Summary
Dit artikel beschrijft de toediening van
Abstract
Deze video beschrijft het gebruik van het gehele lichaam bioluminesce imaging (BLI) voor de studie van bacteriële handel in levende muizen, met een nadruk op het gebruik van bacteriën in gen-en celtherapie voor kanker. Aanwezige bacteriën een aantrekkelijke klasse van vector voor de behandeling van kanker, het bezit van een natuurlijke vermogen om bij voorkeur binnen tumoren groeien na systemische toediening. Bacteriën ontworpen om het lux-gen cassette vergunning BLI detectie van de bacteriën en tegelijkertijd tumorplaatsen drukken. De locatie en de hoeveelheid bacteriën in tumoren tijd gemakkelijk worden onderzocht, gevisualiseerd in twee of drie dimensies. De methode is toepasbaar op een breed scala aan bacteriesoorten en tumor xenograft types. Dit artikel beschrijft het protocol voor analyse van bioluminescente bacteriën in subcutane tumor dragende muizen. Visualisatie van commensale bacteriën in het maag-darmkanaal (GIT) door BLI wordt ook beschreven. Deze krachtige, en goedkoop, real-time beeldvorming strategie vertegents een ideale methode voor de studie van bacteriën in vivo in het kader van kankeronderzoek, met name gentherapie en infectieziekten. Deze video beschrijft de procedure voor het bestuderen van lux-gelabelde E. coli in levende muizen, waaruit de ruimtelijke en temporele uitlezing haalbaar gebruik te maken van BLI met de IVIS-systeem.
Protocol
1. Tumor Inductie
- Voor routine tumorinductie werd de minimale dosis van tumorigene cellen gesuspendeerd in 200 ul serumvrij kweekmedium subcutaan (sc) in de flank van infectievrije 6-8 weken oude vrouwelijke Balb / C muizen of athymische MF1-nu/nu n = 6 (Harlan, Oxfordshire, UK) (1 x 10 6 4T1 cellen) met een 21-gauge naald. De levensvatbaarheid van cellen voor inoculatie bedroeg meer dan 95% zoals bepaald door visuele telling met een hemocytometer en Trypan Blue Dye Exclusion (Gibco).
- Na tumor oprichting werden tumoren kunnen groeien en ontwikkelen, en waren twee keer per week gecontroleerd. Het tumorvolume werd berekend volgens de formule V = (ab 2) Π / 6, waarbij a de langste diameter van de tumor is en b de langste diameter loodrecht op een diameter.
2. Bereiding bacteriële
- De bacteriële stam die in deze protocoIk was E. coli K-12 MG1655, een niet-eiwit-toxine-expressie brengende stam, herbergde een luxABCDE coderende plasmide waarmee de bacteriën worden gedetecteerd door BLI. E. coli MG1655 bevattende geïntegreerde luxABCDE werd aëroob gekweekt bij 37 ° C in LB medium (Sigma-Aldrich, België) aangevuld met 300 ug / ml erythromycine (Em). De bioluminescente afgeleide van MG1655 werd gemaakt met behulp van het plasmide p16S lux die de constitutieve P HELP luxABCDE operon 1 bevat.
- Voor preparaat voor toediening aan muizen, werden de kweken geïncubeerd in LB-medium bij 37 ° C in een schudinrichting bij 200 rpm tot mid-log fase (optische dichtheid bij 600 nm). Bacteriën werden geoogst door centrifugatie (6.000 x g gedurende 5 min), gewassen met PBS (Sigma), en verdund in PBS 1 x 10 7 kolonievormende eenheden (cfu) / ml voor IV toediening, of 1 x 10 10 voor gavage.
3. Bacteriële Administratie
- Muizen werden willekeurig verdeeld in experimentele groepen als tumoren bereikt ongeveer 100 mm 3 in volume. Voor intraveneuze toediening, beheerst muizen elk 10 6 cellen in 100 ul ontvangen, direct geïnjecteerd in de laterale staartader met een 28G naald. Het kiemgetal van elk inoculum werd bepaald door plateren achteraf.
- Voor GIT kolonisatie studies werden 10 9 bacteriecellen oraal toegediend in 100 ul per muis via een maagsonde, op drie opeenvolgende dagen. Reeds bestaande commensale bacteriën niveaus werden vóór gedaald tot voeden door toevoeging van 5 mg / ml streptomycine in muis drinkwater gedurende 7 dagen voor het begin van orale gavage 1.
4. Bioluminescentie beeldvorming
- 2D imaging in vivo BLI werd uitgevoerd met IVIS100 (Caliper). Op bepaalde tijdstippen na bacteriële administratie, muizen werden verdoofd met behulp van Remklauw XGI-8 Gas AnesthesiaSysteem met 3% Isofluorane en het gehele lichaam werd beeldanalyse uitgevoerd in de IVIS 100 systeem gedurende 2-5 minuten bij hoge gevoeligheid.
- Voor 3D beeldvorming werden verdoofde muizen in een muis imaging shuttle binnenkant van het optisch afbeeldingsstelsel voor dorsale imaging (IVIS Spectrum, Caliper). Beelden van de bacteriële luciferase signaal voor 3D optische reconstructie verkrijgen, werden emissiefilter golflengte tussen 500 tot 580 nm gebruikt bak 16 Zoektijden van 3-4 min per filter om de signaal-ruisverhouding te maximaliseren. Als onderdeel van deze afbeelding acquisitie-sequentie werd een gestructureerd licht beeld verkregen tot een hoogte kaart te definiëren. Deze kaart werd ingevoerd diffuus licht beeldvorming tomografie (DLIT) reconstructies algoritmen die zijn gebruikt om een 3D optische afbeelding met behulp van een niet-negatief kleinste kwadraten optimalisatie 2 te vormen.
- Afbeelding Analyse: Regio's van belang werden geïdentificeerd en gekwantificeerd met behulp van Living Image software (Remklauw).
5. VertegenwoordigerResultaten
In deze studie, de niet-pathogene commensale bacteriën E.coli K-12 expressie MG1655 de luxABCDE operon was IV toegediend aan muizen die sc 4T1 xenograft tumoren. Bacteriële lux signaal werd specifiek gedetecteerd in tumoren van muizen na IV-toediening (figuur 2). Cultuur recovery van bacteriën bij muizen monster bevestigt het bestaan van een lineair verband tussen levensvatbare bacteriële aantallen en de hoeveelheid gedetecteerde licht (Figuur 3). In vivo beeldvorming van oraal toegediende commensale bacteriën in de GIT wordt ook bereikt met 3D BLI.
Figuur 1. Protocol tijdlijn. Subcutane tumoren worden geïnduceerd in muizen, en bacteriën toegediend op tumorontwikkeling (100 mm 3). Levende muizen zijn BLI imjaar op verschillende tijdstippen na bacteriële administratie (pijlen weer typisch keer).
Figuur 2. Toediening van E. coli MG1655 luxABCDE aan tumor dragende muizen. Subcutane tumoren werden geïnduceerd 4T1 MF1 in nu / nu muizen en E. coli MG1655 luxABCDE toegediend bij de ontwikkeling van tumoren. Elk dier ontving 10 6 cellen direct geïnjecteerd in de laterale staartader. Muizen werden afgebeeld op vier tijdstippen tijdens de studie (zwarte stippen z-as en beelden) gevolgd herstel van levensvatbare bacteriën (cfu) van tumoren van muizen opgeofferd monster (staafdiagram). Verhoging van de hoeveelheid bacteriën en plasmide genexpressie in het bijzonder in tumoren waargenomen na verloop van tijd (vertegenwoordiger muis geïllustreerd per tijdstip). Klik hier om een grotere afbeelding te bekijken .
Figuur 3. Relatie tussen intratumorale Bacteriële Numeri en bioluminescentie. Levensvatbare bacteriën in tumoren werden opgesomd door ex vivo bacteriecultuur van tumoren na BLI op verschillende tijdstippen na intraveneuze toediening. Log waarden van de bacteriële aantallen (cfu) ten opzichte van in vivo bioluminesce eenheden opgenomen. Een sterk verband tussen bacteriële tellingen en bacteriële bioluminescentie signalen waargenomen R 2 = 0,9717 1.
Figuur 4. 3D IVIS Afbeelding Van Murine Maagdarmkanaal gekoloniseerd door E. coli MG1655. GIT De muizen gekoloniseerd door orale toediening van 10 9 cfu van E. coli gedurende drie opeenvolgende dagen. Een voorbeeld van een geïsoleerd beeld van 3D tomografie van de gekoloniseerde muis wordt weergegeven.3D-beelden tonen een digitale muis atlas van het skelet aan anatomische registratie. E. coli MG1655 bioluminescentie in groen zichtbaar bij lagere en paars op hogere niveaus.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
In de context van gentherapie, is het gebruik van biologische agentia voor de levering van therapeutische genen aan patiënten grote belofte 3-5. Zoals virussen, de aangeboren biologische eigenschappen van bacteriën mogelijk efficiënte DNA afgifte aan cellen of weefsels, met name in de context van kanker. Aangetoond is dat bacteriën van nature kunnen homing tumoren bij systemische toediening resulteert in hoge niveaus van replicatie lokaal of buiten (niet-invasieve soorten) of binnen tumorcellen (pathogenen). Kankerspecifieke bacteriële replicatie aanvankelijk toegeschreven aan de hypoxische aard van vaste tumoren (laag O 2 niveaus), de anaërobe aard van hypoxische / necrotische gebieden in tumoren bevorderen van groei van anaerobe en facultatief anaerobe bacteriën. Meer recentelijk zijn factoren zoals de onregelmatige, lekkende bloedtoevoer en lokale immuunsuppressie in tumoren voorgesteld een rol spelen. De meeste preklinische studies hebben gebruikt xenograft tumormodellen bacteriële vector tumor kolonisatie onderzoeken. Muismodellen van spontaan ontstaan tumoren lijken klinische werkelijkheid in termen van vasculatuur (een mogelijk variabele in bacteriële kolonisatie van tumoren) en bacteriën hebben ook aangetoond dat dergelijke modellen koloniseren 6. Verschillende preklinische en klinische studies hebben aangetoond het vermogen van verschillende bacteriestammen te transporteren en te versterken genen die coderen factoren zoals prodrug-omzettende enzymen, toxinen, angiogeneseremmers en cytokinen bijzonder binnen 4,7 tumoren. Hoewel bacteriële kolonisatie tumor is aangetoond onafhankelijk van bacteriële stam en tumor type 6, kan de keuze van stam optimaal voor een bepaald model variëren - bijvoorbeeld strikte anaërobe geschikter zijn voor grote necrotische tumoren.
Wij hebben een aantal stammen van de luxABCDE cassette drukken 1,8-11. Het protocol beschreven in de videoanimatie maakt gebruik van lux-gelabelde E. coli als voorbeeld. E. coli behoort tot de flora van de menselijke GIT. Verschillende studies hebben reeds de veiligheid van IV toediening van niet-pathogene E. coli stammen muizen en hun vermogen om specifiek binnen tumoren groeien 4,12. E. coli MG1655 (zoals gebruikt in deze studie) koloniseert ook de muis GIT een hoog niveau 13.
De studie van bacteriën in kleine diermodellen is van groot belang voor verschillende medische onderzoeksgebieden; waaronder infectieziekten, darmgezondheid en gentherapie. Bijvoorbeeld aanpassingen van dit protocol kan worden toegepast op studies van bacteriële infectie tracking, hebben biofilmvorming enz. Andere genen gebaseerde reportersystemen ook onderzocht, waaronder Positron Emissie Topografie (PET) scan in combinatie met bacteriële expressie van thymidine kinase (tk ), zowel endogene expressie in E. coli of S. Typhimurium engineered de tk gen expressie van Herpes Simplex Virus (HSVtk) 14. Beide TL (Green Fluorescent Protein en haar varianten) en lichtgevende (lux) genen zijn beschikbaar voor bacteriën. Een voordeel van bacteriële luciferase dat de lux cassette de enzymen die nodig zijn voor biosynthese codeert substraat, waardoor een direct imagable middel 15. BLI is gebaseerd op de detectie van bioluminescente licht van het voorwerp door gebruik van een gekoelde Charged Coupled Device (CCD) camera. De relatief eenvoudige instrumentatie en gebrek aan vereiste radioactiviteit stelt de technologie goed binnen het bereik van de gemiddelde laboratorium. BLI toont vele voordelen ten opzichte van andere in vivo modaliteiten. Het is gemakkelijk te gebruiken, goedkoop, snel en maakt beeldvorming van meerdere dieren tegelijk produceren weinig achtergrond met hoge gevoeligheid.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Geen belangenconflicten verklaard.
Acknowledgments
De auteurs willen ondersteunen die relevant zijn voor dit manuscript erkennen van de Europese Commissie zevende kaderprogramma (PIOF-GA-2009 tot 255.466 duizend) en de Ierse Health Research Board (HRA_POR/2010/138). Lux-gelabelde E. coli was een vriendelijke gift van Dr Cormac Gahan, University College Cork.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 4T1 cell line | ATCC | CRL-2539 | Syngeneic breast cancer model derived from a spontaneously arising BALB/c mammary tumor |
| DMEM | Sigma-Aldrich | D6429 | Dulbecco's Modified Eagle's Medium |
| PBS | Sigma-Aldrich | D8537 | Phosphate Buffered Saline |
| Xenogen IVIS | Caliper Life Sciences | IVIS 100 for 2D imaging; IVIS Spectrum for 3D. | |
| Luria Broth Miller (LB) | Sigma-Aldrich | L2542 | Growth medium for E. coli |
| Erythromycin | Sigma-Aldrich | E5389 | Antibiotic |
| Streptomycin | Sigma-Aldrich | S9137 | Antibiotic |
| MF1nu/nu mice | Harlan (UK) | 069(nu)/070(nu/+) | Hsd:Athymic Nude-Foxn1nu |
| Balb/c mice | Harlan (UK) | 066 | Haplotype:H-2d |
| Gavage needle | Vet-tech Solutions (UK) | DE009 | 22G x 38mm straight gavage needle |
| Syringe for IV injection | BD BioSciences | 309309 - 1 ml | Insulin syringe with 28 G x ½ inch micro-fine IV needle. |
| Syringe for tumor inoculation | Braun | 9161376V | Omnifix 26 G x ½ inch needle |
References
- Cronin, M., et al. High resolution in vivo bioluminescent imaging for the study of bacterial tumour targeting. PLoS One. 7, e30940 (2012).
- Kuo, C., Coquoz, O., Troy, T. L., Xu, H., Rice, B. W. Three-dimensional reconstruction of in vivo bioluminescent sources based on multispectral imaging. J. Biomed. Opt. 12, 024007 (2007).
- Tangney, M., Ahmad, S., Collins, S. A., O'Sullivan, G. C. Gene therapy for prostate cancer. Postgrad Med. 122, 166-180 (2010).
- Morrissey, D., O'Sullivan, G. C., Tangney, M. Tumour targeting with systemically administered bacteria. Curr. Gene Ther. 10, 3-14 (2010).
- Collins, S. A., et al. Viral vectors in cancer immunotherapy: which vector for which strategy. Curr. Gene Ther. 8, 66-78 (2008).
- Yu, Y. A., Zhang, Q., Szalay, A. A. Establishment and characterization of conditions required for tumor colonization by intravenously delivered bacteria. Biotechnol. Bioeng. 100, 567-578 (2008).
- Baban, C. K., Cronin, M., O'Hanlon, D., O'Sullivan, G. C., Tangney, M. Bacteria as vectors for gene therapy of cancer. Bioeng. Bugs. 1, 385-394 (2010).
- Cronin, M., et al. Orally administered bifidobacteria as vehicles for delivery of agents to systemic tumors. Mol. Ther. 18, 1397-1407 (2010).
- van Pijkeren, J. P., et al. A novel Listeria monocytogenes-based DNA delivery system for cancer gene therapy. Hum. Gene Ther. 21, 405-416 (2010).
- Ahmad, S., et al. Induction of effective antitumor response after mucosal bacterial vector mediated DNA vaccination with endogenous prostate cancer specific antigen. J. Urol. 186, 687-693 (2011).
- Riedel, C. U., et al. Improved luciferase tagging system for Listeria monocytogenes allows real-time monitoring in vivo and in vitro. Appl Environ Microbiol. 73, 3091-3094 (2007).
- Cheng, C. M., et al. Tumor-targeting prodrug-activating bacteria for cancer therapy. Cancer Gene Ther. 15, 393-401 (2008).
- Foucault, M. L., Thomas, L., Goussard, S., Branchini, B. R., Grillot-Courvalin, C. In vivo bioluminescence imaging for the study of intestinal colonization by Escherichia coli in mice. Appl. Environ. Microbiol. 76, 264-274 (2010).
- Collins, S. A., Hiraoka, K., Inagaki, A., Kasahara, N., Tangney, M. PET Imaging For Gene & Cell Therapy. Curr. Gene Ther. , (2012).
- Tangney, M., Francis, K. P. In vivo Optical Imaging in Gene & Cell Therapy. Curr. Gene Ther. , (2012).
