Här beskriver vi en metod för att kvantifiera infektiösa partiklar av murint norovirus (MNV), vilket är den enda norovirus som effektivt replikerar i cellodling. Den plackanalys utnyttjar MNV s tropism för murina makrofager och kan anpassas för användning med biologiska eller miljömässiga prover innehållande MNV.
Murin Norovirus (MNV) är den enda medlemmen i Norovirus släktet som effektivt växer i vävnadskultur 1, 2. Cellys och cytopatisk effekt (CPE) observeras under MNV-1-infektion av murina dendritiska celler eller makrofager 1. Denna egenskap av MNV-1 kan användas för att kvantifiera antalet infektiösa partiklar i ett givet prov genom att utföra en plackanalys 1. Plack-analysen bygger på förmågan hos MNV-1 att lysera celler och bilda hål i en sammanflytande cellmonoskikt, som kallas plack 3.
Flera tekniker kan användas för att detektera virala infektioner i vävnadskultur, skördades vävnad, kliniska och miljöprover, men inte alla mått antalet infektiösa partiklar (t.ex. QRT-PCR). Ett sätt att kvantifiera infektiösa virala partiklar är att utföra en plackanalys 3, som kommer att beskrivas i detalj nedan. En variation på MNV plackanalysen är fluorescensföreningenescent fokus-analys, där MNV antigen immunofärgades i cellmonoskikten 4. Denna analys kan vara snabbare, eftersom virusantigen uttryck föregår plackbildning. Det är också användbart för att titrera virus inte kan bilda plack. Emellertid kräver fluorescerande fokus-analysen ytterligare resurser utöver dem av plackanalys, såsom antikroppar och ett mikroskop för att räkna fokus-bildande enheter. Infektiös MNV kan också kvantifieras genom bestämning av den 50% Tissue Culture Dos Infektiös (TCID 50) 3. Denna analys mäter mängden virus som krävs för att producera CPE i 50% av ympade vävnadskulturceller genom slutpunkt titrering 5. Emellertid är dess detektionsgräns högre jämfört med en plackanalys 4.
I den här artikeln beskriver vi ett protokoll plackanalys som kan användas för att effektivt bestämma antalet infektiösa MNV partiklar som finns i biologiska eller miljömässiga prover 1, 4, 6. Denna metod är based om förberedelserna inför 10-faldiga seriespädningar av MNV innehållande prover, som används för att ympa ett monoskikt av tillåtande celler (RAW 264,7 murina makrofagceller). Virus tillåtelse att ansluta till cellmonoskiktet under en given tidsperiod och därefter aspireras innan täcker celler med en blandning av agaros och cellodlingsmedia. Agar möjliggör spridning av viral avkomma till angränsande celler och samtidigt begränsa spridning till avlägset belägna celler. Följaktligen är infekterade celler lyseras och bildar hål i monoskiktet kallas plack. Vid tillräcklig spridning av viruset, plack blir synliga efter färgning av celler med färgämnen, såsom neutralt rött, metylenblått, eller kristallviolett. Vid låga spädningar, kommer varje plack från en infektiös viruspartikel och dess avkomma, som spred sig till angränsande celler. Sålunda räknar antalet plack gör att man kan beräkna plackbildande enheter (PFU) närvarande i outspädda provet 3.
Den plackanalys metoden för MNV-1 presenteras här är ett sätt att kvantifiera infektiösa MNV partiklar. Genom att följa de analyssteg som illustreras i figur 3, kan man erhålla reproducerbara virala titrar. Detektionsgränsen för analysen beror på den använda start utspädning. Vid start med en 1:10 spädning av prov som beskrivits ovan, är gränsen för detektion av plackanalys 10 pfu (dvs 1 plack syns på 10 -1 utspädning). Eftersom varje plack representerar en enda virus kan plackanalys också användas för att rena klonala populationer av MNV genom att plocka isolerade plack och föröknings dem som beskrivits tidigare 1. Dessutom, kan plackreningar också användas för att separera en enskild viruspopulationen från blandade populationer virus. En begränsning att använda en plackanalys för detektion av MNV infektion är att inte alla MNV stammar bildar plack 4. Emellertid kan det vara möjligt att övervinna inability av vissa MNV stammar, isolerade ur djur, för att bilda plack genom seriellt passage dessa virus i vävnadskultur 7. Ett alternativ till plackanalys är att mäta infektiösa partiklar via TCID 50 tekniken 3, 4. Denna analys kvantifierar den mängd virus som krävs för att producera CPE i 50% av ympade vävnadskulturceller efter endpoint utspädningar och tar 1 vecka att slutföra för MNV 4. Förutom att vara långsammare än en plackanalys är TCID 50 analysen inte heller så känsligt (detektionsgräns = 200 TCID 50 / ml) på grund av toxiciteten av vävnadsprov för RAW 264,7 celler 4.
Även kritiska steg i protokollet har beskrivits hela protokollet ger följande avsnitt en sammanställning för att underlätta felsökning. Det mest kritiska steget i protokollet är att säkerställa att RAW 264,7 celler förblir viabla genom hela analysen att stödja virusreplikation. Detta kanövervakas vid varje steg av analysen genom Ijusmikroskopi. Cellviabilitet säkerställs på två sätt. Först bör man inte låta cellerna torka vid hantering plattor. Således är plattorna inokuleras en i taget, gungade under infektionen perioden och bör förbli stängda när de inte hanteras. Andra lösningar läggs på celler bör vara jämvikt till ~ 37 ° C. Dessutom är det viktigt för den allmänna hälsan hos RAW 264,7 celler för att hålla dem i media innehållande låg endotoxin serum (<10 EU / ml), vilket begränsar aktivering av celler. Dessutom har vi observerat en högre felfrekvens i plackanalys vid användning celler från passagen 30 eller högre. Även om detta kommer sannolikt att variera från labb till labb, är det viktigt att inkludera en positiv kontroll (t.ex. ett prov med en känd virustiter) för att säkerställa reproducerbara titrar, speciellt när man använder högre passage RAW 264,7 celler. För att begränsa användningen av högre passage celler, är det lämpligt att frysa flaskor av tidig PassaGE celler vid mottagandet av RAW 264,7 celler och starta en ny kultur från de frysta flaskorna ofta. Börja om med låga kulturer passage celler kommer också att vara till hjälp när celler uppvisar förändrade egenskaper, såsom underlåtenhet att följa förändringar i cellmorfologin (t.ex. från runda till spinkiga och sprida ut), eller när mykoplasmkontaminering har upptäckts. En annan viktig punkt att uppmärksamma är att pipettspetsar ändras mellan prover och under spädningar. Detta kommer att säkerställa korrekta seriespädningar och förhindra korskontaminering mellan prover. Det ett steg i protokollet där samma pipettspetsen kan användas igen är när serieutspädningar av samma prov sättes till brunnarna. I så fall bör man börja från den mest utspädda inokulatet till minst och kraftfullt pipettera upp och ner vid upprättandet av ett nytt utspädning.
Den plackanalys protokollet är kan ändras på flera ändringar. En modifiering som kan göras när thär är inte tillräckligt celler för ympning brunnar i duplikat är att ympa en enda källa för respektive spädning. Eftersom inokulatet volymen är 0,5 ml, måste antalet plack sedan multipliceras med en faktor av 2 att normalisera till pfu / ml. Den plackanalys kan också anpassas för användning med någon annan vidhäftande cellinje som har förmåga att stödja replikation av MNV, och detta har beskrivits för den murina microglial BV-2-cellinjen 8. Andra modifieringar som kan genomföras är anpassningar som har beskrivits för protokoll plackanalys utvecklats för andra virus. Vid MNV har följande ändringar redan genomförts med framgång, användning av metylcellulosa istället för Sea Plaque agaros 9, och färgning av celler med kristallviolett eller metylenblått i stället för neutralrött 10, 11.
Sammantaget kan detta protokoll enkelt anpassas efter behov för att kvantifiera andra plackbildande virus eller användas för OTHER virus som orsakar lytiska infektioner i RAW 264,7 celler, vilket gör det ett användbart verktyg för att kvantifiera infektiösa viruspartiklar i allmänhet.
The authors have nothing to disclose.
Vi tackar medlemmar i Wobus laboratorium för kritiska kommentarer och förslag. Arbetet i laboratorium CEW har finansierats av nystartade fonder från University of Michigan, en karriärutveckling bidrag från NIH / NIAID Regional Center of Excellence för Bio-försvar och Emerging Infectious Diseases Research (RKS) Program, Region V stora Sjöar 'RCE (NIH utmärkelsen 1-U54-AI-057.153) och NIH R01 AI080611. MBG-H. har finansierats av Experimental Immunology (NIH T32 A1007413-16) och de molekylära mekanismer vid Microbial Pathogenesis (NIH T32 A1007528) utbildningsbidrag för University of Michigan. JBC har finansierats av Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nivel Superior (slängkappor), Brasilia, Brasilien.
Name of the reagent | Company | Catalogue number |
DMEM/ High glucose | Hyclone | SH30243.02 |
2x MEM | Gibco | 11935 |
100x Penicillin and streptomycin | Hyclone | SV30010 |
10 mM Non-essential amino acids | Hyclone | SH30238.01 |
1M HEPES | Hyclone | SH30237.01 |
200 mM (100x) L-glutamine | Hyclone | SH30034.01 |
Fetal Bovine Serum | Gibco, Hyclone | 10437, SH30070.02 |
Sea Plaque Agarose | Lonza | 50100 |
Neutral Red 0.33% | Sigma | N2889 |
1x PBS | Gibco | 10010 |
1.0 mm Zirconia/Silica beads | BioSpec Products | 11079110z |
Model 35 Speed Rocker | Labnet | S2035 |
Magna Lyser Instrument | Roche | 03358968001 |
Raw 264.7 cell line | ATCC | TIB-71 |
Tissue culture incubator | Sanyo | MCO-18AIC |