Summary
Å studere mutualism mellom
Abstract
Symbiose, den lever sammen av to eller flere organismer, er utbredt i alle riker av livet. Som to av de mest utbredte organismer på jorden, nematoder og bakterier danner et bredt utvalg av symbiotiske foreninger som spenner fra gunstig for sykdomsfremkallende 1-3. En slik sammenheng er det gjensidig fordelaktig forhold mellom Xenorhabdus bakterier og Steinernema nematoder, som har dukket opp som et modellsystem for symbiose 4. Steinernema nematoder er entomopathogenic, ved hjelp av sin bakteriell symbionten å drepe insekter 5. For overføring mellom insekt verter, bakterier kolonisere tarmen av nematode er infeksiøs yngelstadiet 6-8. Nylig har flere andre nematode arter blitt vist å utnytte bakterier for å drepe insekter 9-13, og undersøkelser har begynt å undersøke interaksjonen mellom nematoder og bakterier i disse systemene <sup> 9.
Vi beskriver en fremgangsmåte for visualisering av en bakteriell symbionten innenfor eller på en nematode vert, å utnytte den optiske transparens av nematoder når sett ved mikroskopi. Bakteriene er konstruert for å uttrykke et fluorescerende protein, slik at deres visualisering av fluorescens mikroskopi. Mange plasmider er tilgjengelig som bærer gener som koder for proteiner som fluorescerer ved forskjellige bølgelengder (dvs. grønn eller rød), og konjugering av plasmider fra en donor Escherichia coli-stamme i en mottaker bakteriell symbionten er vellykket for et bredt spekter av bakterier. Metodene som er beskrevet ble utviklet for å undersøke sammenhengen mellom Steinernema carpocapsae og Xenorhabdus nematophila 14. Liknende metoder har blitt brukt til å undersøke andre nematode-bakterien foreninger 9, 15-18 og tilnærming er derfor gjelder generelt.
The Method tillater karakterisering av bakteriell tilstedeværelse og lokalisering innenfor nematoder på ulike stadier av utviklingen, og gir innsikt i natur foreningen og prosessen med 14 kolonisering, 16, 19. Mikroskopisk analyse avslører både kolonisering frekvens i en populasjon og lokalisering av bakterier som vert vev 14, 16, 19-21. Dette er en fordel fremfor andre metoder for overvåking bakterier innenfor nematode populasjoner som sonikering 22 eller sliping 23, som kan gi gjennomsnittlig nivå av kolonisering, men kan for eksempel ikke, diskriminere populasjoner med en høy frekvens av lavpris Symbiont laster fra populasjoner med en lav frekvens av høye Symbiont belastninger. Diskriminerende frekvens og belastning av koloniserende bakterier kan være spesielt viktig når screening eller karakterisere bakterielle mutanter for kolonisering fenotyper 21, 24. Har faktisk fluorescensmikroskopi blitt brukt i høy gjennomstrømning screening av bakterielle mutanter med defekter i 17 kolonisering, 18, og er mindre arbeidskrevende enn andre metoder, inkludert sonikering 22, 25-27 og individuell nematode disseksjon 28, 29.
Protocol
1. Bygging av en fluoriserende bakteriestammen via Bøyning
- Grow mottakeren stamme (symbionten skal undersøkes) og donor belastning over natten. Donor belastningen, vanligvis Escherichia coli, bør være i stand til å donere DNA gjennom konjugering og bør transformert med et plasmid (Tabell 2) som bærer et gen som koder for et fluorescerende protein. Avhengig plasmidet, kan en konjugering helper stamme også være nødvendig. I så fall bør denne belastningen også dyrkes over natten. Donor belastning og helper belastning bør dyrkes med antibiotika for å selektere for vedlikehold av plasmidet.
- Subkultur donor, hjelper, og mottaker stammene i næringsrike vekstmedier mangler antibiotika i en 1:100-forhold av kultur til medium.
- Dyrke kulturer på temperaturen hensiktsmessig for hver stamme før de når midt-log fasen vekst (OD 600 ~ 0,6). For Xenorhabdus og E. coli dette stadiet av å vokseth er nådd ca 3 til 4 timer etter subculturing. Dette kan variere avhengig av belastningen, eller i noen tilfeller plasmidet, brukt.
- Bland stammene i en mikrosentrifugerør og sentrifuger i 2 min ved 17 900 xg (13000 rpm i de fleste microfuges). Andelen av donor og mottaker som gir best resultat vil variere for ulike kombinasjoner, og kan ha for å bli empirisk bestemt. For en Xenorhabdus mottaker og E. coli donor, bruker vi en 3:1 eller 1:1-forhold. Hvis et hjelpeprogram stamme er nødvendig (f.eks E. coli), bør det legges inn i det samme forhold som donor.
- Dekanter supernatanten.
- Resuspendere cellepelleten i 30 pl av friske medier.
- Spot suspensjonen på et næringsrikt medium plate uten antibiotika, og la stedet å tørke.
- Inkuber platen, invertert, overnatting ved en temperatur optimal for mottakeren bakterien og tillatt for giveren (og hjelper, hvis det er aktuelt). Platen børbli inkubert minst 18 timer.
- Skrap opp stedet og strek for enslige kolonier på en selektiv antibiotika plate. Antibiotika bør velge mot donor og for mottakeren inneholder plasmidet. En eller to ekstra isolasjon striper kan være nødvendig å isolere en ren kultur.
- Sikre de resulterende koloniene er mottaker symbionten, og ikke giver belastning, ved screening for nærvær av mottaker spesifikke fenotyper som koloni morfologi eller polymerasekjedereaksjon påvisning av mottaker-spesifikke gener. Skjerme koloniene for tilstedeværelse av plasmidet med polymerase kjedereaksjon av en kjent plasmid sekvens og fluorescens. Koloniene bør fluoresce under riktig bølgelengde som svarer til den fluorescerende protein.
2. Produksjon av Axenic nematode Eggs
- Grow 5 ml av den naturlige bakteriell symbionten natten. Å starte en kultur, kan bakteriene inokulert i Lysogeny Broth (LB) eller andre cuLTURE media direkte fra en fryser lager eller fra en strek plate.
- Spre 600 ul av bakteriekultur på 10 mm Lipid Agar (LA) plater 29. Åtte til ti plater vil gi nok nematoder for de fleste arter.
- Inkuber i mørke uten fuktighet ved 25 ° C i to dager.
- Legg 5.000 infektive juvenile nematoder, eller andre trinn, avhengig på nematode som brukes, i 500 ul media til de bakterielle plener. Inkuber platene ved 25 ° C i 3 dager.
- Sjekk dine platene for tilstedeværelsen av voksne nematoder og egg. Plasser 20 pl av vann på et objektglass. Ved hjelp av en steril pinne skrape-opp en liten mengde av nematoder fra bakteriell plenen. Plasser pinne i vannet og la nematoder å svømme av. Se på lysbildet under lav forstørrelse. For mer informasjon om utseende se diskusjonen og Figur 2.
- Hvis egg og kvinner er synlig, fortsetter, ellers Inkuber platene ved 25 & df.eks; C og sjekk for riktig utvikling hver 6-12 hr. Når kvinner inneholder egg, plasserer et par ml vann på overflaten av platene. Snurr platene og hell vannet i en 50 ml konisk tube. Nematoder skal komme ut av platene og ikke lenger være synlig på plate overflaten. Flere skyllinger kan være nødvendig.
- Tillat nematoder å synke til bunnen av røret.
- Skyll nematoder. Pipetter av overskytende vann fra toppen av røret. Refill med rent vann og la voksne nematoder å bosette seg. Pipetter av overflødig vann.
- Fyll koniske rør med egg løsning. Når egg oppløsning tilsettes timingen av alle trinn med egg løsningen må fortsette nøyaktig som beskrevet for maksimal egg utbytte. Inkuber rørene mens forsiktig risting for nøyaktig 10 min. Fleste nematoder skal oppløses ved slutten av inkubasjonen.
- Umiddelbart sentrifuger koniske rør på 1250 xg for nøyaktig 10 min (dette inkluderer å bringe sentrifugen fartmen ikke ned til 0 x g. Bruk brems).
- Umiddelbart dekanter supernatanten.
- Umiddelbart re-suspendere pelleten med egg løsning ved pipettering.
- Umiddelbart fylle konisk tube med egg løsning og bland godt ved å snu 3-5 ganger. Deretter umiddelbart spinne som i 2.10.
- Umiddelbart dekanter supernatanten.
- Resuspendere pelleten i LB ved pipettering, overføre til en 15 ml konisk rør for forbedret pelletisering under vasketrinnet. LB er standard for Steinernema spp.. Andre buffere (f.eks en minimal salter medium) kan brukes avhengig av nematode og bakterien, husk buffer må ikke skade verken nematode eller bakterien.
- Fyll røret med LB og spinn som i 2.10.
- Dekanter supernatanten, og re-suspendere i LB.
- Skyll nematoder totalt 3 ganger ved å gjenta 2,14 og 2,15.
- Fortynne de re-suspendert nematode egg til et passende volum. Det bør være minst 10 egg per mikroliter. Eggs kan lagres i en 6-cm petriskål i 5 ml LB for minst fire dager ved å legge antibiotika som hemmer veksten av bakterier og koloniserende innpakning platen i Parafilm. Eggene må vaskes en gang i 15 ml LB (som i 2.13 og 2.14) før inokulering på bakterielle plener. Vær oppmerksom på at eggene klekkes i løpet av denne tiden og kanskje ikke synkronisert utviklingshemmede når det brukes i kolonisering analyser.
3. Co-dyrking Assay med Fluorescent Bakterier
- Grow fluorescerende bakterier over natten, selekterer for plasmidet om nødvendig.
- Spre 600 pl av den bakteriekultur bort 10 mM lipid agarskåler med en steril pinne. Inkuber ved 25 ° C i 2 dager.
- Sted 500-5,000 axenic nematode egg i totalt på 100 til 400 ul (optimalt 2000 nematoder i 200 ul) på hver lipid agar plate.
- Inkuber i mørke uten fuktighet ved 25 ° C inntil IJs eller andre stadier av interesse, skjema. IJs vil være synlig som en fuzzy hvit ring på kanten av tallerkenen. Å se på andre livsstadier, se protokoll 4.
- Plasser platene i en modifisert hvit felle 30. Fjerner lokket av lipid agarplate og plassere bunnen inn i bunnen av en tom 100 mm x 20 mm petriskål. Fyll den store petriskål med vann, eller en annen buffer hensiktsmessig å nematode, slik omslutte liten plate. Vannivået skal være omtrent halvparten av høyden av den lille platen.
- Inkuber vannlås til avkom IJs har dukket opp i bufferen.
- Infeksiøs juvenile nematoder kan lagres i vann i en vevskultur kolbe.
4. Innsamling av tidlige livsstadier for Screening
- Bruk trinn 3,1 gjennom 3,4 for å sette opp analysen.
- Inkuber platene før de ønskede livsstadier er tilstede. Daglig visuell inspeksjon kan være nødvendig for å fastslå tidspunktet. Å inspisere platene, bruke prosedyren beskrevet i protokoll 2,5. For S. carpocapsae X. nematophila på LA-plater, vil Gravid kvinner være tilstede i 4-5 dager, vil yngel være til stede i 7 dager, og infeksiøs yngel vil begynne å bli produsert med 15-17 dager.
- Når de ønskede livsstadier er til stede, samle prøven. Fyll en brønn av en 96 brønns plate med 200 ul PBS eller annen egnet buffer. Forsiktig skrape av noen av bakteriell plenen som inneholder nematoder. En ert størrelse beløp (~ 50 mg) vil gi minst flere hundre nematoder gang F1 avkom er produsert, men mer kan være nødvendig for tidligere tidspunkt. Plasser pinne inn i brønnen som inneholder buffer.
- Inkuber i 30 sek til et minutt. Fjern pinnen og skrap av gjenværende rester. Bruk pinnen å fjerne eventuell agar fra brønnen. De nematoder skal være synlig i bufferen. Flytt buffer blandingen til en ren mikrosentrifuge tube.
- Behandle nematoder med levamisol eller andre lammende agent. Oppløse noen korn av levamisol inn 30 & mu; L vann. Legg 1-2 pl av denne blandingen for hver 50 pl av prøven. Etter levamisol behandlingsalternativer nematoder vil være ikke-levedyktig.
- Hvis prøvene vil bli sett på et senere tidspunkt, fikse som beskrevet i dette trinnet. Hvis ikke, går du til trinn 4.6. Tilsett 200 ul fiksativ løsning inneholdende 1X buffer og 4% paraformaldehyd. Bland forsiktig, kan pipettering forårsake delikate livsstadier å lyse. Dekk med folie, og inkuber ved romtemperatur på en ristemaskin på lav for minst 18 timer.
- Plasser rørene i et rør stativ, og lar dem nematoder å synke til bunnen av røret.
- Skyll nematoder for å fjerne bakgrunnen. Pipetter av overflødig væske og tilsett 200-500 ul buffer og forsiktig bland. Gjenta. Dette kan gjentas noen ganger for å fjerne mer bakgrunn om ønskelig.
- Tillat nematoder å synke til bunnen av røret og resuspendere i ønsket volum.
- Hvis nematoder ikke er faste, skjermen umiddelbart. Faste nematoder kan oppbevares i kjøleskap i opptil to uker. Oppbevares i mørket.
5. Screening Nematoder for bakteriell Foreningen Mikroskopi
- Velge noen nematoder for å vise under mikroskopet ved å fjerne en liten prøve av blandingen din.
- For å sikre at nematoder er fortsatt for bildet, behandle med et paralytisk middel som beskrevet i protokoll 4,5. Hvis du ikke tar et bilde eller nematoder er allerede løst, kan dette trinnet.
- Legg 20-30 ul nematoder i vann til objektglass og legg et dekkglass på toppen.
- Vis hele nematoder ved hjelp av lys-mikroskopi for å sikre nematoder er i synsfeltet.
- Vis nematoder bruker fluorescerende innstillingen på mikroskop som svarer til fluorescensen uttrykt av bakterier.
- Å identifisere bakteriell lokalisering, ta bilder av nematode under fluorescerende innstilling og en lysmikroskopi innstilling, og deretter sammenligne med bildene. Bildene må være av samme field av visningen. Det kan være nødvendig å prøve flere forstørrelser og utsikt over nematode å finne bakterier.
- Fordelingen av nematode kolonisering kan kvantifiseres ved å telle en befolkning av nematoder, scoring for tilstedeværelse eller fravær av bakterier, og beregne prosent kolonisert. Vi anbefaler telling før minst 30 nematoder innenfor populasjonen telles i hver kategori (med eller uten kolonisering) for å oppnå en pålitelig verdi.
- Når bare noen få nematoder i befolkningen er kolonisert, kan det være nødvendig å telle flere tusen nematoder før 30 blir observert. For high-throughput telling bruke følgende fremgangsmåte.
- Stedet for å telle nematoder individuelt, alikvoter befolkningen til en multi-brønn plate (f.eks en 24-brønns plate). Etter at nematoder har lagt seg på bunnen av fatet, kan hver brønn skal skannes på mikroskopet og antall koloniserte nematoder kan scores.
- Det totale antall nematoder ina populasjonen kan identifiseres ved serielle fortynninger av nematoder i brønnen. For eksempel kan 1 ml nematoder legges til en brønn, kan blandes godt ved omrøring med en pipettespiss og 3 pl fjernes og telles for kvantifisering av den totale populasjonen i brønnen.
- Prosentandelen av koloniserte nematoder kan fås ved å dividere antall kolonisert av det totale antall av nematoder i brønnen.
6. Representant Resultater
Eksempler mikroskop bilder av Steinernema nematoder knyttet Xenorhabdus bakterier er vist i figur 3.. Å opprette det sammensatte bildet sett i figur 3A, ble et fasekontrast bilde kledde med fluorescerende bilde. Pilen i figur 3A angir bakteriene innenfor infeksiøs juvenil nematode (bar = 100 um). Figur 3B ble konstruert på en lignende måte og viser et juvenil nematode with grønt fluorescerende protein merket bakterier (grønne stenger) lokalisert i hele nematode intestinal lumen (bar = 20 mm). En befolkning av nematoder fra to medier ble talt opp og scoret for kolonisering av bakteriell symbionten (tabell 1). For robuste statistikk, er det best å telle minst 100 nematoder per sampling med minst 30 faller i hver kategori. Som fremgår av Tabell 1, er disse nematoder kolonisert på et nivå på ca 14,6% når dyrket på lipid agar og 68,6% når dyrket på leveren nyre agar. Annet nematode og bakteriearter har vist seg å ha forskjellige nivåer av kolonisering. For eksempel X. nematophila koloniserer 99% av S. carpocapsae infeksiøs yngel (Martens 2003), og P. luminescens koloniserer 26% av H. bacteriophora infeksiøs yngel (Ciche 2003).
Figur 1. Skjematisk oversikt over metoden. A. Bakterien er konstruert for å uttrykke en fluorescerende protein. B. nematode egg er isolert fra voksne nematoder for å produsere sterile nematoder. C. sterile nematoder er co-dyrket med fluorescerende bakterier. D. De resulterende livsstadier er sett under et mikroskop for å vurdere bakteriell tilstedeværelse innen nematode.
Figur 2. Skildring av voksne kvinner som inneholder egg. A. skjematisk viser det generelle utseendet til Steinernema kvinner. Innfelt: DIC bilde av en S. feltiae gravid kvinne. Den svarte pilen indikerer vulva. Hvite piler viser synlige egg. Bildet er på 20x forstørrelse, og omfanget strek representerer 100 mikrometer. B. DIC bilde av en utvikling, men unhatched S.feltiae nematode egg. Bildet er 40X forstørrelse, og omfanget strek representerer 50 mikrometer. C. DIC bilde av egg isolert fra S. feltiae nematoder i henhold 10X forstørrelse. Målestokk er 100 um.
Figur 3. Eksempel mikroskop bilder av nematode-bakteriell foreningen. A. S. puntauvense nematoder var assosiert med deres bakteriell symbionten, X. bovienii, uttrykker GFP. Bildet er et sammensatt bilde produsert ved overliggende et fasekontrast bilde med et fluorescent bilde fra samme synsfelt. Pilen viser den fluorescerende bakterielle symbionten i nematode vert. Målestokk representerer 100 mikrometer. B. Dette bildet viser en S. carpocapsae juvenile nematode med GFP-uttrykke X. nematophila lokalisert i nematode tarmen.Dette bildet ble konstruert gjennom overliggende et fluorescerende bilde over en differensial forstyrrelser kontrast. Målestokk representerer 20 mikrometer.
| Sil | Antall Nematoder Med acteria | Totalt Nematoder Telles | Prosent av Nematoder olonized |
| S. puntauvense Lipid Agar | 30 | 205 | 14.60% |
| S. puntauvense Liver Nyre Agar | 72 | 105 | 68.60% |
Tabell 1. Eksempel scoring av en nematode populasjon for bakteriell tilstedeværelse. I dette eksperimentet, axenic S. puntauvense nematoder ble dyrket med sin GFP-uttrykke symbionten på ulike vekstmedier (lipid agar og lever nyre agar 32) for å teste for kolonisering defekter. En sammen minst en Hundred nematoder per sampling ble talt opp og scoret for tilstedeværelse av bakterier. For statistisk styrke, replikerer tre eksperimentelle skal regnes med minst 30 nematoder som faller i hver kategori.
Tabell 2. Fluorescerende protein inneholdende plasmider. En liste over mulige plasmider for innsetting av et fluorescerende protein i bakteriens symbionten gis oppført med navn av plasmid. Annen informasjon inkludert er fluorescerende protein kodet, antibiotika kassett benyttes for plasmid vedlikehold, andre instruksjoner for bruken, kilden av plasmidet. Konsentrasjonen bemerket i parentes er den konsentrasjon av den antibiotika for X. nematophila. Hver av disse plasmider har vært brukt med hell i enten Xenorhabdus eller Photorhabdus. Ytterligere informasjon kan fås fra de angitte henvisninger. Avhengigpå bakterien som testes, kan enkelte plasmider ikke fungerer basert på fluorescerende protein, antibiotika utvalg, innstikkstedet, eller replikasjonsutgangspunkt. Plasmidene nevnt ovenfor inneholder ulike funksjoner som kan gjøre det mulig bruk i bakterien av interesse. For eksempel, mini-TN7-KSGFP settes inn i attTn7 området av kromosom, mens pECM20 settes inn i X. nematophila kromosom ved homolog rekombinasjon. Alternativt er de pPROBE plasmider vedlikeholdt extrachromosomally, og hver pPROBE plasmidet har samme ryggrad og fluoroforen men har forskjellige valgbare markører eller opprinnelse for replikasjon for å aktivere deres anvendelse i en rekke taksonomisk eller mutante bakgrunner.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Protokollen beskrevet her gir en fremgangsmåte for optisk deteksjon av bakterier i en nematode vert (Figur 1). Denne metoden drar nytte av den optiske transparens av nematoder og evnen til fluorescently label bakterier, slik in vivo analyse av bakterier innenfor nematode verten (Figur 3). Konkret identifiserer denne tilnærmingen bakteriell lokalisering innenfor sin vert. Ved å telle en nematode befolkning og scoring for bakteriell tilstedeværelse, kan frekvensen av bakteriell kolonisering over nematode populasjonen bestemmes (tabell 1). Denne metoden er en av mange mulige teknikker som kan benyttes for å studere samspillet mellom nematode verter og bakterielle symbionter. Relaterte metoder har blitt beskrevet tidligere for å isolere bakteriell symbionten, vokser nematoder axenically og manipulere både partnere 25-27.
Protokollen er beskrevet here ble utviklet i Xenorhabdus nematophila-Steinernema carpocapsae modellsystem 14, og lignende tilnærminger har vært brukt i andre entomopathogenic nematode-bakterielle foreninger 9,15,17,18. Flere vilkår må være oppfylt for å bruke denne metoden til andre nematode-bakterielle systemer. Først må den bakterielle symbionten kunne isoleres fra verten og vokst selvstendig i kultur. Sekund, må symbionten kunne ta opp DNA gjennom transformasjon eller konjugasjon for å introdusere den fluorescerende protein. Tredje, for de beste resultatene, må nematode har en scene som kan gjøres axenic og gjeninnføres i bakterier. Men selv om nematode ikke kan isoleres fra bakterien kan det fortsatt være mulig å visualisere sammenhengen: i stedet for å legge axenic egg til plenen av fluorescerende bakterier, legge til en konvensjonelt hevet livsfase og fortsett med protokollen som beskrevet. Noen resultater vil lide fra forbeholdet thpå bakterier som ikke uttrykkelig GFP vil konkurrere med GFP-uttrykker bakterier for lokalisering til bestemte nematode vev, og på grunn av dette, bør kolonisering ikke måles ved mikroskopisk telling. Men med mindre bakterier som ikke uttrykker GFP drastisk utkonkurrere GFP-uttrykke bakterier, bør GFP-uttrykke bakterier lokalisere til nematode vev i minst noen dyr i befolkningen og foreslå viktige vev nettsteder for bakteriell kolonisering. En langvarig forbeholdet med fluorescerende-protein uttrykkende stammer er at de kan kolonisere en vert med forskjellig effektivitet enn en stamme som uttrykker ikke fluorescerende proteiner (f.eks 12).
Fremgangsmåten som er beskrevet i denne protokollen kan kreve optimalisering avhengig nematode og bakterielle arter som er i bruk. For konjugering av bakterien noen forhold som kan endres er lengden og temperaturen av vekst, forholdet mellom donor til mottaker, og plasmaetsid brukes. Eksempler på relevante plasmider er oppført i Tabell 2. Alle disse plasmider har blitt brukt i enten Xenorhabdus eller Photorhabdus bakterier i forbindelse med deres nematode vert 14,17,20,24,33-35. For å sikre stabil opprettholdelse av den fluorescerende protein under nematode kolonisering er det best å bruke et plasmid som vil sette inn i kromosomet av målet bakterien. Videre kan noen bakterier ikke ta opp disse plasmider. For eksempel, har pECM20 bare vært brukt i X. nemtaophila og svært nært beslektet bakteriestammer 14 fordi dette plasmid settes inn i kromosomet ved hjelp av en homolog region mellom plasmidet og kromosom; plasmidet ikke vil sette dersom målet bakterien mangler denne regionen. For å bruke denne plasmid for andre bakterier, X. nematophila-spesifikk region må være substituert med en genomisk region fra målet bakterien. Noen plasmid-transformasjon ordninger vil også require visse endringer fra protokoll 1. For eksempel, mini-Tn 7-KSGFP og PBK-miniTn 7-ΩGm-DsRed krever en hjelper plasmid som inneholder transponering gener (tsnABCDE) 33,35,36 å sette inn i bakterielt kromosom. Konjugering er mest effektiv med disse Tn 7-baserte plasmider, når 2-timers kulturer (~ OD 600 0,3 til 0,4) blandes i like forhold.
Etter vellykket konjugering er det viktig å utnytte korrekte selektive plater tilsvarende plasmidet brukt. De selektive plater bør inneholde antibiotika kodet på plasmidet å selektere for nærvær av plasmidet i mottakeren og en teller-seleksjon mot donor og medhjelper stammer. For eksempel, når conjugating pECM20 i X. nematophila telleren-utvalget som brukes er ampicillin fordi X. nematophila er ampicillin motstandsdyktig og donor belastningen er ampicillin følsom. Hvis antibiotika mot valget er utilgjengelig i yvårt system, et diaminopimelic syre (DAP) krever donor kan benyttes. Å vokse DAP-krever stammer, er DAP lagt til faste og flytende vekstmedier under pre-konjugering og konjugering trinn, og utelatt under counter-valg etapper. Når DAP er fraværende donor belastningen vil ikke vokse, og er effektivt mot utvalgte.
Å sikre en vellykket egg isolasjon er det viktig å nøyaktig kontrollere eggproduksjon (figur 2). På tidspunktet for isolasjon, bør kvinnelige nematoder være full av egg og noen egg bør være synlig i media (figur 2A). Hvis kvinnelige nematoder produserer befruktede egg minst noen supernatant egg vil ha synlig utviklet som unhatched nematoder (figur 2B). For S. carpocapsae, eggene endres fra sfærisk til litt avlange før utvikle nematoder og klekking. Tidspunktet eller forhold av nematode vekst må også endres for å maksimere befruktet egggi, herunder forkorte eller forlenge periode før egg høsting, eller bruke alternative medier som passer til de spesifikke nematode arter. På slutten av isoleringen, egg være lett synlig i buffer (figur 2C). Parametere i egg isolert protokollen som kan kreve optimalisering inkluderer blekemiddel og KOH konsentrasjoner i egg løsning, inkubasjonstid i egg løsning, eller sentrifugering hastighet. Hvis egg isolasjon produserer egg men ingen nematoder utvikles under co-dyrking, er det mulig at de isolerte egg er ikke-levedyktig. For å se etter levedyktighet, la de isolerte egg i buffer og vente på nematoder å klekkes. Eggene bør klekkes innen en eller to dager av isolasjon og deretter juvenile nematoder kan brukes i co-dyrking analysen. Hvis eggene klekkes men ikke utvikler under co-dyrking analysen, kan det være nødvendig å endre vekstbetingelser eller medium som brukes for co-dyrking. Vi registrerer at tidligere studies har isolert bakterier-free nematoder ved soaking nematoder i et antibiotikum cocktail (f.eks 3,37). Tilnærmingen vi beskriver her er fri for noen av de begrensninger av antibiotika bløtlegging, inkludert komplikasjoner med hjelp bakteriostatiske antibiotika, antibiotika-resistente bakterier, og kontaminerende antibiotiske virkninger på nematoder. Visse trinn i nematoder kan også være resistente mot antibiotika og beholde deres bakterielle symbionter 3. Til slutt ser vi at for mikroskopi, kan konsentrasjonen av levamisol nødvendig for nematode immobilisering variere med ulike nematode clades.
Når denne metoden har blitt etablert i systemet av interesse, er det mulig å endre teknikken å utlede mer informasjon. Ved å se på tidligere tidspunkter i nematode livssyklus (Protokoll 4), kan man være i stand til å identifisere hvordan bakterien og nematode starte sine foreningen 14,16. I tillegg kan denne tilnærming brukes to gjennomføre en høy gjennomstrømning mutant skjermer for å identifisere bakteriell faktorer involvert i symbiose, ved hjelp av fluorescens å oppdage kolonisering 17,18. Andre metoder slik som signatur tagget mutagenese krever bruk av radioaktivt merkede prober og er mer tidkrevende 22,28. Derfor er bruken av fluorescensmikroskopi for bakteriell symbionten visualisering i nematoder en effektiv og effektiv screening verktøy for å undersøke bakterielle interaksjoner med en nematode vert.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Ingen interessekonflikter erklært.
Acknowledgments
Forfatterne ønsker å takke Eugenio Vivas, Kurt Heungens, Eric Martens, Charles Cowles, Darby Sugar, Eric Stabb, og Todd Ciche for deres bidrag til utviklingen av denne protokollen og verktøy som brukes. KEM og JMC ble støttet av National Institutes of Health (NIH) National Research Service Award T32 (AI55397 "Mikrober i helse og sykdom"). JMC ble støttet av National Science Foundation (NSF) Graduate Research Fellowship. Dette arbeidet ble støttet med tilskudd fra National Science Foundation (IOS-0920631 og IOS-0950873).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Lipid Agar (sterile) |
8 grams nutrient broth, 15 grams agar, 5 grams yeast extract, 890 ml water, 10 ml 0.2 g/ml MgCl2. 6H20, 96 ml corn syrup solution*, 4 ml corn oil* Stir media while pouring plates *add sterile ingredient after autoclaving |
||
| Corn Syrup Solution (sterile) |
7 ml corn syrup, 89 ml water mix and autoclave |
||
| Egg Solution | 16.6 ml 12% sodium hypochlorite, 5 ml 5M KOH, 80 ml water | ||
| Lysogeny Broth (sterile) |
5 grams yeast extract, 10 grams tryptone, 5 grams salt, 1 L water mix and autoclave |
||
| Microfuge | Fisher | 13-100-675 | Any microfuge that holds microfuge tubes will work |
| Centrifuge | Beckman | 366802 | Large table top centrifuge that holds 15 ml and 50 ml conical tubes |
| Sterile 60 mm X 15 mm Petri Dish | Fisher | 0875713 | |
| 50 ml centrifuge tubes | Fisher | 05-539-6 | |
| 15 ml centrifuge tubes | Fisher | 05-531-6 | |
| Sterile 100 mm X 20 mm Petri Dish | Fisher | 0875711Z | Deeper than standard Petri dishes |
| 24-well plate | Greiner Bio-One | 662000-06 | |
| Microscope | The microscope needs florescent capabilities compatible with your fluorophore | ||
| Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 15710 | |
| PBS (sterile) |
8 g NaCL 0.2 g KCL 1.44 g Na2HPO4 0.24 g KH2PO4 1 L water Adjust to a pH of 7.4 and water to 1 L and autoclave |
||
| Microfuge tubes | Fisher | 05-408-138 | 2 ml or 1.5 ml tubes |
| Shaker | Any shaker that causes the liquid to gently move will work | ||
| Diaminopimelic acid | Sigma | D-1377 | If needed, supplement media to a concentration or 1 mM |
References
- Holterman, M., van der Wurff, A. Phylum-wide analysis of SSU rDNA reveals deep phylogenetic relationships among nematodes and accelerated evolution toward crown clades. Mol. Biol. Evol. 23, 1792-1800 (2006).
- Lambshead, P. J. D., Boucher, G. Marine nematode deep-sea biodiversity - hyperdiverse or hype. J. Biogeogr. 30, 475-485 (2003).
- Poinar, G. O. J., Thomas, G. M. Significance of Achromobacter nematophilus Poinar and Thomas (Achromobacteraceae: Eubacteriales) in the development of the nematode, DD-136 (Neoaplectana sp. Steinernematidae). Parasitol. 56, 385-390 (1966).
- Herbert, E. E., Goodrich-Blair, H. Friend and foe: the two faces of Xenorhabdus nematophila. Nat. Rev. Microbiol. 5, 634-646 (2007).
- Kaya, H. K., Gaugler, R.
- Bird, A. F., Akhurst, R. J. The nature of the intestinal vesicle in nematodes of the family Steinernematidae. Int. J. Parasitol. 13, 599-606 (1983).
- Martens, E. C., Goodrich-Blair, H. The Steinernema carpocapsae intestinal vesicle contains a subcellular structure with which Xenorhabdus nematophila associates during colonization initiation. Cell. Microbiol. 7, 1723-1735 (2005).
- Snyder, H. A., Stock, S. P., Kim, S. K., Flores-Lara, Y., Forst, S. New insights into the colonization and release process of Xenorhabdus nematophila and the morphology and ultrastructure of the bacterial receptacle of its nematode host, Steinernema carpocapsae. Appl. Environ. Microbiol. 73, 5338-5346 (2007).
- Abebe, E., Abebe-Akele, F., Morrison, J., Cooper, V., Thomas, W. K. An insect pathogenic symbiosis between a Caenorhabditis and Serratia. Virulence. 2, 158-161 (2011).
- Abebe, E., Jumba, M.
- Torres-Barragan, A., Suazo, A., Buhler, W. G., Cardoza, Y. J. Studies on the entomopathogenicity and bacterial associates of the nematode Oscheius carolinensis. Biol. Control. 59, 123-129 (2011).
- Ye, W. M., Torres-Barragan, A., Cardoza, Y. Oscheius carolinensis n. sp (Nematoda: Rhabditidae), a potential entomopathogenic nematode from vermicompost. Nematology. 12, 121-135 (2010).
- Zhang, C., Liu, J. Heterorhabditidoides chongmingensis gen. nov., sp. nov. (Rhabditida: Rhabditidae), a novel member of the entomopathogenic nematodes. J. Invertebr. Pathol. 98, 153-168 (2008).
- Martens, E. C., Heungens, K., Goodrich-Blair, H. Early colonization events in the mutualistic association between Steinernema carpocapsae nematodes and Xenorhabdus nematophila bacteria. J. Bacteriol. 185, 3147-3154 (2003).
- Ciche, T. A., Ensign, J. C. For the insect pathogen, Photorhabdus luminescens, which end of a nematode is out. Appl. Environ. Microbiol. 69, 1890-1897 (2003).
- Ciche, T. A., Kim, K. S., Kaufmann-Daszczuk, B., Nguyen, K. C., Hall, D. H. Cell invasion and matricide during Photorhabdus luminescens transmission by Heterorhabditis bacteriophora nematodes. Appl. Environ. Microbiol. 74, 2275-2287 (2008).
- Easom, C. A., Joyce, S. A., Clarke, D. J. Identification of genes involved in the mutualistic colonization of the nematode Heterorhabditis bacteriophora by the bacterium Photorhabdus luminescens. BMC Microbiol. 10, 45 (2010).
- Somvanshi, V. S., Kaufmann-Daszczuk, B., Kim, K. S., Mallon, S., Ciche, T. A. Photorhabdus phase variants express a novel fimbrial locus, mad, essential for symbiosis. Mol. Microbiol. 77, 1021-1038 (2010).
- Martens, E. C., Russell, F. M., Goodrich-Blair, H. Analysis of Xenorhabdus nematophila metabolic mutants yields insight into stages of Steinernema carpocapsae nematode intestinal colonization. Mol. Microbiol. 51, 28-45 (2005).
- Sugar, D. R., Murfin, K. E. Phenotypic variation and host interactions of Xenorhabdus bovienii SS-2004, the entomopathogenic symbiont of Steinernema jollieti nematodes. Env. Microbiol. 14, 924-939 (2012).
- Cowles, C. E., Goodrich-Blair, H. The Xenorhabdus nematophila nilABC genes confer the ability of Xenorhabdus spp. to colonize Steinernema carpocapsae nematodes. J. Bacteriol. 190, 4121-4128 (2008).
- Heungens, K., Cowles, C. E., Goodrich-Blair, H. Identification of Xenorhabdus nematophila genes required for mutualistic colonization of Steinernema carpocapsae nematodes. Mol. Microbiol. 45, 1337-1353 (2002).
- Goetsch, M., Owen, H., Goldman, B., Forst, S. Analysis of the PixA inclusion body protein of Xenorhabdus nematophila. J. Bacteriol. 188, 2706-2710 (2006).
- Bhasin, A., Chaston, J. M., Goodrich-Blair, H. Mutational Analyses Reveal Overall Topology and Functional Regions of NilB, a Bacterial Outer Membrane Protein Required for Host Association in a Model of Animal-Microbe Mutualism. J. Bacteriol. 194, 1763-1776 (2012).
- Ciche, T. A., Goffredi, S. K. Methods in General and Molecular Microbiology. Reddy, C. A. , ASM Press. 394-419 (2007).
- Goodrich-Blair, H., Clarke, D., Grewal, P. S., Ciche, T. A. Insect Pathogens, Molecular Approaches and Techniques. Stock, S. P., Boemare, N., Vandenberg, J., Glazar, I. , CABI Publishing. 239-269 (2009).
- Stock, S. P., Goodrich-Blair, H. Manual of Techniques in Invertebrate Pathology. Lacey, L. A. , Elsevier Press. 375-425 (2012).
- Martens, E. C., Gawronski-Salerno, J. Xenorhabdus nematophila requires an intact iscRSUA-hscBA-fdx locus to colonize Steinernema carpocapsae nematodes. J. Bacteriol. 185, 3678-3682 (2003).
- Vivas, E. I., Goodrich-Blair, H. Xenorhabdus nematophilus as a model for host-bacterium interactions: rpoS is necessary for mutualism with nematodes. J. Bacteriol. 183, 4687-4693 (2001).
- White, G. F. A method for obtaining infective nematode larvae from cultures. Science. 66, 302-303 (1927).
- Ciche, T. A., Ensign, J. C. For the insect pathogen Photorhabdus luminescens, which end of a nematode is out. Appl. Environ. Microbiol. 69, 1890-1897 (2003).
- Sicard, M., Brun, N. L. e Effect of native Xenorhabdus on the fitness of their Steinernema hosts: contrasting types of interaction. Parasitol. Res. 91, 520-524 (2003).
- Lambertsen, L., Sternberg, C., Molin, S. Mini-Tn7 transposons for site-specific tagging of bacteria with fluorescent proteins. Environ. Microbiol. 6, 726-732 (2004).
- Miller, W. G., Leveau, J. H., Lindow, S. E. Improved gfp and inaZ broad-host-range promoter-probe vectors. Mol. Plant Microbe Int. 13, 1243-1250 (2000).
- Teal, T. K., Lies, D. P., Wold, B. J., Newman, D. K. Spatiometabolic stratification of Shewanella oneidensis biofilms. Appl. Environ. Microbiol. 72, 7324-7330 (2006).
- Bao, Y., Lies, D. P., Fu, H., Roberts, G. P. An improved Tn7-based system for the single-copy insertion of cloned genes into chromosomes of Gram-negative bacteria. Gene. 109, 167-168 (1991).
- Woodring, J. L., Kaya, H. K. Steinernematid and Heterorhabditid Nematodes: A Handbook of Biology and Techniques. Southern Cooperative Series Bulletin 331. , Arkansas Agricultural Experiment Station. (1988).
