Summary
מאמר זה מתאר את הממשל של
Abstract
וידאו זה מתאר את השימוש בגוף כולו bioluminesce ההדמיה (BLI) ללימודי סחר חיידקים בעכברים חיים, עם דגש על השימוש בחיידקים בגן וטיפול בתאי סרטן. חיידקים המצויים ברמה אטרקטיבית של וקטור לטיפול בסרטן, בעל יכולת טבעית לגדל מעדיף בתוך גידולים בעקבות מנהל מערכתי. חיידקים שהונדסו גנטי איתור לוקס קלטת היתר BLI של החיידק סרטניים ואתרים במקביל. המיקום ורמות חיידקים בתוך גידולים לאורך זמן, ניתן לבדוק בקלות, דמיין בשניים או שלושה ממדים. השיטה ישימה למגוון רחב של מינים וסוגי חיידקי xenograft סרטניים. מאמר זה מתאר את הפרוטוקול לניתוח של חיידקים בתוך bioluminescent עכברי נושאים גידולים תת עורי. ויזואליזציה של חיידקי commensal במערכת העיכול (git) על ידי BLI גם תארה. יציג זה חזק, וזול, בזמן אמת הדמית אסטרטגיהts שיטה אידיאלית לחקר חיידקים בחי בהקשר של חקר הסרטן, בטיפול בגן מסוים, ומחלות זיהומיות. סרטון זה מתאר את ההליך ללימוד ה-Lux מתויג coli בעכברים חיים, הוכחת BLI readout מרחב ובזמן להשגת ניצול עם מערכת IVIS.
Protocol
1. אינדוקצית גידול
- לזירוז גידול שגרתי, המינון המינימאלי של תאים הסרטניים מושעים ב200 μl של התרבות בינונית סרום ללא הוזרק תת עורית (SC) לתוך האגף של זיהום החופשי בשבוע 6-8 עכברי BALB / C או athymic נשיים ישנים MF1-nu/nu n = 6 (הרלן, אוקספורדשייר, בריטניה) (1 x 10 6 תאים 4T1) באמצעות מחט מזרק 21-מד. הכדאיות של תאים המשמשים לחיסון הייתה גבוה מ 95%, כפי שנקבע על ידי ספירה חזותית באמצעות haemocytometer והדרת צבע הכחול Trypan (Gibco).
- בעקבות הקמת גידול, גידולים הורשו לגדול ולהתפתח והיו במעקב פעמים בשבוע. נפח גידול היה מחושב לפי נוסחת V = (ab 2) Π / 6, שבו הוא הארוך ביותר בקוטר של גידול ואילו b הוא ניצב הקוטר הארוך ביותר לקוטר.
2. הכנת קטריאלי
- זן החיידקים המשמש בprotoco זהאני היה א coli K-12 MG1655, שאינו החלבון הרעלן-להביע מתח, מחסה luxABCDE קידוד פלסמיד המאפשר לחיידקים להיות מזוהים על ידי BLI. א coli MG1655 המכיל luxABCDE המשולב היה גדל אירובי על 37 מעלות צלזיוס במדיום LB (סיגמה אולדריץ, אירלנד) בתוספת 300 מיקרוגרם / המ"ל אריתרומיצין (EM). הנגזרת של bioluminescent MG1655 נוצרה באמצעות p16S לוקס פלסמיד המכיל את עזרת P המכוננת luxABCDE 1 אופרון.
- להכנה לממשל לעכברים, תרבויות הודגרו במדיום LB על 37 מעלות צלזיוס בייקרה ב 200 סל"ד לשלב יומן האמצע-(צפיפות אופטית ב 600 ננומטר). חיידקים נקצרו ידי צנטריפוגה (6,000 × גרם למשך 5 דקות), נשטפו עם PBS (סיגמא), ודילול ב1 × PBS 10 7 יחידות מושבה להרכיב (CFU) / מ"ל עבור IV ממשל, או 1 x 10 10 לgavage.
3. Administra קטריאליtion
- עכברים חולקו באופן אקראי לקבוצות ניסוי, כאשר גידולים הגיעו לכ 100 מ"מ 3 בנפח. עירוי לוריד, עכברים מאופקים כל אחד קבלו 10 6 תאים ב100 μl, מוזרקים ישירות לוריד הזנב לרוחב באמצעות מחט מזרק 28g. ספירת הקיימא של כל בידוד נקבעה על ידי ציפוי רטרוספקטיבית.
- ללימודי קולוניזציה גית, 10 9 תאים חיידקיים היו אוראליים ב100 μl לעכבר על ידי gavage, על שלושה ימים רצופים. רמות חיידקים commensal קיים ירדו בלפני ההאכלה על ידי תוספת של סטרפטומיצין 5 מ"ג / מ"ל במי שתייה בעכבר למשך 7 ימים שקדם לתחילת gavage פי 1.
4. הדמית פליטת אור
- 2D in vivo BLI ההדמיה בוצע באמצעות IVIS100 (Caliper). בממשל הגדיר נקודתי זמן הודעת חיידקים, עכברים היו מורדמים באמצעות ההרדמה של Caliper XGI-8 הגזמערכת עם Isofluorane 3%, וניתוח תמונה של כל גוף בוצעה ב100 מערכת IVIS עבור 2-5 דקות ברגישות גבוהה.
- להדמית 3D, עכברים מורדמים הונחו במעבורת הדמית עכבר הפנימי של מערכת ההדמיה האופטית להדמיה הגבה (IVIS ספקטרום, Caliper). לרכוש תמונות של אות לוציפראז חיידקים לשיקום אופטי 3D, אורכי גל נעים סינון פליטה 500-580 ננומטר שמשו עם 16 פעמי רכישת הסל של 3-4 דקות למסנן למקסם את יחס האות לרעש. כחלק מרצף רכישת התמונה, תמונת אור מובנהית הושגה להגדיר מפת גובה. מפה זה הייתה קלט מפוזרת אור הדמית אלגוריתמי שחזורים ששמשו ליצירת תמונה אופטית 3D באמצעות אופטימיזציה אינה שלילית לפחות ריבועי 2 טומוגרפיה (DLIT).
- ניתוח תמונה: אזורים של עניין זוהה ולכמת באמצעות תוכנת תמונת חיים (Caliper).
5. נציגתוצאות
במחקר זה, החיידקים פתוגניים commensal הלא E.coli K-12 MG1655 להביע luxABCDE אופרון היה רביעי ניתן לעכברי נושאי גידולי xenograft 4T1 sc. לוקס אות חיידקים זוהתה באופן ספציפי בגידולים של עכברי הודעת IV-ממשל (איור 2). התאוששות תרבות של חיידקים מעכברי מדגם מאמתת את קיומו של קשר לינארי בין מספרי חיידקי קיימא וכמות האור זוהה (איור 3). בתחום הדמית vivo של חיידקי commensal דרך פה המנוהל ב- Git גם מושג באמצעות 3D BLI.
איור 1. פרוטוקול ציר זמן. גידולים תת עורי הם המושרה בעכברים, וחיידקים מנוהלים על התפתחות גידול (100 מ"מ 3). עכברים חיים הם BLI imהבן בממשל שונה בזמן נקודתי הודעת חיידקים (חיצים להציג זמנים טיפוסיים).
איור 2. מנהל של E. MG1655 luxABCDE coli לעכברי נושאים גידולים. גידולים תת עורי 4T1 היה מושרה בMF1 נו / נו עכברים וא MG1655 luxABCDE coli מנוהל על התפתחות גידולים. כל חיה קבלה 10 6 תאים הוזרקו ישירות לוריד הזנב לרוחב. עכברים צלמו בארבע נקודתי זמן במהלך המחקר (נקודות שחורות ציר Z-ותמונות) עם התאוששות מאוחרת של חיידקי קיימא (CFU) מגידולים של עכברים לדוגמה הקריבו (גרף עמודות). גידול במספרי חיידקים וביטוי גני פלסמיד במיוחד בגידולים נצפה לאורך זמן (עכבר נציג מאויר לכל נקודת זמן). לחץ כאן לצפייה בדמות גדולה.
איור 3. קשר בין מספרים חיידקיים intratumoral ופליטת אור. חיידקי קיימא בגידולים פורטו על ידי תרבות חיידקי vivo לשעבר מהגידולים הבאים לBLI בהודעת זמן נקודות שונים IV ממשל. היכנס ערכים של מספרי חיידקים (CFU) יחסית ליחידות vivo bioluminesce נמצאים בגרף. מתאם חזק בין ספירת חיידקים ואותות פליטת אור חיידקיים הוא ציין R 2 = 0.9717 1.
איור 4. תמונת 3D IVIS של מערכת העיכול Murine מאוכלסת על ידי א coli MG1655. Git של עכברים היה קולוניה אוראלית של 10 9 CFU של E. coli במשך שלושה ימים רצופים. דגימת תמונה בודדה מטומוגרפיה 3D של העכבר התנחל מוצגת.תמונות 3D להראות אטלס עכבר דיגיטלי של השלד לספק רישום אנטומי. א MG1655 פליטת אור coli גלויה בירוק בנמוך יותר, וסגולה ברמות גבוהות יותר.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
בהקשר של ריפוי גנטי, השימוש בחומרים ביולוגיים למסירה של גנים טיפוליים לחולים הוכיח הבטחה גדולה 3-5. כמו וירוסים, התכונות הביולוגיות המולדות של חיידקים מאפשרות אספקה יעילה DNA לתאים או רקמות, בעיקר בהקשר של הסרטן. הוכח שחיידקים באופן טבעי מסוגלים ביות לגידולים, כאשר באופן מערכתי וכתוצאה מרמות גבוהות של שכפול בסביבה, או שאינן קשורות למין (לא פולשני) או בתוך תאים סרטניים (פתוגנים). ספציפי לסרטן שכפול חיידקים בתחילה יוחס לטבע היפוקסי בגידולים מוצקים (2 רמות נמוכות O), עם האופי אנאירובי של אזורי Hypoxic נימקים / בתוך גידולים מקדמים צמיחה של חיידקים אנאירוביים וfacultatively אנאירובי. לאחרונה, גורמים כגון אספקה לא סדירה, והדם הדולף דיכוי חיסוני מקומי בגידולים הוצעו לתפקיד. מחקרים פרה ביותר נצלו xenogrמודלי גידול ירכים לחקור קולוניזציה גידול וקטור חיידקים. מודלים עכבריים של גידולים ספונטניים הנובעים דומים יותר למציאות קלינית במונחים של מערכת כלי דם (משתנה פוטנציאלי בהתישבות חיידקים של גידולים), וחיידקים גם הוכחו ליישב דגמים כאלה 6. ניסויים קליניים ופרה קליניים שונים הראו את היכולת של זני חיידקים שונים להובלה ולהגביר גורמי קידוד גנים כגון אנזימי prodrug מרות, רעלנים, מעכבי אנגיוגנזה, וציטוקינים באופן ספציפי בתוך גידולים 4,7. בעוד התישבות גידול חיידקים הוכחה להיות בלתי תלוי בזן חיידקים וסוג גידול 6, הבחירה של מתח אופטימלי עבור דגם מסוים עשויה להשתנות - למשל אנאירוביים מחמירים עשויים להיות מתאימים יותר עבור גידולי נימקים גדולים.
יש לנו מהונדס מספר הזנים להביע את קלטת luxABCDE 1,8-11. הפרוטוקול המפורט בוידאואנימציה משתמשת ה-Lux מתויג coli כדוגמה. E. חיידק הוא חלק מהפלורה של Git האנושי. מספר מחקרים תארו את הבטיחות של IV ממשל אינו פתוגניים E. זני coli לעכברים, וביכולת שלהם לגדול באופן ספציפי בתוך גידולים 4,12. E. coli MG1655 (כפי ששמש במחקר זה) גם מאכלס Git העכבר לרמות גבוהות 13.
המחקר של חיידקים במודלים של בעלי חיים קטנים הוא בעלת חשיבות גבוהה למגוון תחומי מחקר רפואיים, לרבות מחלות זיהומיות, בריאות מעיים וריפוי גנטי. לדוגמה, עיבודים של פרוטוקול זה יהיו ישים למחקרים של מעקב זיהום חיידקים, מערכות biofilm ההיווצרות וכו גנים אחרות המבוססות על כתב גם נבדקו, כוללת טופוגרפית פליטת פוזיטרונים (PET) סריקה בשילוב עם ביטוי חיידקים של תימידין קינאז (TK ), יהיה זה ביטוי אנדוגני בE. חיידק או S. typhimurium engineereד להביע את גן tk מוירוס הרפס סימפלקס (HSVtk) 14. שניהם (חלבון ירוק זרחני ועל גרסותיה) ניאון וזורחים גנים (לוקס) זמינים לחיידקים. יתרון של שימוש בחיידקי לוציפראז הוא שלוקס הקלטת מקודדת את האנזימים הדרושים לביוסינתזה מצע, וכתוצאה מהסוכן ישירות imagable 15. BLI מבוסס על זיהוי של אור bioluminescent מהנושא דרך שימוש במכשיר מצלמה מקוררת הואשמה יחד (CCD). המכשור וחוסר הדרישה לרדיואקטיביות פשוט יחסית מעמידים את הטכנולוגיה גם בהישג היד של המעבדה הממוצעת. BLI מציג יתרונות רבים בהשוואה לשיטות אחרות בvivo. זה קל לשימוש, זול, מהיר ומאפשר הדמיה של בעלי חיים רבים בו זמנית, בהפקה קצת רקע עם רגישות גבוהה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
אין ניגודי האינטרסים הכריזו.
Acknowledgments
המחברים מבקשים להודות תמיכה רלוונטית לכתב היד הזה מהוועדה השביעית מסגרת התכנית האירופית (PIOF-GA-2009-255466) והמועצה למחקר הבריאות האירית (HRA_POR/2010/138). Lux מתויג-E. coli היה מתנה מסוג ד"ר קורמאק Gahan, קורק מכללת האוניברסיטה.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 4T1 cell line | ATCC | CRL-2539 | Syngeneic breast cancer model derived from a spontaneously arising BALB/c mammary tumor |
| DMEM | Sigma-Aldrich | D6429 | Dulbecco's Modified Eagle's Medium |
| PBS | Sigma-Aldrich | D8537 | Phosphate Buffered Saline |
| Xenogen IVIS | Caliper Life Sciences | IVIS 100 for 2D imaging; IVIS Spectrum for 3D. | |
| Luria Broth Miller (LB) | Sigma-Aldrich | L2542 | Growth medium for E. coli |
| Erythromycin | Sigma-Aldrich | E5389 | Antibiotic |
| Streptomycin | Sigma-Aldrich | S9137 | Antibiotic |
| MF1nu/nu mice | Harlan (UK) | 069(nu)/070(nu/+) | Hsd:Athymic Nude-Foxn1nu |
| Balb/c mice | Harlan (UK) | 066 | Haplotype:H-2d |
| Gavage needle | Vet-tech Solutions (UK) | DE009 | 22G x 38mm straight gavage needle |
| Syringe for IV injection | BD BioSciences | 309309 - 1 ml | Insulin syringe with 28 G x ½ inch micro-fine IV needle. |
| Syringe for tumor inoculation | Braun | 9161376V | Omnifix 26 G x ½ inch needle |
References
- Cronin, M., et al. High resolution in vivo bioluminescent imaging for the study of bacterial tumour targeting. PLoS One. 7, e30940 (2012).
- Kuo, C., Coquoz, O., Troy, T. L., Xu, H., Rice, B. W. Three-dimensional reconstruction of in vivo bioluminescent sources based on multispectral imaging. J. Biomed. Opt. 12, 024007 (2007).
- Tangney, M., Ahmad, S., Collins, S. A., O'Sullivan, G. C. Gene therapy for prostate cancer. Postgrad Med. 122, 166-180 (2010).
- Morrissey, D., O'Sullivan, G. C., Tangney, M. Tumour targeting with systemically administered bacteria. Curr. Gene Ther. 10, 3-14 (2010).
- Collins, S. A., et al. Viral vectors in cancer immunotherapy: which vector for which strategy. Curr. Gene Ther. 8, 66-78 (2008).
- Yu, Y. A., Zhang, Q., Szalay, A. A. Establishment and characterization of conditions required for tumor colonization by intravenously delivered bacteria. Biotechnol. Bioeng. 100, 567-578 (2008).
- Baban, C. K., Cronin, M., O'Hanlon, D., O'Sullivan, G. C., Tangney, M. Bacteria as vectors for gene therapy of cancer. Bioeng. Bugs. 1, 385-394 (2010).
- Cronin, M., et al. Orally administered bifidobacteria as vehicles for delivery of agents to systemic tumors. Mol. Ther. 18, 1397-1407 (2010).
- van Pijkeren, J. P., et al. A novel Listeria monocytogenes-based DNA delivery system for cancer gene therapy. Hum. Gene Ther. 21, 405-416 (2010).
- Ahmad, S., et al. Induction of effective antitumor response after mucosal bacterial vector mediated DNA vaccination with endogenous prostate cancer specific antigen. J. Urol. 186, 687-693 (2011).
- Riedel, C. U., et al. Improved luciferase tagging system for Listeria monocytogenes allows real-time monitoring in vivo and in vitro. Appl Environ Microbiol. 73, 3091-3094 (2007).
- Cheng, C. M., et al. Tumor-targeting prodrug-activating bacteria for cancer therapy. Cancer Gene Ther. 15, 393-401 (2008).
- Foucault, M. L., Thomas, L., Goussard, S., Branchini, B. R., Grillot-Courvalin, C. In vivo bioluminescence imaging for the study of intestinal colonization by Escherichia coli in mice. Appl. Environ. Microbiol. 76, 264-274 (2010).
- Collins, S. A., Hiraoka, K., Inagaki, A., Kasahara, N., Tangney, M. PET Imaging For Gene & Cell Therapy. Curr. Gene Ther. , (2012).
- Tangney, M., Francis, K. P. In vivo Optical Imaging in Gene & Cell Therapy. Curr. Gene Ther. , (2012).
