anvendes til at injicere hvert unikt stamme i stedet for ethanol sterilisering (trin 3.4).
Yderligere tilpasninger af denne metode kan omfatte ændringer i opdræt og / eller manipulation af M. sexta. For eksempel kan insekter blive opdraget på tomater eller tobak blade som en mere naturlig fødekilde. Alternativt kan forskellige udviklingsstadier i M. sexta-larver kan analyseres ved denne fremgangsmåde. Fjerde stadiums larver blev valgt på grundlag af deres relativt store størrelse, men mindre larver kan også injiceres ved denne fremgangsmåde. Femte stadiums larver kan injiceres, men de ændringer i immunsystemet under denne fase af udviklingen gøre sent 5 th stadiums larver mere modtagelige end begyndelsen 5 th stadiums larver 18, potentielt komplicerende dataanalyse.
Endelig direkte injektionFremgangsmåden kan tilpasses til anvendelse med andre insektarter. M. sexta anvendes som model vært for stærkt patogene arter fordi det er mindre modtagelige for infektion end andre (mere modtagelige) modelorganismer, såsom Galleria mellonella. G. mellonella kan injiceres ved fremgangsmåden beskrevet i dette værk 19, dog, og kan være nyttige til assay bakteriearter mindre virulente end Xenorhabdus og Photorhabdus species.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Ingen interessekonflikter erklæret.
Acknowledgments
Forfatterne vil gerne takke tidligere medlemmer af Goodrich-Blair lab: Samantha Orchard, Kimberly Cowles, Erin Herbert-Tran, Greg Richards, Megan Menard, og Youngjin Park for deres bidrag til udviklingen af denne protokol. Dette arbejde blev finansieret af National Science Foundation tilskud IOS-0950873 og National Institutes of Health NRSA stipendium FAI084441Z.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 90 mm filter paper | Whatman | 1001 090 | |
| Glass filter holder | Millipore | XX1004700 | |
| Manduca sexta eggs | Carolina Biological Supply | 143880 | |
| Gypsy Moth Diet + agar | MP Biomedicals | 0296029301 | |
| 5.5 oz. plastic containers and lids | Solo Cup Company | URC55-0090 Pl4-0090 | |
| 1 oz. plastic containers and lids | DART Container Corporation | 100PC 100PCL25 | |
| 1x PBS | 137 mm NaCl, 2.7 mM KCl, 8 mM Na2HPO4, 1.46 mM KH2PO4, pH 7.4 | ||
| Syringe | Hamilton | 80208 | 30 gauge, 0.375" length, point style 2 |
References
- Bintrim, S. B., Ensign, J. C. Insertional inactivation of genes encoding the crystalline inclusion proteins of Photorhabdus luminescens results in mutants with pleiotropic phenotypes. J. Bacteriol. 180, 1261-1269 (1998).
- Schesser, J. H., Kramer, K. J., Bulla, L. A. Bioassay for homogeneous parasporal crystal of Bacillus thuringiensis using the tobacco hornworm, Manduca sexta. Appl. Environ. Microbiol. 33, 878-880 (1977).
- Péchy-Tarr, M., Bruck, D. J., Maurhofer, M., Fischer, E., Vogne, C., Henkels, M. D., Donahue, K. M., Grunder, J., Loper, J. E., Keel, C. Molecular analysis of a novel gene cluster encoding an insect toxin in plant-associated strains of Pseudomonas fluorescens. Environ. Microbiol. 10, 2368-2386 (2008).
- Nuñez-Valdez, M. E., Calderón, M. A., Aranda, E., Hernández, L., Ramírez-Gama, R. M., Lina, L., Rodríguez-Segura, Z., Gutiérrez Mdel, C., Villalobos, F. J. Identification of a putative Mexican strain of Serratia entomophila pathogenic against root-damaging larvae of Scarabaeidae (Coleoptera). Appl. Environ. Microbiol. 74, 802-810 (2008).
- Forst, S. A., Tabatabai, N. Role of the histidine kinase, EnvZ, in the production of outer membrane proteins in the symbiotic-pathogenic bacterium Xenorhabdus nematophilus. Appl. Environ. Microbiol. 63, 962-968 (1997).
- Kanost, M. R., Jiang, H., Yu, X. Q. Innate immune responses of a lepidopteran insect, Manduca sexta. Immunol. Rev. 198, 97-105 (2004).
- Yu, X. Q., Zhu, Y. F., Ma, C., Fabrick, J. A., Kanost, M. R. Pattern recognition proteins in Manduca sexta plasma. Insect Biochem. Mol. Biol. 32, 1287-1293 (2002).
- Eleftherianos, I., ffrench-Constant, R. H., Clarke, D. J., Dowling, A. J., Reynolds, S. E. Dissecting the immune response to the entomopathogen Photorhabdus. Trends Microbiol. 18, 552-560 (2010).
- Tobacco Hornworm Genome Project [Internet]. , Baylor College of Medicine. Houston, TX. Available from: http://www.hgsc.bcm.tmc.edu/content/tobacco-hornworm-genome-project (2012).
- Herbert, E. E., Goodrich-Blair, H. Friend and foe: the two faces of Xenorhabdus nematophila. Nat. Rev. Microbiol. 5, 634-646 (2007).
- D'Argenio, D. A., Gallagher, L. A., Berg, C. A., Manoil, C. Drosophila as a model host for Pseudomonas aeruginosa Infection. J. Bacteriol. 183, 1466-1471 (2001).
- Waterfield, N., Dowling, A., Sharma, S., Daborn, P. J., Potter, U., Ffrench-Constant, R. H. Oral toxicity of Photorhabdus luminescens W14 toxin complexes in Escherichia coli. Appl. Environ. Microbiol. 67, 5017-5024 (2001).
- Park, Y., Herbert, E. E., Cowles, C. E., Cowles, K. N., Menard, M. L., Orchard, S. S., Goodrich-Blair, H. Clonal variation in Xenorhabdus nematophila virulence and suppression of Manduca sexta immunity. Cell. Microbiol. 9, 645-656 (2007).
- Park, Y., Kim, Y., Putnam, S. M., Stanley, D. W. The bacterium Xenorhabdus nematophilus depresses nodulation reactions to infection by inhibiting eicosanoid biosynthesis in tobacco hornworms, Manduca sexta. Arch. Insect Biochem. Physiol. 52, 71-80 (2003).
- Cowles, K. N., Cowles, C. E., Richards, G. R., Martens, E. C., Goodrich-Blair, H. The global regulator Lrp contributes to mutualism, pathogenesis and phenotypic variation in the bacterium Xenorhabdus nematophila. Cell. Microbiol. 9, 1311-1323 (2007).
- Cowles, K. N., Goodrich-Blair, H. Expression and activity of a Xenorhabdus nematophila haemolysin required for full virulence towards Manduca sexta insects. Cell. Microbiol. 7, 209-219 (2005).
- Goodrich-Blair, H., Clarke, D. J. Mutualism and pathogenesis in Xenorhabdus and Photorhabdus: two roads to the same destination. Mol. Microbiol. 64, 260-268 (2007).
- Eleftherianos, I., Baldwin, H., ffrench-Constant, R. H., Reynolds, S. E. Developmental modulation of immunity: changes within the feeding period of the fifth larval stage in the defence reactions of Manduca sexta to infection by Photorhabdus. J. Insect Physiol. 54, 309-318 (2008).
- Kavanagh, K., Reeves, E. P. Exploiting the potential of insects for in vivo pathogenicity testing of microbial pathogens. FEMS Microbiol. Rev. 28, 101-112 (2004).
