Summary
विधि यहाँ वर्णित की hemocoel में entomopathogenic जीवाणुओं की प्रत्यक्ष इंजेक्शन का इस्तेमाल
Protocol
1. कीट अंडे बंध्याकरण और पालन
- 1 वाष्पदावी विसंक्रण प्रदान की अगर 15 ग्राम से 900-1,000 मिलीलीटर एच 2 ओ में आहार तैयार तुरंत बाद 166 छ गेहूं के बीज और एक प्रयोगशाला ब्लेंडर में अच्छी तरह से आहार मिश्रण के साथ वाष्पदावी विसंक्रण मिश्रण. एक पकवान शांत करने के लिए (या बर्तन) में डालो, तो एल्यूमीनियम पन्नी आहार हस्तांतरण, कसकर लपेटो, 4 की दुकान और डिग्री सेल्सियस
- आगमन पर, एम. बाँझ बनाना 0.6% एक गिलास फिल्टर धारक और एक 90 मिमी फिल्टर पेपर के साथ वैक्यूम फ्लास्क तंत्र, कभी कभी क्रियाशीलता में 2-3 मिनट के लिए ब्लीच समाधान के 250 मिलीलीटर के साथ Sexta अंडे.
- शून्य पर चालू करने के लिए ब्लीच समाधान और अंडे 3-4 बार धोने के साथ 250 मिलीलीटर बाँझ आसुत एच 2 हे धोने प्रति नाली.
- ताजा 90 मिमी फिल्टर एक पेट्री थाली ढक्कन में रखा कागज अंडे स्थानांतरण और उन्हें सूखे के लिए अनुमति देते हैं, जब तक वे एक साथ नहीं रह छड़ी (20-30 मिनट के बारे में).
- कीट आहार के साथ प्लास्टिक के कंटेनर के नीचे करने के लिए अंडे, स्थानांतरण, प्रत्येक कंटेनर में लगभग 40 अंडे दे(चित्रा 1 ए). अंडे आहार से अलग हो रहे हैं नमी प्रेरित कवक संक्रमण को रोकने. 8 घंटा अंधेरे photoperiod: एक 16 घंटा प्रकाश के साथ 26 पर अंडे डिग्री सेल्सियस बनाए रखें. अंडे एक पीले रंग सफेद अंडे सेने के लिए पहले हल्का होगा.
- जब अंडे सेने के पूरा हो गया है, ध्यान से नीचे (चित्रा 1 बी) पर आहार के साथ नए कंटेनर के लिए लगभग 25 लार्वा प्रत्येक हस्तांतरण. यह महत्वपूर्ण है कि लंबे काले सींग संदंश का उपयोग करने के लिए उन्हें उनके नाजुक जल्दी विकास के चरणों के दौरान नुकसान पहुँचाने से बचने के द्वारा प्रत्येक लार्वा लेने. इसके बाद के संस्करण के रूप में 2 दिनों के लिए सेते हैं. हालांकि इस स्तर पर लार्वा मौत असामान्य है, कुछ मृत या, और अधिक होने की संभावना है, developmentally अवरुद्ध लार्वा देखा जा सकता है. ऐसे कीड़े आगे के अध्ययन से बाहर रखा जाना चाहिए और ठंड से बलिदान.
- नरभक्षी व्यवहार, व्यक्तिगत कंटेनरों के लिए भोजन के छोटे टुकड़े (चित्रा 1C) के साथ स्थानांतरण लार्वा से बचने के लिए और इसके बाद के संस्करण के रूप में सेते हैं. कीट विकास मॉनिटर, भोजन की जगह और सफाई मल कहांकंटेनरों हर दूसरे दिन जब तक वे 3 लार्वा गिरना (आम तौर पर 6-9 दिनों के अंडे सेने के बाद) से गुजरना. यह 4 वें instar लार्वा चरण है, कीट शरीर (चित्रा 1D) के साथ पट्टियों के प्रत्येक proleg और वृद्धि की प्रमुखता पर काले हुक की तरह crochets की उपस्थिति द्वारा विशेषता है. लार्वा आकार में काफी भिन्नता है, लेकिन हो सकता है आम तौर पर 4 वें instar चरण में प्रवेश करने पर 0.15-.4 जी तौलना. समान आकार के लार्वा इंजेक्शन के लिए चुना जाना चाहिए.
2. जीवाणु इंजेक्शन के लिए तैयार
- विकास के चरण में आप परीक्षण करने के लिए करना चाहते हैं के लिए मानक प्रक्रियाओं के अनुसार परीक्षण किया जा जीवाणु (ओं) तनाव आगे बढ़ें.
- गोली प्रत्येक बैक्टीरियल तनाव के 500 μl कमरे के तापमान पर 13,000 rpm पर एक microcentrifuge में 2 मिनट के लिए कताई द्वारा परीक्षण किया.
- 1 मिलीलीटर बाँझ 1x फॉस्फेट में Resuspend कोशिकाओं खारा (पीबीएस) buffered और गोली के रूप में फिर से ऊपर.
- 0.5 मिलीलीटर बाँझ 1x पीबीएस और विदेश मंत्रालय में Resuspend कोशिकाओंयकीन है कि निलंबन के ऑप्टिकल घनत्व (ओवर ड्राफ्ट). एक ही आयुध डिपो के लिए सभी के निलंबन पतला, यदि आवश्यक हो तो. बाँझ विकास मीडिया सेल और 1x पीबीएस की जगह में resuspension कमजोर पड़ने के लिए भी इस्तेमाल किया जा सकता है, अगर वांछित.
3. 4 वें Instar लार्वा का इंजेक्शन
- एक 96-अच्छी तरह से बाँझ 1x पीबीएस में microtiter प्लेट के 6 कुओं में 1 बैक्टीरियल तनाव के धारावाहिक 10 गुना dilutions, प्रत्येक कमजोर पड़ने के लिए एक ताजा विंदुक टिप का उपयोग (2 चित्रा) तैयार करें. प्रत्येक कुएं में सेल निलंबन के अंतिम मात्रा इंजेक्शन (कीट प्रति 10 μl) प्लस 20 प्लेट μl inoculum (3.2 और 3.7 कदम देखें) के लिए आवश्यक मात्रा होनी चाहिए.
- स्पॉट एक पेट्री एक उपयुक्त मध्यम विकास युक्त थाली के शीर्ष के साथ 5 dilutions (-6 10 के माध्यम से 10 -2) के लिए 10 μl प्रत्येक. प्लेट तो यह है कि स्पॉट केंद्र (चित्रा 2B) फैल झुकाव.
- बर्फ पर कीट और कंटेनरों में आहार मल और जगह कीड़े निकालेंलगभग 5 मिनट.
- 70-100% इथेनॉल के 2 ट्यूबों में 3 बार प्रत्येक बाँझ एच 2 ओ (चित्रा 2C) की एक ट्यूब के द्वारा पीछा rinsing द्वारा सिरिंज सुई जीवाणुरहित. तरल पदार्थ की मात्रा सुई डूब के लिए पर्याप्त होना चाहिए.
- एक hemocytometer का उपयोग कर खुर्दबीन के नीचे पतला सेल निलंबन quantitate. वांछित inoculum पर निर्भर करता है, अच्छी तरह से उपयुक्त microtiter (चित्रा 2 डी) से 10 μl आकर्षित.
- 95% इथेनॉल के साथ झाड़ू कीट सतह, और कीट में पेट प्रोलेग की एक के पीछे एक कोण पर 10 मिलीलीटर सेल निलंबन इंजेक्षन (कम से कम 45 °). पेट पंचर नहीं ख्याल रखना और epidermal परत (चित्रा 2E) नीचे सिर्फ सामग्री इंजेक्षन. जबकि hemolymph (स्पष्ट, हरे नीले तरल) के कुछ नुकसान सामान्य है, मामला particulate और पीला तरल इंजेक्शन साइट से उभर आंत पंचर की ओर संकेत कर रहे हैं. यदि ऐसा होता है, कीट बलिदान और एक नए के लार्वा को पुनः प्राप्तयह जगह है.
- पहला इंजेक्शन समूह में प्रत्येक शेष कीट के लिए 3.6 चरण दोहराएँ. सुई नसबंदी प्रत्येक इंजेक्शन के साथ एक ही है और बैक्टीरिया के कमजोर पड़ने तनाव जब तक संदूषण होता कीट के बीच आवश्यक नहीं है. वैकल्पिक रूप से, एक दोहरा मशीन नमूनों के बीच इंजेक्शन की मात्रा के बारे में अधिक से अधिक स्थिरता के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है.
- बैक्टीरिया का पहला तनाव के साथ प्रत्येक कीट इंजेक्शन लगाने के बाद, 3.2 कदम दोहराने, प्लेट के बीच में इस समय सेल निलंबन खोलना दे और उन्हें नीचे की ओर प्रवाह (चित्रा 2 एफ). उचित तापमान पर प्लेटें सेते हैं और कालोनियों की गिनती inoculum एन्यूमरेट करने के लिए. यह दूसरा कदम चढ़ाना सत्यापित करने के लिए प्रयोग किया जाता है कि नमूने इंजेक्शन प्रक्रिया के दौरान दूषित नहीं थे, के रूप में यह पहली और दूसरी platings के बीच असमान कॉलोनी संख्या में नतीजा होगा.
- दोहराएँ 3.8 के माध्यम से प्रयोग में बैक्टीरिया के प्रत्येक तनाव के लिए 3.1 कदम. अंत में, बाँझ 1x पीबीएस के साथ 3-5 कीड़े इंजेक्षन एक ster का उपयोगएक नकारात्मक नियंत्रण समूह के रूप में इले सुई. 8 घंटा अंधेरे photoperiod: 26 डिग्री सेल्सियस पर एक 16 घंटा प्रकाश के साथ कीड़े सेते हैं.
- इंजेक्शन के बाद समय पर कीट अस्तित्व मॉनिटर. कीट मौत उत्तेजना पर स्वैच्छिक आंदोलन के एक कमी के रूप में होती है. कीड़े अक्सर संक्रमण के दौरान भूख की कमी, दस्त (पानी, पीले मलमूत्र), और / या पानी नुकसान ("पसीना") मौत से पहले प्रदर्शन, इन विशेषताओं के रूप में अच्छी तरह से टिप्पण लायक हो सकता है.
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Representative Results
एक कीट मृत्यु परख का एक प्रतिनिधि उदाहरण चित्रा 3 में दर्शाया जाता है. इस प्रयोग में, कीड़े या तो जंगली (ATCC19061) प्रकार या Xenorhabdus nematophila की एक तनु उत्परिवर्ती (13 LRP) तनाव मध्य लॉग चरण (n = तनाव प्रति 6 कीड़े) हो गई है की लगभग 50 कॉलोनी के गठन इकाइयों (CFU) इंजेक्शन के साथ थे. कीड़े लगभग 72 घंटे के लिए मनाया गया, है और इंजेक्शन कीड़ों के प्रत्येक Timepoint में अभी भी जिंदा प्रतिशत दर्ज की गई. इस मामले में, तनु तनाव कीट हत्या के मामले में एक स्पष्ट देरी का प्रदर्शन, तनाव जंगली प्रकार के 30 घंटे के बाद इंजेक्शन के के भीतर सभी 6 लार्वा को मार डाला पहले किसी भी उत्परिवर्ती संक्रमित लार्वा की मौत के लिए,.
चित्रा 1 इंजेक्शन के लिए तैयारी में कीट पालन. ए) के बारे में 40 सतह निष्फल अंडे एक 5 ऑउंस कप के नीचे के साथ रखा जाता हैबाँझ कीट आहार एक रबर डाट पर आराम. बी) बीस नव रची कीड़े तल पर बाँझ कीट आहार के साथ 5 ऑउंस कप के लिए स्थानांतरित कर रहे हैं और 2 दिनों के लिए incubated. सी) कीड़े अगले तल पर बाँझ आहार के साथ 1oz कप के लिए व्यक्तिगत तबादला और जब तक वे परिपक्व incubated. डी) चौथा instar एम. शरीर के साथ प्रमुख धारियों (ऊपर) और पेट प्रोलेग (नीचे) पर काला crochets Sexta लार्वा.
चित्रा 2 4 वें instar एम. के इंजेक्शन. Sexta लार्वा. ए) जीवाणु serially एक 96-अच्छी तरह से थाली में पतला कर रहे हैं. बी) कई dilutions के दस microliters inoculum एन्यूमरेट करने के लिए चढ़ाया जाता है. सी) सिरिंज इथेनॉल में 3 rinses (2x) और बाँझ पानी के साथ निष्फल है. डी) उपयुक्त कमजोर पड़ने से दस microliters सिरिंज में तैयार कर रहे हैं. ई) सेल निलंबन एक 45 डिग्री पर इंजेक्ट किया जाता है1 पेट proleg पीछे कोण. एफ) dilutions फिर inoculum का एक दूसरा उपाय प्रदान चढ़ाया जाता है.
चित्रा 3 एम के प्रतिनिधि परिणाम. Sexta इंजेक्शन परख. 50 के बारे में Xenorhabdus nematophila कोशिकाओं की कॉलोनी के गठन इकाइयों (CFU) स्थिर चरण (10 -4 कमजोर पड़ने से 10 μl) में छह 4 वें instar एम. में इंजेक्शन थे तनाव के प्रति Sexta लार्वा. दोनों जंगली और एक स्थापित डाह दोष के साथ एक उत्परिवर्ती तनाव (LRP) प्रकार इंजेक्शन और समय पर मृत्यु दर के लिए कीड़ों पर नजर रखी. परिणाम प्रतिशत समय (घंटे में) से अधिक जीवित कीड़े के रूप में रिपोर्ट कर रहे हैं. ये घटता सांख्यिकीय अलग एक लॉग रैंक विश्लेषण के माध्यम 0.000458 के पी मूल्य के साथ हैं.
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Discussion
एम. के प्रत्यक्ष इंजेक्शन entomopathogenic बैक्टीरिया के साथ Sexta लार्वा, यहाँ के रूप में वर्णित है, जीवाणु डाह का विश्लेषण के लिए एक सरल और प्रभावी करने के लिए साधन के रूप में कार्य करता है. विधि भी उच्च अनुकूलनीय विभिन्न प्रायोगिक विषयों और / या परिस्थितियों के अनुरूप. जीवाणु विभिन्न इंजेक्शन के लिए पहले मायनों में तैयार किया जा सकता है. एक्स के मामले में nematophila, जंगली प्रकार के पोषक तत्वों से भरपूर Luria Bertani (पौंड) मध्य लॉग चरण के लिए मध्यम में विकसित कोशिकाओं आम तौर पर कर रहे हैं सबसे ज़हरीले, इंजेक्शन के बाद 30 घंटे के भीतर अधिकांश या सभी कीड़ों को मारने. स्थिर चरण में कोशिकाओं अक्सर 5-10 घंटा अब लेने के लार्वा को मारने के. हालांकि विकास के चरण डाह प्रभावों, इंजेक्शन कोशिकाओं की कुल संख्या से कम महत्वपूर्ण हो सकता है 16 20 से 20,000 CFU लेकर ठेठ inocula साथ प्रकट होता है. वास्तव में, Xenorhabdus और Photorhabdus प्रजातियों के मामले में, कम से कम 5 CFU के रूप कीट मेजबान 17 को मारने के लिए पर्याप्त हैं. आदेश में डाह prope का आकलन करने के लिएबैक्टीरियल प्रजातियों के rties कि इथेनॉल नसबंदी (जैसे बेसिलस प्रजाति) के लिए प्रतिरोधी रहे हैं, डिस्पोजेबल सुई इथेनॉल की नसबंदी की जगह (3.4 कदम) में एक अद्वितीय तनाव इंजेक्षन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है.
इस विधि के लिए आगे समायोजन पालन और / या एम. के हेरफेर में परिवर्तन को शामिल कर सकते हैं Sexta उदाहरण के लिए, कीड़े एक अधिक प्राकृतिक खाद्य स्रोत के रूप में टमाटर या तम्बाकू के पत्ते पर पाला जा सकता है. वैकल्पिक रूप से, एम. के विभिन्न विकास के चरणों Sexta लार्वा इस विधि द्वारा assayed किया जा सकता है. चौथा instar लार्वा उनके अपेक्षाकृत बड़े आकार के आधार पर चुना गया था, लेकिन छोटे लार्वा भी इस विधि द्वारा इंजेक्शन जा सकता है. पांचवें instar लार्वा, इंजेक्ट किया जा सकता है, लेकिन विकास के इस चरण के दौरान प्रतिरक्षा प्रणाली के लिए परिवर्तन देर से 5 वें instar अधिक जल्दी 5 वें instar 18 लार्वा से अतिसंवेदनशील लार्वा प्रस्तुत करना, संभावित डेटा विश्लेषण उलझी.
अंत में, प्रत्यक्ष इंजेक्शनविधि अन्य कीट प्रजातियों के साथ प्रयोग के लिए अनुकूलित किया जा सकता एम.. Sexta उच्च रोगजनक प्रजातियों के लिए एक मॉडल के मेजबान के रूप में प्रयोग किया जाता है क्योंकि यह अन्य (अधिक अतिसंवेदनशील) Galleria मेल्लोनेल्ला के रूप में इस तरह के मॉडल जीवों, की तुलना में संक्रमण की संभावना कम है जी. इस काम में 19 में वर्णित है, लेकिन विधि द्वारा इंजेक्शन मेल्लोनेल्ला किया जा सकता है, और परख बैक्टीरिया कम Xenorhabdus और Photorhabdus प्रजातियों की तुलना में अधिक उग्र प्रजातियों के लिए उपयोगी हो सकता है.
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Disclosures
ब्याज की कोई संघर्ष की घोषणा की.
Acknowledgments
लेखकों के लिए प्रयोगशाला गुडरिक - ब्लेयर के अतीत के सदस्यों का शुक्रिया अदा करना चाहता हूँ: इस प्रोटोकॉल के विकास के लिए उनके योगदान के लिए सामन्था Orchard, Kimberly Cowles, हरबर्ट ट्रॅन आयलैंड, ग्रेग रिचर्ड्स, Megan मेनार्ड, और Youngjin पार्क. यह काम राष्ट्रीय विज्ञान फाउंडेशन अनुदान IOS-0950873 और स्वास्थ्य एनआरएसए फैलोशिप FAI084441Z के राष्ट्रीय संस्थानों द्वारा वित्त पोषित किया गया था.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 90 mm filter paper | Whatman | 1001 090 | |
| Glass filter holder | Millipore | XX1004700 | |
| Manduca sexta eggs | Carolina Biological Supply | 143880 | |
| Gypsy Moth Diet + agar | MP Biomedicals | 0296029301 | |
| 5.5 oz. plastic containers and lids | Solo Cup Company | URC55-0090 Pl4-0090 | |
| 1 oz. plastic containers and lids | DART Container Corporation | 100PC 100PCL25 | |
| 1x PBS | 137 mm NaCl, 2.7 mM KCl, 8 mM Na2HPO4, 1.46 mM KH2PO4, pH 7.4 | ||
| Syringe | Hamilton | 80208 | 30 gauge, 0.375" length, point style 2 |
References
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