Her beskriver vi en fremgangsmåde til at kvantificere infektiøse partikler af murin norovirus (MNV), som er den eneste norovirus, som effektivt replikerer i cellekultur. Plak-assayet udnytter MNV s tropisme for murine makrofager og kan tilpasses til anvendelse med biologiske eller miljømæssige prøver indeholdende MNV.
Murin norovirus (MNV) er det eneste medlem af norovirus slægten, der effektivt vokser i vævskultur 1, 2. Cellelyse og cytopatisk virkning (CPE), i løbet af MNV-1-infektion af murine dendritiske celler eller makrofager 1. Denne egenskab ved MNV-1 kan anvendes til at kvantificere antallet af infektiøse partikler i en given prøve ved at udføre en plakassay 1. Plak-assayet er baseret på evnen hos MNV-1 for at lysere cellerne og til dannelse af huller i et sammenflydende cellemonolag, der kaldes plaques 3.
Flere teknikker kan anvendes til påvisning af virusinfektioner i vævskultur, høstet væv, kliniske og miljømæssige prøver, men ikke alle måle antallet af infektiøse partikler (f.eks qRT-PCR). En måde at kvantificere infektiøse viruspartikler er at udføre en plakassay 3, som vil blive beskrevet detaljeret nedenfor. En variant af MNV plakassay er fluorescent fokus assay, hvor MNV antigen immunfarvet i cellemonolag 4. Dette assay kan være hurtigere, da viral antigenekspression forud plakdannelse. Det er også nyttigt til titrering vira ikke kan danne plaques. Men det fluorescerende fokus assayet kræver flere midler ud over dem af plaque-assay, såsom antistoffer og et mikroskop for at tælle fokus-dannende enheder. Infektiøs MNV kan også kvantificeres ved at bestemme den 50% Tissue Culture infektiøs dosis (TCID50) 3. Denne analyse måler mængden af virus krævet for at producere CPE i 50% af inokulerede vævskulturceller ved endpoint titrering 5. Men dens detektionsgrænse er højere end i en plaqueanalyse 4.
I denne artikel beskriver vi en plaqueanalyse protokol der kan anvendes til effektivt at bestemme antallet af infektiøse MNV partikler er til stede i biologiske eller miljømæssige prøverne 1, 4, 6. Denne metode er based om forberedelsen af 10 gange serielle fortyndinger af MNV-holdige prøver, som anvendes til podning af et monolag af tolerante celler (RAW 264.7 murine makrofager celler). Virus får lov at binde sig til cellemonolaget i en bestemt tidsperiode og derefter suget før tildækning celler med en blanding af agarose og celledyrkningsmedier. Agaren muliggør spredning af virale afkom til naboceller og samtidig begrænse spredning til fjernt beliggende celler. Følgelig er inficerede celler lyseres og danner huller i monolag kendt som plaques. Ved tilstrækkelig spredning af virus, bliver plaques synlige efter farvning af celler med farvestoffer, såsom neutral rød, methylenblåt eller krystalviolet. Ved lave fortyndinger, stammer hver plak fra en infektiøs viruspartikel og dets afkom, som bredte sig til naboceller. Således, at tælle antallet af plaques gør det muligt at beregne plaque-dannende enheder (PFU) til stede i den ufortyndede prøve 3.
Plaque assay fremgangsmåde til MNV-1 præsenteret her er en måde at kvantificere infektiøse MNV partikler. Ved at følge analysetrin illustreret i figur 3, kan man opnå reproducerbare virale titere. Detektionsgrænsen for assayet afhænger af udgangsmaterialet anvendte fortynding. Ved start med en 1:10 fortynding af prøven, som beskrevet ovenfor, detektionsgrænsen af plaqueanalyse er 10 pfu (dvs., 1 plaque er synlig ved 10 -1 fortynding). Da hver plaque repræsenterer en enkelt virus kan plaqueanalyse også anvendes til at oprense klonale populationer af MNV ved at udvælge isolerede plaques og plantemateriale dem som beskrevet tidligere 1. Desuden kan plakoprensninger også anvendes til at adskille en individuel viruspopulationen fra blandede viruspopulationer. En begrænsning ved anvendelse af et plaque-assay til påvisning af MNV infektion er, at ikke alle MNV stammer danne plaques 4. Det kan imidlertid være muligt at overvinde inability af nogle MNV-stammer, isoleret fra dyr, til dannelse af plaks ved serievis passage disse virus i vævskultur 7. Et alternativ til plaqueanalyse er at måle infektiøse partikler via TCID50 teknikken 3, 4. Dette assay kvantificerer mængden af virus krævet for at producere CPE i 50% af inokulerede vævskulturceller efter endpoint fortyndinger og tager en uge at fuldføre for MNV 4. Ud over at være langsommere end en plaque-assay er TCID50-assayet endvidere ikke så følsomme (detektionsgrænse = 200 TCID50 / ml) på grund af toksiciteten af vævsprøver til RAW 264.7-celler fire.
Selvom kritiske skridt i protokollen er blevet beskrevet i hele protokollen følgende afsnit indeholder et resumé for at lette fejlfinding. Det mest kritiske trin i protokollen er at sikre, RAW 264.7-celler forbliver levedygtige hele assayet til at understøtte virusreplikation. Dette kanovervåges på hvert trin af assayet via lysmikroskopi. Cellelevedygtighed sikres på to måder. Først skal man være opmærksom på ikke at lade cellerne tørre ud, mens håndtering af plader. Således er pladerne inokuleret én ad gangen, rystet under infektionen tidsrum, og skal forblive lukket, når de ikke håndteres. For det andet, løsninger tilføjet på celler skal afbalanceres til ~ 37 ° C. Desuden er det afgørende for den generelle sundhed i RAW 264,7 celler til at opretholde dem i medier indeholdende lav endotoxin serum (<10 EU / ml), hvilket begrænser aktivering af celler. Derudover har vi observeret en højere fejlrate af plaqueanalyse ved anvendelse af celler fra passage 30 eller højere. Selv om dette sandsynligvis vil variere fra laboratorium til laboratorium, er det vigtigt at inkludere en positiv kontrol (fx en prøve med en kendt viral titer) for at sikre reproducerbare titere, navnlig når der anvendes højere passage RAW 264.7-celler. For at begrænse anvendelse af højere passage-celler, er det tilrådeligt at fastfryse hætteglas med tidlig Passage celler efter modtagelsen af RAW 264,7 celler og starte en ny kultur fra de frosne hætteglas ofte. Start forfra med lavpassage cellekulturer vil også være nyttigt, når cellerne udviser ændrede egenskaber, såsom manglende overholdelse af, ændringer i cellemorfologi (fx fra runde til ranglet og sprede ud), eller når forurening med mycoplasma er blevet opdaget. Et andet vigtigt punkt at være opmærksom på er at sikre, at pipettespidserne skiftes mellem prøverne og i fortyndinger. Dette vil sikre nøjagtige seriefortyndinger og forhindre krydskontaminering mellem prøverne. Den ene trin i protokollen, hvor samme pipettespidsen kan bruges igen, er, når seriefortyndinger af den samme prøve sættes til brøndene. I så fald bør man starte fra den mest fortyndede inokulum til den mindste, og energisk pipetteres op og ned i forbindelse med udarbejdelsen af en ny fortynding.
Plaque assayprotokollen kan ændres for flere modifikationer. Én modifikation, der kan foretages, når tHer er ikke nok celler til inokulering brønde in duplo, er at inokulere kun en enkelt brønd for hver fortynding. Eftersom inoculum volumen er 0,5 ml, antallet af plaques derefter skal multipliceres med en faktor på 2 omsætter til pfu / ml. Plak-assayet kan også tilpasses til anvendelse med andre adhærerende cellelinje der er i stand til at understøtte replikation af MNV, og dette er blevet beskrevet for det murine microglial BV-2 cellelinien 8. Andre modifikationer, som kan gennemføres, er tilpasninger, der er blevet beskrevet til plaqueanalyse protokoller udviklet for andre vira. Ved MNV er følgende modifikationer allerede gennemført med held, anvendelsen af methylcellulose i stedet for Sea Plaque agarose 9, og farvning af cellerne med krystalviolet eller methylenblåt i stedet for neutralt rødt 10, 11.
Generelt kan denne protokol nemt tilpasses efter behov for at kvantificere andre plakdannende vira eller anvendes til othøh virus, der forårsager lytiske infektioner i RAW 264,7 celler, hvilket gør det til et nyttigt redskab til at kvantificere infektiøse viruspartikler i almindelighed.
The authors have nothing to disclose.
Vi takker medlemmer af Wobus laboratorium for kritiske kommentarer og forslag. Arbejdet i laboratoriet af CEW blev finansieret af nystartede midler fra University of Michigan, en karriereudvikling tilskud fra NIH / NIAID Regional Center of Excellence for Bio-forsvar og Emerging Infectious Diseases Research (RCE) Program, Region V 'Great Søer 'RCE (NIH prisen 1-U54-AI-057.153) og NIH R01 AI080611. MBG-H. blev finansieret af Experimental Immunology (NIH T32 A1007413-16), og de molekylære mekanismer i Microbial Patogenese (NIH T32 A1007528) uddannelsesstipendier til University of Michigan. JBC blev finansieret af Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nivel Superior (kapper), Brasilia, Brasilien.
Name of the reagent | Company | Catalogue number |
DMEM/ High glucose | Hyclone | SH30243.02 |
2x MEM | Gibco | 11935 |
100x Penicillin and streptomycin | Hyclone | SV30010 |
10 mM Non-essential amino acids | Hyclone | SH30238.01 |
1M HEPES | Hyclone | SH30237.01 |
200 mM (100x) L-glutamine | Hyclone | SH30034.01 |
Fetal Bovine Serum | Gibco, Hyclone | 10437, SH30070.02 |
Sea Plaque Agarose | Lonza | 50100 |
Neutral Red 0.33% | Sigma | N2889 |
1x PBS | Gibco | 10010 |
1.0 mm Zirconia/Silica beads | BioSpec Products | 11079110z |
Model 35 Speed Rocker | Labnet | S2035 |
Magna Lyser Instrument | Roche | 03358968001 |
Raw 264.7 cell line | ATCC | TIB-71 |
Tissue culture incubator | Sanyo | MCO-18AIC |