Summary
För att studera mutualism mellan
Abstract
Symbioser den bor tillsammans med två eller flera organismer, är utbredd i alla riken i livet. Som två av de mest allmänt förekommande organismerna på jorden, nematoder och bakterier bildar ett brett utbud av symbiotiska associationer som sträcker sig från till nytta för patogena 1-3. En sådan förening är ömsesidigt givande relation mellan Xenorhabdus bakterier och Steinernema nematoder, som har blivit en modell för system av symbios 4. Steinernema nematoder är entomopatogena, använder sin bakteriell symbiont att döda insekter 5. För överföring mellan insektsvärdar, bakterierna koloniserar tarmen av nematoden är infektiösa juvenila stadium 6-8. Nyligen, har flera andra nematodarter visats utnyttja bakterier för att döda insekter 9-13, och undersökningar har börjat undersöka interaktionen mellan nematoderna och bakterier i dessa system <sup> 9.
Vi beskriver ett förfarande för visualisering av en bakteriell symbiont inom eller på en nematod värd, dra nytta av den optiska transparens av nematoder när den betraktas av mikroskopi. Bakterierna är utformade för att uttrycka ett fluorescerande protein, tillåter deras visualisering med fluorescensmikroskopi. Många plasmider finns tillgängliga som bär gener som kodar för proteiner som fluorescerar vid olika våglängder (dvs. grönt eller rött), och konjugering av plasmider från en donator Escherichia coli-stam i en mottagande bakteriell symbiont är framgångsrik för ett brett spektrum av bakterier. De beskrivna metoderna har utvecklats för att undersöka sambandet mellan Steinernema carpocapsae och Xenorhabdus nematophila 14. Liknande metoder har använts för att undersöka andra nematod-bakterien föreningar 9, 15-18 och tillvägagångssättet är därför allmänt tillämplig.
The Method tillåter karakterisering av bakteriell närvaro och lokalisering inom nematoder i olika utvecklingsstadier, vilket ger insikter i natur föreningen och processen av kolonisation 14, 16, 19. Mikroskopisk analys avslöjar både kolonisering frekvens inom en population och lokalisering av bakterier som värd vävnader 14, 16, 19-21. Detta är en fördel jämfört med andra metoder för övervakning bakterier inom nematod populationer, till exempel ultraljud 22 eller slipning 23, som kan ge genomsnittliga nivåer kolonisering, men kan till exempel inte, diskriminera populationer med en hög frekvens av låga symbiont laster från populationer med en låg frekvens av höga symbiont belastningar. Diskriminera frekvens och belastning av koloniserande bakterier kan vara särskilt viktigt när screening eller karakterisera bakteriella mutanter för kolonisering fenotyper 21, 24. I själva verket har fluorescensmikroskopi använts i högkapacitetsscreening av bakteriella mutanter för defekter i kolonisering 17, 18, och är mindre arbetskrävande än andra metoder, inkluderande sonikering 22, 25-27 och individuell nematoder dissektion 28, 29.
Protocol
1. Konstruktion av en fluorescerande bakteriestam via Konjugering
- Odla mottagaren stam (symbiont skall undersökas) och givare stam natten. Givaren stammen, vanligtvis Escherichia coli, bör ha förmåga att donera DNA genom konjugation och bör transformeras med en plasmid (tabell 2) som bär en gen som kodar ett fluorescerande protein. Beroende på plasmiden, kan en konjugering hjälpare stam också krävas. Om så är fallet bör denna stam också odlas över natten. Givaren stammen och hjälpar stammen bör odlas med antibiotika för att selektera för underhåll av plasmiden.
- Subkultur givaren, hjälpare, och stammar mottagare i näringsrika tillväxtmedia saknar antibiotika i en 1:100 förhållande kultur medium.
- Odla kulturerna vid temperaturen lämplig för varje stam tills de når mitten log steg tillväxten (OD 600 ~ 0,6). För Xenorhabdus och E. E. coli detta skede av tillväxte uppnås cirka 3 till 4 timmar efter subodling. Detta kan variera beroende på stammen, eller i vissa fall plasmiden, användes.
- Blanda stammar i ett mikrocentrifugrör och centrifugera under 2 minuter vid 17.900 xg (13.000 rpm i de flesta microfuges). Andelen av givare och mottagare som ger bästa resultaten kommer att variera för olika kombinationer, och kan behöva bestämmas empiriskt. För en Xenorhabdus mottagare och E. E. coli givare använder vi en 3:1 eller 1:1. Om en hjälpar-stam behövs (t.ex. E. coli), bör den tillsättas i samma förhållande som donator.
- Dekantera supernatanten.
- Återsuspendera cellpelleten i 30 pl färskt medium.
- Spot suspensionen på ett näringsrikt medium tallrik utan antibiotika, och låt fläcken torka.
- Inkubera plattan, inverterade, natten vid en temperatur optimal för mottagaren bakterien och tillåtet för givaren (och hjälpare, om tillämpligt). Plattan skainkuberas minst 18 timmar.
- Skrapa upp plats och strimmig för enstaka kolonier på en selektiv antibiotika platta. Antibiotika bör välja mot givaren och för mottagaren innehållande plasmiden. En eller två ytterligare isolering ränder kan vara nödvändigt att isolera en ren kultur.
- Säkerställa de resulterande kolonierna är mottagare symbiont, och inte givaren stammen, genom screening med avseende på närvaron av mottagarens specifika fenotyper, såsom kolonimorfologi, eller polymeraskedjereaktion detektion av mottagare-specifika gener. Screena kolonierna för närvaro av plasmiden genom polymeraskedjereaktion av en känd plasmidsekvensen och fluorescens. Kolonierna bör fluorescera under rätt våglängd som motsvarar det fluorescerande proteinet.
2. Produktion av axenisk nematoda Ägg
- Odla 5 ml av den naturliga bakteriella symbiont natten. För att starta en kultur, kan bakterier ympas in Lysogeny Broth (LB) eller andra culture media direkt från en frys lager eller från en strimma platta.
- Sprid 600 pl av bakteriekulturen till 10 Agar mm Lipid (LA)-plattor 29. Åtta till tio plattor kommer att ge tillräckligt med nematoder för de flesta arter.
- Inkubera i mörker utan fukt vid 25 ° C under två dagar.
- Lägg 5.000 smittsamma juvenila nematoder, eller andra steg, beroende på nematoden som används i 500 | il medium till de bakteriella gräsmattor. Inkubera plattorna vid 25 ° C under 3 dagar.
- Kontrollera dina plattor för förekomst av vuxna nematoder och ägg. Placera 20 | il vatten på ett objektglas. Med användning av en steril pinne skrapa upp en liten mängd av nematoder från bakteriemattan. Placera pinnen i vattnet och låt nematoderna att simma bort. Titta på din bild i låg förstoring. För mer information om utseendet se diskussionen och figur 2.
- Om ägg och honor är synliga, fortsätter, annars Inkubera plattorna vid 25 & dt.ex., C och kontrollera för korrekt utveckling varje 6-12 tim. När kvinnor innehåller ägg, placera några ml vatten på ytan av plattorna. Snurra försiktigt plattorna och häll vatten i ett 50 ml koniskt rör. Nematoder bör komma bort från plattorna och inte längre vara synlig på plåtytan. Flera sköljningar kan vara nödvändig.
- Låt nematoderna att sedimentera till botten av röret.
- Skölj nematoder. Pipettera bort överflödigt vatten från toppen av röret. Fyll på med rent vatten och låt vuxna nematoder att lösa. Pipettera bort överflödigt vatten.
- Fyll koniska rör med ägg lösning. När ägg tillsätts tidpunkten för alla steg med ägg lösning måste gå exakt som beskrivits för maximal ägg avkastning. Inkubera rören samtidigt som du försiktigt skakar i exakt 10 minuter. De flesta nematoder bör upplösas i slutet av inkubationen.
- Omedelbart centrifugera koniska rör vid 1250 xg under exakt 10 minuter (detta inkluderar föra centrifugen igångmen inte ner till 0 x g.. Använd bromsen).
- Omedelbart dekantera supernatanten.
- Omedelbart återsuspendera pelleten med ägg lösning genom pipettering.
- Omedelbart fylla koniskt rör med ägg-lösning och blanda väl genom att vända 3-5 gånger. Sedan omedelbart snurra som under 2,10.
- Omedelbart dekantera supernatanten.
- Återsuspendera pelleten i LB genom att pipettera, överför till en 15 ml koniskt rör för förbättrad pelletering under tvättstegen. LB är standard för Steinernema SPP. Andra buffertar (t.ex. en minimalt saltmedium) kan användas beroende på nematod-och bakterien, i åtanke bufferten får inte skada varken nematoden eller bakterien.
- Fyll röret med LB och spinn som under 2,10.
- Dekantera supernatanten och återsuspendera i LB.
- Skölj nematoderna totalt 3 gånger genom att upprepa 2,14 och 2,15.
- Späd resuspenderas nematod ägg till en lämplig volym. Det bör finnas minst 10 ägg per mikroliter. T.ex.gs kan lagras i en 6-cm Petri-skål i 5 ml LB under minst fyra dagar genom att lägga antibiotika som inhiberar tillväxt av koloniserande bakterier och inslagning plattan i parafilm. Äggen måste tvättas en gång i 15 ml LB (som i 2,13 och 2,14) före inokulering på bakteriella gräsmattor. Observera att äggen kläcks under denna tid och får inte synkroniseras utvecklingsmässigt när de används i kolonisering analyser.
3. Samodling analys med fluorescerande bakterier
- Grow fluorescerande bakterier över natten, selektering för plasmiden vid behov.
- Sprid 600 pl av bakteriekulturen till 10 agar mm Lipid plattor med en steril pinne. Inkubera vid 25 ° C under 2 dagar.
- Placera 500-5,000 axeniska nematod ägg i en total av 100 till 400 pl (optimalt 2.000 nematoder i 200 pl) på varje lipid agarplatta.
- Inkubera i mörker utan fukt vid 25 ° C tills IJ eller andra stadier av intresse, form. IJ syns som en fuzzy vit ring på kanten av plattan. Att titta på andra livsstadier, se protokoll 4.
- Placera plattorna i en modifierad vit fälla 30. Ta bort locket lipid agarplattan och placera den nedre i botten av en tom 100 mm x 20 mm petriskål. Fyll stora Petri-skål med vatten, eller annan buffert lämplig för er nematod, att omge den lilla plattan. Vattnet bör vara ungefär halva höjden av den lilla plattan.
- Inkubera vattenlåset tills avkomma IJ har dykt in i bufferten.
- Infektiösa juvenila nematoder kan förvaras i vatten i en vävnadsodlingskolv.
4. Insamling av tidiga livsstadier för screening
- Använd steg 3,1 till 3,4 för att ställa in analysen.
- Inkubera plattorna tills önskad livsstadier är närvarande. Daglig visuell inspektion kan vara nödvändigt att bestämma timing. Att inspektera plattorna, använd proceduren som beskrivs i protokoll 2,5. För S. carpocapsae X. nematophila på LA-plattor kommer gravida kvinnor att vara närvarande i 4-5 dagar kommer ungdomar att vara närvarande i 7 dagar, och infektiösa ungfisk kommer att börja produceras av 15-17 dagar.
- När de önskade livsstadier finns, samla ditt prov. Fyll en brunn i en 96-brunnsplatta med 200 | il PBS eller annan lämplig buffert. Försiktigt skrapa bort en del av den bakteriella gräsmattan som innehåller nematoder. En ärtstora belopp (~ 50 mg) kommer att tillhandahålla minst flera hundra nematoder gång F1 avkomma produceras, men mer kan vara nödvändigt för tidigare tidpunkter. Placera pinnen i brunnen bufferten.
- Inkubera 30 sekunder till en minut. Ta bort pinnen och skrapa bort den kvarvarande återstoden. Använd pinnen för att avlägsna agar från brunnen. Nematoderna skall vara synliga i bufferten. Flytta bufferten blandningen till en ren mikrofugrör.
- Behandla nematoderna med levamisol eller annat förlamande medel. Lös några korn levamisol i 30 & mu, L vatten. Lägg 1-2 pl av denna blandning för varje 50 il prov. Efter levamisol behandling nematoderna kommer att vara icke-livskraftiga.
- Om proverna kommer ses på en senare tidpunkt, fastställa som beskrivs i detta steg. Om inte, gå vidare till steg 4,6. Tillsätt 200 | il av fixeringslösning innehållande 1X-buffert och 4% paraformaldehyd. Blanda försiktigt kan pipettering orsaka känsliga livsstadier att lysera. Täck med folie, och inkubera vid rumstemperatur på en skakapparat med låg under minst 18 timmar.
- Placera rören i en tub rack, och låta nematoderna att sedimentera till botten av röret.
- Skölj nematoder för att avlägsna bakgrund. Pipettera bort överskottsvätska och tillsätt 200 till 500 pl buffert och blanda försiktigt. Upprepa. Detta kan upprepas några gånger för att ta bort mer bakgrundsinformation om så önskas.
- Låt nematoderna att sedimentera till botten av röret och återsuspendera i önskad volym.
- Om nematoderna inte är fasta, skärm omedelbart. Fasta nematoder kan förvaras i kylskåp i upptill två veckor. Förvara i mörker.
5. Screening Nematoder för bakteriell Association med mikroskop
- Välj några nematoder för att visa under luppen genom att ta bort ett litet urval av din blandning.
- För att säkerställa att nematoderna fortfarande för bilden, behandla med en förlamad ämne som beskrivs i protokoll 4,5. Om du inte tar en bild eller nematoderna redan fast, kan detta utelämnas.
- Lägg 20-30 il nematoder i vatten till objektglas och placera ett täckglas ovanpå.
- Visa hela nematoder använder Ijusmikroskopi för att säkerställa nematoder är i synfältet.
- Se nematoder använder fluorescerande inställningen på mikroskopet som motsvarar den fluorescens uttrycks av bakterierna.
- För att identifiera bakteriella lokalisering, ta bilder av nematoden i fluorescerande inställning och en ljusmikroskopi inställning och sedan lägga på bilderna. Fotona måste vara av samma field. perspektiv. Det kan vara nödvändigt att prova flera förstoringar och utsikt över nematoden att hitta bakterierna.
- Fördelningen av nematod kolonisering kan kvantifieras genom att räkna en population av nematoder, poäng för närvaro eller frånvaro av bakterier, och beräkning av procent koloniserade. Vi rekommenderar räknar tills minst 30 nematoder i befolkningen räknas i varje kategori (med eller utan kolonisering) för att erhålla ett tillförlitligt värde.
- När endast ett fåtal nematoder i befolkningen koloniserade, kan det vara nödvändigt att räkna flera tusen nematoder innan 30 iakttas. För hög genomströmning räkning använda följande steg.
- Istället för att räkna nematoder individuellt alikvot befolkningen i en multi-brunnar (t.ex. en 24-brunnsplatta). Efter att nematoderna har sjunkit till botten av skålen, kan varje brunn ska skannas på mikroskopet och antalet koloniserade nematoder kan görs.
- Det totala antalet nematoder iNa populationen kan identifieras genom serieutspädningar av nematoder i brunnen. Exempelvis kan 1 ml av nematoder sättas till en brunn, kan blandas väl genom omröring med en pipettspets, och 3 pl avlägsnas och räknas för kvantifiering av den totala befolkningen i brunnen.
- Den procentuella andelen koloniserade nematoder kan erhållas genom att dividera antalet koloniserats av det totala antalet nematoder i brunnen.
6. Representativa resultat
Exempel mikroskopbilder av Steinernema nematoder är associerade med Xenorhabdus bakterier visas i figur 3. För att skapa den sammansatta bilden ses i figur 3A, var en faskontrastbilden belagd med en fluorescerande bild. Pilen i fig 3A visar de bakterier som finns i infektiösa juvenil nematoden (bar = 100 | im). Konstruerades på ett liknande sätt och visar en juvenil nematod wi Figur 3Bth grönt fluorescerande protein märkta bakterier (grön stavar) lokaliserad hela nematoder intestinala lumen (bar = 20 nm). En population av nematoderna från två medier räknades och gjorde för kolonisering av den bakteriella symbiont (tabell 1). För robusta statistik är det bäst att räkna minst 100 nematoder per prov med minst 30 faller i varje kategori. Såsom framgår av tabell 1, är dessa nematoder koloniserade på en nivå av ca 14,6% när de odlas på lipid-agar och 68,6% när den odlas på lever njure agar. Andra nematod och bakteriearter har visat sig ha olika nivåer av kolonisering. Till exempel X. nematophila koloniserar 99% av S. carpocapsae infektiösa ungdomar (Martens 2003), och P. luminescens koloniserar 26% av H. bacteriophora infektiösa ungdomar (Ciche 2003).
Figur 1. Schematisk skiss av metoden. A. Bakterien är konstruerad för att uttrycka ett fluorescerande protein. B. nematod ägg isolerade från vuxna nematoder för att producera sterila nematoder. Som samodlas med de fluorescerande bakterier C. De sterila nematoder. D. De resulterande livsstadier ses under mikroskop för att bedöma bakteriell närvaro i nematoden.
Figur 2. Skildring av vuxna kvinnor som innehåller ägg. A. schematiska visar det allmänna intrycket av Steinernema honor. Infällt: DIC bild av en S. feltiae Gravid kvinna. Den svarta pilen indikerar vulvan. Vita pilar visar synliga ägg. Bilden är på 20X förstoring och skalan stapeln representerar 100 nm. B. DIC bild av en utvecklad men okläckta S.feltiae nematod ägg. Bilden är 40X förstoring, och skalan stapeln representerar 50 um. C. DIC bild av ägg isolerade från S. feltiae nematoder i 10X förstoring. Skala bar är 100 nm.
Figur 3. Exempel mikroskop bilder av nematod-bakteriell förening. A. S. puntauvense nematoder var förknippade med deras bakteriell symbiont, X. bovienii, uttrycka GFP. Bilden är en sammansatt bild som produceras genom att lägga en bild faskontrast med en fluorescerande bild från samma synfält. Pilen indikerar den fluorescerande bakteriella symbiont inom nematod värd. Skala bar är 100 nm. B. Denna bild visar en S. carpocapsae juvenil nematod med GFP-uttryckande X. nematophila placeras inom nematod tarmen.Denna bild konstruerades genom överliggande en fluorescerande bild över en differential interferens kontrast bild. Skalan stapeln representerar 20 pm.
| Sila | Antal Nematoder med acteria | Totalt Nematoder Räknade | Procent av nematoder olonized |
| S. puntauvense Lipid Agar | 30 | 205 | 14,60% |
| S. puntauvense Lever Njure Agar | 72 | 105 | 68,60% |
Tabell 1. Exempel poängsättning av en nematodpopulation för bakteriell närvaro. I detta experiment, axenisk S. puntauvense nematoder odlades med sin GFP-uttryckande symbiont på olika tillväxtmedia (lipid-agar och lever njure agar 32) för att testa för kolonisering defekter. Totalt minst en hundred nematoder per prov räknades och bedömdes med avseende på närvaro av bakterier. För statistisk, replikerar tre experimentella bör räknas med minst 30 nematoder som faller inom varje kategori.
Tabell 2. Fluorescerande protein innehållande plasmider. En lista över potentiella plasmider för införande av ett fluorescerande protein in i den bakteriella symbiont ges nämnt av plasmid. Annan information som ingår är fluorescerande proteinet kodat, antibiotika kassett som används för plasmid underhåll andra bruksanvisningar, källan till plasmiden. Koncentrationen anges i parentes är koncentrationen av antibiotikum som används för X. nematophila. Alla dessa plasmider har använts framgångsrikt i antingen Xenorhabdus eller Photorhabdus. Ytterligare information kan erhållas från de angivna citat. Beroendepå bakterien som testas, kan vissa plasmider fungerar inte baserad på det fluorescerande proteinet, antibiotikaselektion, insertionsstället, eller ursprunget för replikation. Plasmidema ovan innehåller olika funktioner som kan möjliggöra användning i bakterien av intresse. Till exempel, mini-Tn7-KSGFP skär in i attTn7 platsen för kromosomen, medan pECM20 sätts in i X. nematophila kromosomen genom homolog rekombination. Alternativt är pPROBE plasmiderna underhålls extrakromosomalt och varje pPROBE plasmid har samma ryggrad och fluorofor men har olika selekterbara markörer eller replikationsursprung för att möjliggöra deras användning i en mängd olika taxonomisk eller mutanta bakgrunder.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Protokollet som beskrivs här tillhandahåller en metod för optisk detektering av bakterier i en nematod värd (figur 1). Denna metod drar fördel av den optiska transparens av nematoder och förmågan att fluorescerande märka bakterier, möjliggör in vivo-analys av bakterier inom nematoden värd (figur 3). Specifikt identifierar detta tillvägagångssätt bakteriell lokalisering i sin värd. Genom att räkna en nematodpopulation och poäng för bakteriell närvaro kan frekvensen av bakteriell kolonisering över nematodpopulation bestämmas (tabell 1). Denna metod är en av många potentiella tekniker som kan användas för att studera samspelet mellan nematoden värdar och bakteriella symbionter. Relaterade metoder har beskrivits tidigare för att isolera den bakteriella symbiont, odla nematoder axeniskt och manipulera båda parter 25-27.
Protokollet beskrivet timere utvecklades i Xenorhabdus nematophila-Steinernema carpocapsae modellsystem 14, och liknande metoder har använts i andra entomopatogena nematod-bakteriella föreningar 9,15,17,18. Flera villkor måste vara uppfyllda för att tillämpa denna metod på andra nematod-bakteriella system. Först måste den bakteriella symbiont kunna isoleras från värden och odlas självständigt i kultur. Andra måste symbiont kunna ta upp DNA genom transformation eller konjugering för att införa den fluorescerande proteinet. Det tredje, för bästa resultat, måste nematoden ha en scen som kan göras axenisk och återinfördes för bakterier. Men även om nematoden inte kan isoleras från bakterierna kan det ändå vara möjligt att visualisera sambandet: istället för att lägga axeniska ägg till gräsmattan av fluorescerande bakterier, lägga till en konventionellt höjt levnad och fortsätt med det protokoll som beskrivs. Alla resultat kommer att drabbas av varning: epå bakterier som inte uttrycker GFP kommer att konkurrera med GFP-uttryckande bakterier för lokalisering till specifika nematod vävnader, och på grund av detta bör kolonisering inte mätas genom mikroskopisk räkning. Men om de bakterier som inte uttrycker GFP drastiskt konkurrera GFP-uttryckande bakterier, bör GFP-uttryckande bakterier lokalisera till nematod vävnader i åtminstone några djur i befolkningen och föreslå viktiga vävnad platser för bakteriell kolonisering. En långvarig nackdel med att använda fluorescerande protein uttryckande stammar är att de kan kolonisera en värd med olika effektivitet än en stam som inte uttrycker fluorescerande proteiner (t.ex. 12).
Stegen som beskrivs i detta protokoll kan kräva optimering beroende på nematoden och bakteriestammar som används. För konjugering av bakterien vissa villkor som kan ändras är längden och temperaturen för tillväxt, förhållandet mellan givare till mottagare, och plasmid används. Exempel på relevanta plasmider anges i tabell 2. Alla dessa plasmider har använts framgångsrikt i antingen Xenorhabdus eller Photorhabdus bakterier i samband med deras nematod värd 14,17,20,24,33-35. För att säkerställa stabilt upprätthållande av det fluorescerande proteinet under nematod kolonisering är det bäst att använda en plasmid som kommer att infogas i kromosomen av mål-bakterien. Vidare kan vissa bakterier tar inte upp dessa plasmider. Exempelvis har pECM20 endast använts i X. nemtaophila och mycket nära besläktade bakteriestammar 14 eftersom denna plasmid sätts in i kromosomen med hjälp av en homolog region mellan plasmiden och kromosom, plasmiden inte sätta om målet bakterien saknar denna region. För att använda denna plasmid för andra bakterier, de X. nematophila-specifik region måste vara substituerad med en genomisk region från målet bakterien. Några plasmid-transformation system kommer också require vissa ändringar från protokoll 1. Till exempel, mini-Tn 7-KSGFP och PBK-miniTn 7-ΩGm-DsRed kräver en medhjälpare plasmid innehållande införlivande gener (tsnABCDE) 33,35,36 för att infoga i den bakteriella kromosomen. Konjugering är mest effektiv med dessa Tn 7-baserade plasmider, när 2-timmars kulturer (~ OD 600 0,3 till 0,4) blandas i lika förhållanden.
Efter lyckad konjugering är det viktigt att utnyttja rätt selektiva plattor motsvarande den använda plasmiden. De selektiva plattorna bör innehålla antibiotika som kodas på plasmiden för att selektera för närvaron av plasmiden i mottagaren och en motselektering mot givar-och hjälpar-stammar. Till exempel, när konjugera pECM20 i X. nematophila disk-valet används är ampicillin eftersom X. nematophila är ampicillinresistenta och givaren stammen är ampicillin känslig. Om antibiotika mot-urvalet är tillgänglig i yvårt system, en diaminopimelinsyra (DAP) kräver givare kan användas. Att växa DAP-kräver stammar är DAP till fasta och flytande tillväxtmedium under före konjugering och konjugering steg, och utelämnade vid motselektering steg. När DAP är frånvarande givaren stammen växer inte och är effektivt mot vald.
Att säkerställa ett framgångsrikt ägg isolering är det viktigt att noggrant kontrollera för äggproduktion (figur 2). Vid tidpunkten för isolering, bör kvinnliga nematoder vara full av ägg och några ägg bör synas i media (Figur 2A). Om kvinnliga nematoder producerar befruktade ägg åtminstone några överstående ägg kommer att ha tydligt utvecklats som okläckta nematoder (Figur 2B). För S. carpocapsae kommer äggen ändras från sfäriska till något avlånga innan utveckla nematoder och kläckning. Tidpunkten och villkoren för nematod tillväxt kan också behöva ändras för att maximera befruktade äggetger, bland annat förkorta eller förlänga den tid före ägg skörd, eller använda alternativa medier som är lämpliga för de specifika nematodarter. I slutet av isolering, skall ägg vara väl synliga i bufferten (figur 2C). Parametrar i ägget isolering protokoll som kan kräva optimering inkluderar blekmedel och KOH koncentrationer i ägget lösningen, inkubationstid på ägg lösning eller centrifugeringsvarvtal. Om ägget isoleringen ger ägg men inga nematoder utvecklas under samodling, är det möjligt att de isolerade ägg är icke-viabla. För att kontrollera bärkraft, lämna isolerade ägg i buffert och vänta på nematoder att kläckas. Äggen bör kläcks inom en eller två dagar av isolering och sedan unga nematoder kan användas i samodling analys. Om äggen kläcks men inte utvecklas under samodling analys, kan det vara nödvändigt att förändra tillväxtbetingelserna eller medium som används för samodling. Vi noterar att tidigare studies har isolerat bakteriefria nematoder genom blötläggning nematoderna i en antibiotisk cocktail (t.ex. 3,37). Det tillvägagångssätt vi beskriver här är fri från några av de förbehåll av antibiotikumet blötläggning, inklusive komplikationer med användning bakteriostatiska antibiotika, antibiotikaresistenta kontaminerande bakterier och antibiotiska effekter på nematoderna. Vissa skeden av nematoder kan också vara resistenta mot antibiotika och behålla sina bakteriella symbionter 3. Slutligen noterar vi att för mikroskopi, kan koncentrationen av levamisol är nödvändig för nematod immobilisering variera med olika nematod klader.
När denna metod har etablerats i systemet av intresse, är det möjligt att ändra tekniken att härleda mer information. Genom att titta på tidigare tidpunkter i rundmasken livscykel (protokoll 4), kan man kunna identifiera hur bakterien och nematoder initiera sin förening 14,16. Dessutom kan detta tillvägagångssätt användas to Genomföra en hög genomströmning mutant skärmar för att identifiera bakteriella faktorer som bidrar till symbios, med fluorescens för att detektera kolonisering 17,18. Andra metoder såsom signatur taggade mutagenes kräver användning av radioaktivt märkta prober och är mer tidskrävande 22,28. Därför är användningen av fluorescensmikroskopi för bakteriell symbiont visualisering i nematoder ett effektivt screeningmetod för att undersöka bakteriella interaktioner med en nematod värd.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Inga intressekonflikter deklareras.
Acknowledgments
Författarna vill tacka Eugenio Vivas, Kurt Heungens, Eric Martens, Charles Cowles, Darby socker, Eric Stabb, och Todd Ciche för deras bidrag till utvecklingen av detta protokoll och verktyg som används. KEM och JMC stöddes av National Institutes of Health (NIH) National Research Service Award T32 (AI55397 "Mikroberna i hälsa och sjukdom"). JMC stöddes av en National Science Foundation (NSF) Graduate Research Fellowship. Detta arbete har finansierats med bidrag från National Science Foundation (IOS-0.920.631 och IOS-0.950.873).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Lipid Agar (sterile) |
8 grams nutrient broth, 15 grams agar, 5 grams yeast extract, 890 ml water, 10 ml 0.2 g/ml MgCl2. 6H20, 96 ml corn syrup solution*, 4 ml corn oil* Stir media while pouring plates *add sterile ingredient after autoclaving |
||
| Corn Syrup Solution (sterile) |
7 ml corn syrup, 89 ml water mix and autoclave |
||
| Egg Solution | 16.6 ml 12% sodium hypochlorite, 5 ml 5M KOH, 80 ml water | ||
| Lysogeny Broth (sterile) |
5 grams yeast extract, 10 grams tryptone, 5 grams salt, 1 L water mix and autoclave |
||
| Microfuge | Fisher | 13-100-675 | Any microfuge that holds microfuge tubes will work |
| Centrifuge | Beckman | 366802 | Large table top centrifuge that holds 15 ml and 50 ml conical tubes |
| Sterile 60 mm X 15 mm Petri Dish | Fisher | 0875713 | |
| 50 ml centrifuge tubes | Fisher | 05-539-6 | |
| 15 ml centrifuge tubes | Fisher | 05-531-6 | |
| Sterile 100 mm X 20 mm Petri Dish | Fisher | 0875711Z | Deeper than standard Petri dishes |
| 24-well plate | Greiner Bio-One | 662000-06 | |
| Microscope | The microscope needs florescent capabilities compatible with your fluorophore | ||
| Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 15710 | |
| PBS (sterile) |
8 g NaCL 0.2 g KCL 1.44 g Na2HPO4 0.24 g KH2PO4 1 L water Adjust to a pH of 7.4 and water to 1 L and autoclave |
||
| Microfuge tubes | Fisher | 05-408-138 | 2 ml or 1.5 ml tubes |
| Shaker | Any shaker that causes the liquid to gently move will work | ||
| Diaminopimelic acid | Sigma | D-1377 | If needed, supplement media to a concentration or 1 mM |
References
- Holterman, M., van der Wurff, A. Phylum-wide analysis of SSU rDNA reveals deep phylogenetic relationships among nematodes and accelerated evolution toward crown clades. Mol. Biol. Evol. 23, 1792-1800 (2006).
- Lambshead, P. J. D., Boucher, G. Marine nematode deep-sea biodiversity - hyperdiverse or hype. J. Biogeogr. 30, 475-485 (2003).
- Poinar, G. O. J., Thomas, G. M. Significance of Achromobacter nematophilus Poinar and Thomas (Achromobacteraceae: Eubacteriales) in the development of the nematode, DD-136 (Neoaplectana sp. Steinernematidae). Parasitol. 56, 385-390 (1966).
- Herbert, E. E., Goodrich-Blair, H. Friend and foe: the two faces of Xenorhabdus nematophila. Nat. Rev. Microbiol. 5, 634-646 (2007).
- Kaya, H. K., Gaugler, R. Entomopathogenic nematodes. Annu. Rev. Entomol. 38, 181-206 (1993).
- Bird, A. F., Akhurst, R. J. The nature of the intestinal vesicle in nematodes of the family Steinernematidae. Int. J. Parasitol. 13, 599-606 (1983).
- Martens, E. C., Goodrich-Blair, H. The Steinernema carpocapsae intestinal vesicle contains a subcellular structure with which Xenorhabdus nematophila associates during colonization initiation. Cell. Microbiol. 7, 1723-1735 (2005).
- Snyder, H. A., Stock, S. P., Kim, S. K., Flores-Lara, Y., Forst, S. New insights into the colonization and release process of Xenorhabdus nematophila and the morphology and ultrastructure of the bacterial receptacle of its nematode host, Steinernema carpocapsae. Appl. Environ. Microbiol. 73, 5338-5346 (2007).
- Abebe, E., Abebe-Akele, F., Morrison, J., Cooper, V., Thomas, W. K. An insect pathogenic symbiosis between a Caenorhabditis and Serratia. Virulence. 2, 158-161 (2011).
- Abebe, E., Jumba, M. An entomopathogenic Caenorhabditis briggsae. J. Exp. Biol. 213, 3223-3229 (2010).
- Torres-Barragan, A., Suazo, A., Buhler, W. G., Cardoza, Y. J. Studies on the entomopathogenicity and bacterial associates of the nematode Oscheius carolinensis. Biol. Control. 59, 123-129 (2011).
- Ye, W. M., Torres-Barragan, A., Cardoza, Y. Oscheius carolinensis n. sp (Nematoda: Rhabditidae), a potential entomopathogenic nematode from vermicompost. Nematology. 12, 121-135 (2010).
- Zhang, C., Liu, J. Heterorhabditidoides chongmingensis gen. nov., sp. nov. (Rhabditida: Rhabditidae), a novel member of the entomopathogenic nematodes. J. Invertebr. Pathol. 98, 153-168 (2008).
- Martens, E. C., Heungens, K., Goodrich-Blair, H. Early colonization events in the mutualistic association between Steinernema carpocapsae nematodes and Xenorhabdus nematophila bacteria. J. Bacteriol. 185, 3147-3154 (2003).
- Ciche, T. A., Ensign, J. C. For the insect pathogen, Photorhabdus luminescens, which end of a nematode is out. Appl. Environ. Microbiol. 69, 1890-1897 (2003).
- Ciche, T. A., Kim, K. S., Kaufmann-Daszczuk, B., Nguyen, K. C., Hall, D. H. Cell invasion and matricide during Photorhabdus luminescens transmission by Heterorhabditis bacteriophora nematodes. Appl. Environ. Microbiol. 74, 2275-2287 (2008).
- Easom, C. A., Joyce, S. A., Clarke, D. J. Identification of genes involved in the mutualistic colonization of the nematode Heterorhabditis bacteriophora by the bacterium Photorhabdus luminescens. BMC Microbiol. 10, 45 (2010).
- Somvanshi, V. S., Kaufmann-Daszczuk, B., Kim, K. S., Mallon, S., Ciche, T. A. Photorhabdus phase variants express a novel fimbrial locus, mad, essential for symbiosis. Mol. Microbiol. 77, 1021-1038 (2010).
- Martens, E. C., Russell, F. M., Goodrich-Blair, H. Analysis of Xenorhabdus nematophila metabolic mutants yields insight into stages of Steinernema carpocapsae nematode intestinal colonization. Mol. Microbiol. 51, 28-45 (2005).
- Sugar, D. R., Murfin, K. E. Phenotypic variation and host interactions of Xenorhabdus bovienii SS-2004, the entomopathogenic symbiont of Steinernema jollieti nematodes. Env. Microbiol. 14, 924-939 (2012).
- Cowles, C. E., Goodrich-Blair, H. The Xenorhabdus nematophila nilABC genes confer the ability of Xenorhabdus spp. to colonize Steinernema carpocapsae nematodes. J. Bacteriol. 190, 4121-4128 (2008).
- Heungens, K., Cowles, C. E., Goodrich-Blair, H. Identification of Xenorhabdus nematophila genes required for mutualistic colonization of Steinernema carpocapsae nematodes. Mol. Microbiol. 45, 1337-1353 (2002).
- Goetsch, M., Owen, H., Goldman, B., Forst, S. Analysis of the PixA inclusion body protein of Xenorhabdus nematophila. J. Bacteriol. 188, 2706-2710 (2006).
- Bhasin, A., Chaston, J. M., Goodrich-Blair, H. Mutational Analyses Reveal Overall Topology and Functional Regions of NilB, a Bacterial Outer Membrane Protein Required for Host Association in a Model of Animal-Microbe Mutualism. J. Bacteriol. 194, 1763-1776 (2012).
- Ciche, T. A., Goffredi, S. K. Methods in General and Molecular Microbiology. Reddy, C. A. , ASM Press. 394-419 (2007).
- Goodrich-Blair, H., Clarke, D., Grewal, P. S., Ciche, T. A. Insect Pathogens, Molecular Approaches and Techniques. Stock, S. P., Boemare, N., Vandenberg, J., Glazar, I. , CABI Publishing. 239-269 (2009).
- Stock, S. P., Goodrich-Blair, H. Manual of Techniques in Invertebrate Pathology. Lacey, L. A. , Elsevier Press. 375-425 (2012).
- Martens, E. C., Gawronski-Salerno, J. Xenorhabdus nematophila requires an intact iscRSUA-hscBA-fdx locus to colonize Steinernema carpocapsae nematodes. J. Bacteriol. 185, 3678-3682 (2003).
- Vivas, E. I., Goodrich-Blair, H. Xenorhabdus nematophilus as a model for host-bacterium interactions: rpoS is necessary for mutualism with nematodes. J. Bacteriol. 183, 4687-4693 (2001).
- White, G. F. A method for obtaining infective nematode larvae from cultures. Science. 66, 302-303 (1927).
- Ciche, T. A., Ensign, J. C. For the insect pathogen Photorhabdus luminescens, which end of a nematode is out. Appl. Environ. Microbiol. 69, 1890-1897 (2003).
- Sicard, M., Brun, N. L. e Effect of native Xenorhabdus on the fitness of their Steinernema hosts: contrasting types of interaction. Parasitol. Res. 91, 520-524 (2003).
- Lambertsen, L., Sternberg, C., Molin, S. Mini-Tn7 transposons for site-specific tagging of bacteria with fluorescent proteins. Environ. Microbiol. 6, 726-732 (2004).
- Miller, W. G., Leveau, J. H., Lindow, S. E. Improved gfp and inaZ broad-host-range promoter-probe vectors. Mol. Plant Microbe Int. 13, 1243-1250 (2000).
- Teal, T. K., Lies, D. P., Wold, B. J., Newman, D. K. Spatiometabolic stratification of Shewanella oneidensis biofilms. Appl. Environ. Microbiol. 72, 7324-7330 (2006).
- Bao, Y., Lies, D. P., Fu, H., Roberts, G. P. An improved Tn7-based system for the single-copy insertion of cloned genes into chromosomes of Gram-negative bacteria. Gene. 109, 167-168 (1991).
- Woodring, J. L., Kaya, H. K. Steinernematid and Heterorhabditid Nematodes: A Handbook of Biology and Techniques. Southern Cooperative Series Bulletin 331. , Arkansas Agricultural Experiment Station. (1988).
