Summary
사이의 mutualism을 공부하려면
Abstract
Symbioses은 두 개 이상의 생물의 함께 사는 삶의 모든 왕국 전역에 널리 퍼져 있습니다. 지구상에서 가장 유비쿼터스 생물의 두 바와 같이, nematodes와 세균은 다양한 종류의 유익 1-3 병원성에 공생 협회의 다양한 배열을 형성하고 있습니다. 하나의 협회는 Xenorhabdus 박테리아와 공생 4의 모델 시스템으로 떠오르고있다 Steinernema nematodes, 사이의 상호 이익 관계입니다. Steinernema의 nematodes은 곤충에게 5 죽이기 위해 세균 symbiont을 사용하여 entomopathogenic 있습니다. 곤충 호스트 사이의 전송을 위해, 박테리아가 선충류의 infective의 청소년 단계 6-8의 장을 식민지화. 최근 몇 가지 다른 선충류 종은 곤충에게 9-13를 죽이고 박테리아를 활용하는 표시되었으며, 조사는 이러한 시스템에 nematodes와 박테리아 사이의 상호 작용을 조사하기 시작했습니다 <> 9 논의하게 될 것입니다.
우리는 현미경으로 볼 nematodes의 광학 투명성을 활용 이내 또는 선충류 호스트에 세균 symbiont의 시각화하기위한 방법을 설명합니다. 박테리아는 형광 현미경하여 시각화를 허용하는 형광 단백질을 표현하는 설계되었습니다. 많은 plasmids는 각각 다른 파장 (예 : 녹색 또는 빨간색), 그리고받는 세균 symbiont에 기증 대장균의 변종에서 plasmids의 활용에 형광 단백질을 인코딩 유전자가 박테리아의 광범위한 성공적으로 수행하는 사용할 수 있습니다. 설명 방법은 Steinernema carpocapsae와 Xenorhabdus nematophila 14 층 사이의 연결을 조사하기 위해 개발되었습니다. 비슷한 방법은 다른 선충류 - 세균 협회 9, 15-18을 조사하는 데 사용하고 접근 방식은 따라서 일반적으로 적용되었습니다.
메트로폴리스석탄 통은 협회와 식민지 14, 16, 19 과정의 성격에 통찰력을 제공, 개발의 여러 단계에서 nematodes에서 박테리아의 존재 및 현지화의 특성 수 있습니다. 현미경 분석은 조직 14, 16, 19-21를 호스팅하는 박테리아의 인구 및 현지화에서 식민지 주파수를 모두 보여줍니다. 여기에는 sonication 22 또는 식민지의 평균 수준을 제공 할 수있는 23, 연삭 등의 선충류의 인구, 내 세균을 모니터링하는 다른 방법에 비해 장점이지만, 예를 들어,있는 인구에서 낮은 symbiont로드의 높은 빈도로 인구 차별하지 않을 수 있습니다 높은 symbiont로드의 낮은 주파수. 식민지의 phenotypes 21 세균 돌연변이를 검사하거나 특성화 때 주파수 및 colonizing 박테리아의 부하를 차별하는 것은 특히 중요 할 수 있습니다24. 사실, 형광 현미경은 식민지 17, 18의 결함에 대한 세균의 돌연변이의 높은 처리량 검사에 사용하고, sonication 22, 25-27 및 개인 선충류의 해부 28, 29 등의 다른 방법보다 덜 힘든 것입니다되었습니다.
Protocol
1. 활용을 통해 형광 박테리아 스트레인의 건설
- 받는 사람 부담 (symbiont들이 검토되어 있어야합니다)와 기증자 부담 밤새 성장. 기증 변형, 보통 대장균은 활용을 통해 DNA를 기부 할 수 있어야하고 함께 변화해야 형광 단백질을 인코딩 유전자를 운반 그 (표 2) 플라스미드. 플라스미드에 따라 활용 도우미 부담도 필요할 수 있습니다. 이 경우,이 변형은 하루 아침에 성장해야합니다. 기증자 변형 및 도우미 변형은 플라스미드의 유지 보수를 위해 선택하는 항생제로 성장해야합니다.
- 중간에 문화의 1:100 비율로 항생제를 부족한 영양이 풍부한 성장 미디어에 기증자, 도우미, 그리고받는 긴장을 하위 문화.
- 사람들이 중간 로그 단계 성장 (OD 600 ~ 0.6)에 도달 할 때까지 각 변형에 적합한 온도 문화를 성장. Xenorhabdus 및 E.를위한 이 단계 성장의 대장균일이 subculturing 후 약 3-4 시간에 도달합니다. 이 변형에 따라 다릅니다, 또는 경우에 플라스미드가 사용 할 수 있습니다.
- microcentrifuge 튜브 및 17,900 XG (대부분의 microfuges의 13,000 RPM)에서 2 분을위한 원심 분리기에 긴장을 섞는다. 최상의 결과를 얻을 기증자와받는 사람의 비율이 다른 조합에 따라 다를 것이며, 경험적으로 결정해야 할 수 있습니다. Xenorhabdus받는 사람 및 E.를위한 대장균 기증자, 우리는 3시 1분 또는 1시 1분 비율을 사용합니다. 도우미 변형은 (예를 들어 대장균) 필요한 경우,이 기증자와 같은 비율에 추가해야합니다.
- 표면에 뜨는을 가만히 따르다.
- 신선한 미디어의 30 μl의 세포 펠렛를 다시 일시 중지합니다.
- 항생제없이 영양 리치 미디어 판 위에 정지를 발견하고, 그 자리가 건조 할 수 있습니다.
- 기증자에 대한받는 사람 세균과 허용 (및 헬퍼, 해당되는 경우)에 대한 최적의 온도에서 하룻밤 역 판을, 품다. 판은해야최소 18 시간을 incubated 수.
- 선택적 항생제 판에서 단일 콜로니를위한 장소와 탄력을 쳤어요. 항생제는 기증자에 대해와 플라스미드를 포함하는받는 사람에 대한 선택해야합니다. 하나 또는 두 개의 추가 절연 줄무늬는 순수한 문화를 분리해야 할 수도 있습니다.
- 그 결과 식민지 이러한 식민지의 형태, 또는받는 특정 유전자의 중합 효소 연쇄 반응 검출로받는 특정 phenotypes의 존재에 대한 심사하여받는 사람 symbiont, 아닌 기증자의 부담입니다 확인하십시오. 알려진 플라스미드 순서 및 형광의 중합 효소 연쇄 반응에 의해 플라스미드의 존재에 대한 식민지 화면. 식민지는 형광 단백질에 해당하는 올바른 파장에서 형광을해야합니다.
2. Axenic 선충류의 계란 생산
- 밤새 자연 박테리아 symbiont의 5 ML을 성장. 문화를 시작하려면 박테리아는 Lysogeny 국물 (LB) 또는 기타 세제곱에 주사 할 수 있습니다직접 냉동고 주식이나 탄력 판에서 lture 미디어.
- 10mm의 지질 한천 (LA) 플레이트 29에 박테리아 문화를 600 μl를 벌리고. 8 주에서 10 접시는 대부분의 종에 대한 충분한 nematodes를 얻을 수 있습니다.
- 이틀 동안 25 ° C에서 수분이없는 어둠 속에서 알을 품다.
- 세균 잔디에 미디어 500 μl에 사용되는 선충류에 따라 5000 infective 청소년 nematodes, 또는 다른 단계를 추가합니다. 3 일 동안 25 ° C에서 접시를 품다.
- 성인 nematodes, 계란의 존재에 대한 번호판을 확인합니다. 현미경 슬라이드에 물을 20 μl를 추가합니다. 세균 잔디에서 흠집 업 소량의 nematodes의 살균 스틱을 사용합니다. 물에 스틱을 놓고 nematodes가 꺼져 수영 할 수 있습니다. 낮은 배율에서 슬라이드보세요. 외관에 대한 자세한 내용은 토론과 그림 2를 참조하십시오.
- 달걀과 여성가 표시되는 경우, 계속, 그렇지 않으면, 25 & D에 접시를 품다예를 들어, 적절한 개발마다 6-12 시간에 대한 C 등을 확인합니다. 여성이 계란을 포함하면 플레이트의 표면에 물을 몇 ML를 놓습니다. 부드럽게 소용돌이 접시하고 50 ML 원뿔 튜브에 물을 끼얹어 주죠. Nematodes는 접시에서 뛰어 와서 더 이상 플레이트 표면에 표시 할 수 없습니다. 여러 린스가 필요 할 수 있습니다.
- nematodes는 튜브의 바닥에 정착 할 수 있도록 허용합니다.
- nematodes을 씻어. 관의 상단에서 초과 물을 피펫. 깨끗한 물과 성인 nematodes가 정착 할 수있는 리필. 초과 물을 피펫.
- 계란 솔루션과 원뿔 튜브를 입력합니다. 계란 솔루션이 추가되면 계란 솔루션을 통해 모든 단계의 타이밍은 정확히 최대 계란 생산량에 대한 설명을 수행해야합니다. 부드럽게 정확히 10 분에 진동하는 동안 튜브를 품다. 대부분의 nematodes는 부화의 말에 해산해야합니다.
- 즉시 (이 속도 원심 분리기를 가져 포함 정확히 10 분에 1,250 XG에서 원뿔 튜브를 원심 분리기하지만 아래로 0 X g합니다. ) 브레이크를 사용합니다.
- 즉시 표면에 뜨는을 가만히 따르다.
- 즉시 pipetting하여 계란 솔루션 펠렛을 다시 일시 중지합니다.
- 즉시 계란 솔루션 원뿔 튜브를 기입 반전 3-5 배 잘 섞는다. 그런 다음 즉시 2.10에서와 같이 회전.
- 즉시 표면에 뜨는을 가만히 따르다.
- pipetting하여 LB에 펠렛를 다시 중지 세척 단계에서 개선 pelleting에 15 ML 원뿔 튜브로 전송할 수 있습니다. LB는 Steinernema 종에 대한 표준입니다. 다른 버퍼는 (최소한의 소금 매체를 예를 들어) 버퍼 선충류 나 세균 중 하나를 손상하지 않아야 염두에두고, 선충류 및 세균에 따라 사용할 수 있습니다.
- 2.10에서와 같이 LB와 스핀과 함께 튜브를 채 웁니다.
- 표면에 뜨는을 가만히 따르다, 그리고 LB에 다시 일시 중지합니다.
- 2.14와 2.15를 반복하여 nematodes 3 번씩 총 씻어.
- 적절한 볼륨으로 다시 중단 선충류의 알을 희석. 마이크로 리터 당 최소 10 알이 있어야합니다. 예GS는 colonizing 박테리아의 성장을 억제 항생제를 추가하고 parafilm의 판을 배치하여 최소한 4 일 동안 5 ML의 LB에 6 cm 배양 접시에 저장할 수 있습니다. 계란은 사전 박테리아 잔디에 inoculating에 한 번 15 ML의 LB (2.13 및 2.14에서와 같이)에서 세탁해야합니다. 계란이 기간 동안 부화하고 식민지의 assays에 사용하면 발달 동기화되지 않을 수 있습니다.
3. 형광 박테리아와 공동 배양 분석
- 필요한 경우 플라스미드에 대한 선택, 하루 아침에 형광 박테리아를 성장.
- 멸균 몽둥이로 10mm의 지질 한천 플레이트에 박테리아 문화를 600 μl를 벌리고. 2 일 25 ° C에서 알을 품다.
- 각 지질 한천 플레이트로 100-400 μl (200 μl에 최적 2,000 nematodes)의 총 장소 500-5,000 axenic 선충류의 알을.
- 25 습기가없는 어둠 속에서 길러 ° C를 IJs, 또는 관심, 폼의 다른 단계까지. IJs는 쿵푸으로 볼 수 있습니다접시의 가장자리에 zzy 흰색 링. 다른 삶의 단계에서 볼, 프로토콜 4를 참조하십시오.
- 수정 화이트 트랩 30 접시를 놓습니다. 지질 한천 플레이트의 뚜껑을 제거하고 빈 100mm X 20mm 페트리 접시의 바닥에 바닥을 배치합니다. 작은 접시를 둘러싸고있는, 물이있는 대형 페트리 접시 또는 선충류에 적합한 다른 버퍼를 채 웁니다. 수위 작은 접시의 약 절반 높이 여야합니다.
- 자손의 IJs가 버퍼에 등장 할 때까지 물 트랩을 품다.
- Infective의 청소년의 nematodes은 조직 배양 플라스크에 물에 저장할 수 있습니다.
4. 검사에 대한 조기 생활 단계의 수집
- 사용 분석을 설정하려면 3.4을 통해 3.1 단계를 반복합니다.
- 원하는 삶의 단계가 존재 때까지 접시를 품다. 매일 시각적 인 검사는 타이밍을 결정해야 할 수도 있습니다. 접시를 검사하려면 프로토콜 2.5에서 설명하는 절차를 사용합니다. S.에 대한 carpocapsae X.과 m> eggsgrown LA 판에 nematophila, gravid의 여성 4-5 일 현재되고, 청소년 7 일에 존재하며, infective의 청소년이 15~17일에 의해 생성 될 시작합니다.
- 원하는 삶의 단계가 존재하면 샘플을 수집합니다. 200 PBS의 μl 또는 기타 적절한 버퍼와 96 잘 접시의 우물을 입력합니다. 부드럽게 nematodes가 들어있는 세균 잔디의 일부를 다 쳤어요. 완두콩 크기의 금액 (~ 50 밀리그램)은 F1 자손이 생성 된 후 백 회에 여러 nematodes을 제공 할 것입니다,하지만 더 이전 시점 지점 필요할 수 있습니다. 잘 포함 버퍼에 메모리를 놓습니다.
- 분에 30 초에 품다. 스틱을 제거하고 남은 잔류 물을 다 쳤어요. 우물에서 모든 한천을 제거 스틱을 사용합니다. nematodes는 버퍼 내에서 표시됩니다. 깨끗한 microfuge 관에 버퍼 혼합물을 이동합니다.
- levamisole 또는 기타 전신 마비 요원과 함께 nematodes을 취급합니다. 30 & 무에 levamisole 몇 입자를 분해, 물에 들어. 샘플의 각 50 μl이 혼합 1-2 μl를 추가합니다. levamisole 치료 후 nematodes은 비 가능한 것입니다.
- 샘플은 나중에 볼 수 경우이 단계에서 설명한대로 수정합니다. 그렇지 않은 경우, 4.6 단계로 건너 뜁니다. 1X 버퍼와 4 % paraformaldehyde가 포함 된 정착액 솔루션 200 μl를 추가합니다. 부드럽게 혼합, pipetting은 섬세한 삶의 단계가 lyse 될 수 있습니다. 호일로 커버하고, 최소 18 시간이 부족에 쉐이커에 실온에서 알을 품다.
- 튜브 랙에 튜브를 삽입하고, nematodes는 튜브의 바닥에 정착 할 수 있습니다.
- 배경을 제거 할 nematodes을 씻어. 초과 액체를 피펫 200을 추가 - 버퍼 500 μl 부드럽게 섞는다. 반복합니다. 이것은 원하는 경우 몇 배 더 배경을 제거하는 반복 될 수 있습니다.
- nematodes는 튜브의 바닥에 정착하여 원하는 볼륨에 다시 일시 중지 할 수 있습니다.
- 즉시 nematodes가 해결되지 않으면 화면. 고정 nematodes은 최대 냉장고에 저장 될 수2 주. 어둠 속에서 저장합니다.
5. 현미경으로 박테리아 협회에 대한 검사 Nematodes
- 귀하의 혼합물의 작은 샘플을 제거하여 현미경으로 볼 수 있습니다 몇 가지 nematodes을 선택합니다.
- nematodes이 그림에 대해 아직 확인하려면 프로토콜 4.5에 설명 된대로 마비 요원과 치료. 당신이 사진을 찍을되지 않거나 nematodes가 이미 해결 된 경우이 단계는 생략 될 수 있습니다.
- 귀하의 현미경 슬라이드에 물에 nematodes의 20-30 μl를 추가하고 상단에 coverslip를 놓습니다.
- nematodes가 시야에 보장하기 위해 빛을 현미경을 사용하여 전체 nematodes를 볼 수 있습니다.
- 박테리아에 의해 표현 형광에 해당하는 현미경에 형광 설정을 사용하여 nematodes를 볼 수 있습니다.
- 박테리아 현지화를 확인하려면, 형광등 설정 및 가벼운 현미경 설정에서 선충류의 사진을 한 다음 이미지를 비교하십시오. 사진은 같은 fiel의 할 필요가보기 D. 그것은 박테리아를 찾기 위해 선충류의 여러 배율과 전망을 시도해야 할 수 있습니다.
- 선충류의 식민지의 배포는 박테리아의 유무에 골을, 그리고 %가 식민지 계산 nematodes의 인구를 계산하여 정량화 할 수 있습니다. 우리는 인구 내에서 최소 30 nematodes가 신뢰할 수있는 값을 얻기 위해 (식민지와 함께 또는없이) 각 카테고리에서 계산 될 때까지 계산하는 것이 좋습니다.
- 인구의 몇 nematodes가 식민지 때, 그것은 30 일 이전에 천 몇 nematodes를 계산 할 필요가 관찰 될 수 있습니다. 높은 처리량 계산에 대해 다음 단계를 사용하십시오.
- 멀티 잘 판에 대신 개별적으로 nematodes을 집계, 나누어지는 인구 (24 잘 판을 예). nematodes은 접시의 바닥에 정착 한 후, 각 잘은 현미경을 스캔 할 수 있으며, 식민지 nematodes의 수는 채점 할 수 있습니다.
- nematodes의 총수 전NA 인구가 우물에 nematodes의 일련 dilutions로 식별 할 수 있습니다. 예를 들어, nematodes 1 ML을 추가 할 수 있습니다 자, 자 pipet 팁, 3 μl로 교반하여 혼합이 제거되고 잘에 전체 인구의 정량화를 위해 계산 될 수있다.
- 식민지 nematodes의 비율은 잘에 nematodes의 총 횟수로 식민지의 수를 나누어받을 수 있습니다.
6. 대표 결과
Xenorhabdus 박테리아와 관련된 Steinernema의 nematodes의 예를 들어 현미경 이미지는 그림 3에 표시됩니다. 도 3a에 볼 수있는 복합 이미지를 만들려면 위상 콘트라스트 이미지는 형광 이미지를 중첩되었습니다. 그림 3A의 화살표는 박테리아가 infective 청소년 선충류 (바 = 100 μm)에서 제시 나타냅니다. 그림 3B는 유사한 방식으로 구축 및 청소년 선충류 무선 인터넷 접속을 묘사 한일 녹색 형광 단백질이라는 박테리아 (녹색 막대)는 선충류 장 루멘 (바 = 20 μm)를 통해 번역. 이 미디어에서 nematodes의 인구는 세균 symbiont (표 1)에 의해 계산과 식민지에 대한 채점했다. 강력한 통계를 들어, 최소 30는 각 카테고리에서 추락 샘플 당 최소 100 nematodes를 계산하는 것이 가장 좋습니다. 표 1에서 보는 간 신장 한천에 커서 지질 한천과 68.6 %에 성장했을 때,이 nematodes은 약 14.6 %의 수준에 식민지됩니다. 다른 선충류 및 박테리아 종은 식민의 다른 수준을 가지고 표시되었습니다. 예를 들어 X 용 nematophila은 S.의 99 %를 colonizes carpocapsae infective의 청소년 (Martens 2003), 그리고 P. luminescens는 H. 26 %를 colonizes bacteriophora의 infective의 청소년 (Ciche 2003).
1 그림. 방법의 개략적 인 개요. A. 세균은 형광 단백질을 표현하는 설계되었습니다. B.의 선충류 달걀은 무균 nematodes를 생성하기 위해 성인 nematodes에서 격리됩니다. C. 살균 nematodes은 형광 박테리아와 공동으로 재배되고있다. D.는 그 결과 삶의 단계는 아래 봅니다 현미경은 선충류 내 박테리아의 존재를 평가합니다.
그림 2. 계란을 포함하는 성인 여성의 묘사. A.이 도식은 Steinernema의 여성의 일반적인 모습을 보여줍니다. 삽입 : S.의 DIC 이미지 feltiae 여성을 gravid. 검은 색 화살표는 소문을 나타냅니다. 흰색 화살표가 표시 달걀을 보여줍니다. 이미지 20X 배율에 있으며, 규모 바는 100 μm를 나타냅니다. 개발하지만 unhatched S.의 B. DIC 이미지선충류의 계란을 feltiae. 이미지 40X 배율이며, 규모 바는 50 μm를 나타냅니다. 알 C. DIC 이미지는 고립 된 S.에서 10X 배율에서 nematodes을 feltiae. 스케일 바는 100 μm이다.
선충류 - 박테리아 협회의 그림 3. 예 현미경 이미지. A. S. puntauvense의 nematodes들은 세균 symbiont, X.와 관련된 bovienii, 표현 GFP. 이미지보기 같은 분야에서 형광 이미지와 위상 콘트라스트 이미지를 오버레이에서 생산 합성 이미지입니다. 화살표는 선충류 호스트 내에서 형광 박테리아 symbiont을 나타냅니다. 스케일 바는 100 μm를 나타냅니다. B.이 이미지는 S.를 보여줍니다 GFP-표현 X.과 carpocapsae 청소년 선충류 nematophila은 선충류의 장에서 번역.이 이미지는 차동 간섭 대비 이미지 위에 형광 이미지를 오버레이를 통해 건설되었습니다. 규모 바는 20 μm를 나타냅니다.
| 변형 | acteria으로 Nematodes 수 | 총 Nematodes이 셌어 | Nematodes 비율 olonized |
| S. puntauvense의 지질 한천 | 30 | 205 | 14.60 % |
| S. puntauvense 간 신장 한천 | 72 | 105 | 68.60 % |
표 1. 박테리아의 존재에 대한 선충류 인구의 예 점수.이 실험에서, axenic S. puntauvense의 nematodes은 식민지 결함에 대한 테스트하기 위해 다른 성장 미디어에서의 GFP-표현 symbiont (지질 한천과 간 신장 한천 32)로 성장했다. 적어도 하나 hundre 총샘플 당 D nematodes은 박테리아의 존재에 대한 계산 및 채점했다. 통계 권력에 대한 세 실험은 각 카테고리에서 떨어지는 최소 30 nematodes으로 계산해야 복제합니다.
표 2. 형광 단백질을 포함 plasmids은. 세균 symbiont에 형광 단백질 삽입에 대한 잠재적 plasmids의 목록이 플라스미드의 이름으로 나열 제공됩니다. 포함 된 다른 정보는 플라스미드 유지 보수에 사용되는 형광 단백질 인코딩, 항생제 카세트, 사용을위한 다른 방법, 플라스미드의 소스입니다. 괄호에 명시된 농도는 X.에 사용 된 항생제의 농도이다 nematophila. 이러한 plasmids의 각 Xenorhabdus 또는 Photorhabdus 중 하나에서 성공적으로 사용되었습니다. 추가 정보는 언급 인용에서 얻을 수 있습니다. 따라테스트중인 세균에 일부 plasmids은 형광 단백질, 항생제 선택, 삽입 사이트 또는 복제 기원에 따라 작동하지 않을 수 있습니다. 위의 목록에 plasmids 관심 세균에 사용을 활성화 할 수 있습니다 다양한 기능이 포함되어 있습니다. 예를 들어, 염색체의 attTn7 사이트에 미니 Tn7 - KSGFP 삽입시키고, 그 X.에 pECM20 삽입 상동 재조합에 의해 nematophila의 염색체. 또는 pPROBE의 plasmids은 extrachromosomally 유지하고, 플라스미드 각 pPROBE 같은 백본과 형광을 가지고 있지만 분류 학적 또는 돌연변이 배경을 다양한 사용을 활성화하기 위해 다른 선택 아이콘이나 복제의 기원을 갖추고 있습니다.
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Discussion
여기에 설명 된 프로토콜은 선충류 호스트 (그림 1) 내 세균의 광학 감지하는 방법을 제공합니다. 이 방법은 선충류 호스트 (그림 3)에서 박테리아의 생체 분석 있도록 nematodes의 광학 투명성과 휘황 라벨 박테리아 할 수있는 능력을 활용합니다. 특히,이 방법은 호스트 내에서 세균 현지화를 식별합니다. 박테리아의 존재에 대한 선충류 인구 및 점수를 계산함으로써, 선충류 인구에서 박테리아 식민지의 빈도는 (표 1) 결정될 수있다. 이 방법은 선충류의 호스트와 세균 symbionts 사이의 상호 작용을 연구에 활용 될 수있는 잠재적 인 기술 중 하나입니다. 관련 방법은 세균 symbiont를 분리 axenically nematodes 성장하고, 파트너 25-27 모두를 조작하기 위해 이전에 설명되어 있습니다.
프로토콜은 H 설명오히려이 Xenorhabdus nematophila-Steinernema carpocapsae 모델 시스템 14 개발 및 유사한 접근 방식은 다른 entomopathogenic 선충류 - 세균 협회 9,15,17,18에 사용되었습니다. 여러 조건이 다른 선충류 - 세균성 시스템에이 방법을 적용하기 위해 충족되어야합니다. 첫째, 세균 symbiont는 호스트 격리와 독립적으로 문화에 성장 할 수 있어야합니다. 둘째, symbiont는 형광 단백질을 도입하기 위해 변형하거나 활용을 통해 DNA를 차지 할 수 있어야합니다. 셋째, 최상의 결과를 위해, 선충류는 axenic와 박테리아에 다시 제출하실 수 있습니다 단계가 있어야합니다. 대신 형광 박테리아의 잔디밭에 axenic 달걀을 추가하는, 통상 제기 삶의 단계를 추가하고 설명 된대로 프로토콜을 진행 : 그러나, 선충류가 세균으로부터 격리 할 수없는 경우에도 당신은 여전히 연결을 시각화 할 수 수 있습니다. 모든 결과는주의의 일에서 고통을 것입니다명시 GFP 특정 선충류의 조직에 대한 현지화에 GFP-표현 박테리아와 경쟁하고,이 때문에 설정하지 않는 박테리아에서, 식민지는 미세 계산에 의해 측정 될 수 없습니다. 그러나, 않는 한 크게 GFP를 표현하지 않는 박테리아 outcompete GFP-표현 박테리아를, GFP-표현 박테리아가 인구의 적어도 일부 동물에서 선충류의 조직에 현지화 및 박테리아 식민지에 중요한 조직 사이트를 제안한다. 형광 단백질 표현 변종을 사용하는 오랜주의해야 할 점은 그들이 (예 : 12) 형광 단백질을 표현하지 않는 변종 다른 효율 호스트를 이식 할 수 있다는 것입니다.
이 프로토콜에 설명 된 단계는 사용중인 선충류와 세균 종에 따라 최적화가 필요할 수 있습니다. 세균의 활용을 위해 변경 될 수있는 몇 가지 조건의 길이와 온도 성장,받는 사람에게 기증자의 비율, 그리고 혈장 아르이드 사용됩니다. 관련 plasmids의 예는 표 2에 나열되어 있습니다. 이러한 plasmids의 모든 성공적으로 선충류 호스트 14,17,20,24,33-35과 관련하여 Xenorhabdus 또는 Photorhabdus 박테리아 중 하나에 사용되었습니다. 선충류의 식민지 동안 형광 단백질의 안정적인 유지 보수를 보장하려면 대상 세균의 염색체에 삽입됩니다 플라스미드를 사용하는 것이 좋습니다 것입니다. 또한, 일부 박테리아는 이러한 plasmids을 차지하지 않을 수 있습니다. 예를 들어, pECM20는 X.에 사용되었습니다 대상 세균이 지역이 부족하면 플라스미드 삽입하지 않습니다, 플라스미드와 염색체 사이의 상동 영역을 사용하여 염색체에이 플라스미드 삽입 있기 때문 nemtaophila 매우 밀접하게 박테리아 변종에게 14 관련. 다른 박테리아, X.이 플라스미드를 사용하려면 nematophila - 특정 지역이 대상 세균의 게놈 영역으로 대체해야합니다. 일부 플라스미드 - 변환 방식은 R도됩니다프로토콜 1 일부터 특정 변경을 equire. 예를 들어, 미니 TN 7 KSGFP 및 pBK - miniTn는 7 ΩGm-DsRed 세균 염색체에 삽입 할 도우미 플라스미드가 포함 된 전위 유전자 (tsnABCDE) 33,35,36이 필요합니다. 활용은 2 시간 문화 (~ OD 600 0.3-0.4)가 같은 비율로 혼합이 TN plasmids 7 기반이 가장 효율적입니다.
성공적으로 활용 한 후에는 사용 된 플라스미드에 해당하는 올바른 선택 접시를 활용하는 것이 중요합니다. 선택적 판은 기증자와 도우미 긴장에 대해받는 사람과 카운터 선택에서 플라스미드의 존재에 대한 선택 플라스미드에 인코딩 된 항생제를 포함해야합니다. 예를 들어, X.에 pECM20를 결합 할 때 사용 nematophila 이의 선택은 암피실린 때문에 X.입니다 nematophila는 암피실린 저항이며, 기증자의 부담은 암피실린 민감하다. 항생제 카운터 선택은 Y에서 사용할 수없는 경우시스템, 기증자를 필요로 diaminopimelic 산 (DAP)를 사용할 수 있습니다. 성장 DAP를 필요로하는 변종, DAP는 사전 활용 및 활용 단계에서 고체 및 액체 성장 미디어에 추가, 및 카운터 - 선택 단계에서 생략됩니다. DAP가없는 기증자 변형 성장하지 않으며 경우에 효과적으로 카운터 선택.
성공적으로 계란 절연을 보장하려면 정확하게 계란 생산 (그림 2)를 확인하는 것이 필수적입니다. 고립 당시 여성 nematodes은 알이 가득 있어야하고 계란은 미디어 (그림 2A)에 표시됩니다. 여성 nematodes은 수정 된 알을 생산하는 경우 적어도 표면에 뜨는 달걀은 가시적 unhatched nematodes (그림 2B)로 개발 한 것입니다. S.에 대한 carpocapsae는 알이 약간 전에 nematodes 및 부화 개발에 직사각형하는 구면에서 변경됩니다. 선충류 성장의 타이밍이나 조건은 수정 된 난자을 최대화하기 위해 변경해야 할 수도 있습니다단축하거나 길게 기간을 계란 수확하기 전에, 또는 다른 미디어 특정 선충류 종에 맞는를 사용하여 포함 얻을 수 있습니다. 고립의 끝에서 알 버퍼 (그림 2C)에 쉽게 볼 수 있습니다. 최적화가 필요할 수 있습니다 계란 격리 프로토콜의 매개 변수는 계란 솔루션 표백제와 코 농도, 달걀 솔루션 배양 시간, 또는 원심 분리 속도 등이 있습니다. 계란 절연이 계란을 생산하고 있지만 nematodes가 공동 재배 기간 동안 개발되지 않으면, 그것은 고립 된 계란이 아닌 가능한 것을 수 있습니다. 생존 확인하려면, 버퍼에 고립 된 알을두고 nematodes이 부화하기까지 기다립니다. 알은 고립 중 하나 또는 두 일 이내에 부화해야하고 청소년 nematodes은 공동 재배 검정에서 사용할 수 있습니다. 달걀 부화하지만 공동 재배 검정 동안 개발하지 않는 경우, 공동 재배에 사용되는 성장 조건이나 매체를 변경해야 할 수도 있습니다. 우리는 이전 studie에 유의s은 (는) 항생제 칵테일 (예 : 3,37)에 nematodes을 몸을 담글 수에 의해 박테리아 무료 nematodes를 분리했습니다. 우리가 여기서 설명하는 방법은 정균 항생제, 항생제 내성 세균 오염 및 nematodes에서 항생제 효과를 사용하여이있는 합병증을 포함한 항생제 몸을 담글 수의주의 사항 중 일부는 무료입니다. nematodes의 일부 단계는 또한 항생제에 저항력이 3의 세균 symbionts을 유지 할 수 있습니다. 마지막으로, 우리는 현미경을위한, 선충류의 고정에 필요한 levamisole의 농도가 다른 선충류의 clades에 따라 달라질 수 있습니다.
이 방법은 관심의 시스템에 설립되면, 그것은 더 많은 정보를 도출하는 기술을 변경 할 수 있습니다. 선충류 수명주기 (프로토콜 4)에서 이전 시점 지점을보고, 하나는 박테리아와 선충류가 협회 14,16를 시작 방법을 파악 할 수 있습니다. 또한이 접근 방식은 t를 사용할 수 있습니다식민지 17,18을 감지하는 형광을 사용하여 공생에 관여 박테리아 요소를 식별 할 수있는 높은 처리량 돌연변이 화면을 수행 Ø. 이러한 서명 태그 mutagenesis와 같은 다른 방법은 radioactively 분류 프로브의 사용을 요구하고 22,28 소요 시간입니다. 따라서, nematodes에서 세균 symbiont 시각화에 대한 형광 현미경의 사용은 선충류 호스트 세균 상호 작용을 조사하기위한 효과적이고 효율적인 심사 도구입니다.
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Disclosures
관심 없음 충돌이 선언 없습니다.
Acknowledgments
저자는 사용이 프로토콜과 도구의 발전에 기여 Eugenio Vivas, 커트 Heungens, 에릭 Martens, 찰스 Cowles, 다비 설탕, 에릭 Stabb, 그리고 토드 Ciche 감사하고 싶습니다. KEM 및 JMC는 건강의 국립 연구소 (NIH) 국립 연구 서비스 상 T32 (AI55397 "건강과 질병에 미생물")에 의해 지원되었다. JMC는 국립 과학 재단 (National Science Foundation) (NSF) 대학원의 연구 활동에 의해 지원되었다. 이 작품은 국립 과학 재단 (National Science Foundation) (IOS-0920631 및 IOS-0950873)의 보조금에 의해 지원되었다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Lipid Agar (sterile) |
8 grams nutrient broth, 15 grams agar, 5 grams yeast extract, 890 ml water, 10 ml 0.2 g/ml MgCl2. 6H20, 96 ml corn syrup solution*, 4 ml corn oil* Stir media while pouring plates *add sterile ingredient after autoclaving |
||
| Corn Syrup Solution (sterile) |
7 ml corn syrup, 89 ml water mix and autoclave |
||
| Egg Solution | 16.6 ml 12% sodium hypochlorite, 5 ml 5M KOH, 80 ml water | ||
| Lysogeny Broth (sterile) |
5 grams yeast extract, 10 grams tryptone, 5 grams salt, 1 L water mix and autoclave |
||
| Microfuge | Fisher | 13-100-675 | Any microfuge that holds microfuge tubes will work |
| Centrifuge | Beckman | 366802 | Large table top centrifuge that holds 15 ml and 50 ml conical tubes |
| Sterile 60 mm X 15 mm Petri Dish | Fisher | 0875713 | |
| 50 ml centrifuge tubes | Fisher | 05-539-6 | |
| 15 ml centrifuge tubes | Fisher | 05-531-6 | |
| Sterile 100 mm X 20 mm Petri Dish | Fisher | 0875711Z | Deeper than standard Petri dishes |
| 24-well plate | Greiner Bio-One | 662000-06 | |
| Microscope | The microscope needs florescent capabilities compatible with your fluorophore | ||
| Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 15710 | |
| PBS (sterile) |
8 g NaCL 0.2 g KCL 1.44 g Na2HPO4 0.24 g KH2PO4 1 L water Adjust to a pH of 7.4 and water to 1 L and autoclave |
||
| Microfuge tubes | Fisher | 05-408-138 | 2 ml or 1.5 ml tubes |
| Shaker | Any shaker that causes the liquid to gently move will work | ||
| Diaminopimelic acid | Sigma | D-1377 | If needed, supplement media to a concentration or 1 mM |
References
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