Summary
이 문서의 관리에 대해 설명합니다
Abstract
이 동영상은 암 유전자 및 세포 치료 박테리아의 사용에 중점을두고, 라이브 쥐 세균 매매의 연구 전신 bioluminesce 이미징 (BLI)의 사용에 대해 설명합니다. 박테리아가 조직 관리에 따라 종양 내에 우선적으로 성장하는 자연 능력을 보유하고 암 치료를위한 벡터의 매력적인 클래스를 제시한다. 박테리아는 박테리아와 동시에 종양 사이트의 럭스 유전자 카세트 허가 BLI 검색을 표현하는 설계. 시간이 지남에 따라 종양 내에 위치와 박테리아의 수준은 쉽게 검토 할 수 있습니다, 2, 3 차원 시각화. 방법은 박테리아 종과 종양 이종 이식 유형의 다양한 적용됩니다. 이 문서는 피하 종양 베어링 마우스에서 발광 생물 박테리아의 분석을위한 프로토콜을 설명합니다. BLI하여 위장관 (GIT)의 공생 박테리아의 시각화도 설명되어 있습니다. 이 강력하고 저렴한, 실시간 이미징 전략 represenTS 암 특정 유전자 치료의 연구, 그리고 전염성 질병의 맥락에서 생체 내 박테리아의 연구를위한 이상적인 방법입니다. 이 동영상은 럭스 태그 E.을 공부에 대한 절차를 설명 IVIS 시스템 공간과 측두엽 판독 달성 활용 BLI을 보여주는 라이브 쥐 대장균.
Protocol
1. 종양 유도
- 일상적인 종양 유도를 들어, 혈청이없는 배지 200 μl에 떠있는 셀의 최소 tumorigenic 선량은 무료로 감염의 측면 6~8주 세 여성 Balb / C 또는 athymic MF1-nu/nu 마우스로 (SC) 피하 주입 된 N 21 게이지 주사기 바늘을 사용하여 = 6 (할렌, 옥스퍼드 셔, 영국) (1 X 10 6 4T1 세포). 혈구와 Trypan 파랑 염료 제외 (Gibco)를 사용 시각적 개수에 의해 결정으로 접종에 사용되는 세포의 생존 능력은보다 큰 95%했다.
- 종양 설립 후, 종양은 성장하고 발전 할 수 있었고, 2 회 모니터링했다. 종양 볼륨이 종양의 가장 긴 직경이며, B는 직경을에 가장 긴 직경 수직 공식 V = (AB 2) Π / 6에 따라 계산되었습니다.
2. 세균 준비
- 이 protoco에 사용 된 세균의 변형난 E.했다 대장균 K-12 MG1655, 비 단백질 독소 표현 세균에 의해 감지 할 수 있도록 그 luxABCDE 인코딩 플라스미드을 품고, 스트레인을 BLI. E. 통합 luxABCDE를 포함하는 대장균 MG1655은 37 aerobically 성장했습니다 ° LB 매체에서 C (시그마 - 알드리치, 아일랜드) 300 μg / ML 에리스로 마이신 (엠)와 보충. MG1655의 발광 생물 파생는 플라스미드 p16S 룩스 제정 P 도움말 luxABCDE 오페론 1 포함 된을 사용하여 만들어졌습니다.
- 마우스로 관리를위한 준비, 문화는 중간 로그 단계 (600 nm의에서 광학 밀도)에 200 rpm으로 흔드는에서 37 ° C에서 LB 매체에 incubated되었습니다. 박테리아는 (6,000 × g로 5 분)을 원심 분리하여 수확 PBS (시그마)로 세척하고, PBS 1 희석 된 × 10 7 식민지 형성 단위 (CFU) / IV 관리를위한 ML, 또는 gavage 1 × 10 10.
3. 세균 Administra기
- 종양 볼륨에서 약 100mm 3에 도달하면 마우스가 무작위로 실험 그룹으로 나누어되었다. 정맥 주사 관리를 들어, 절제된 마우스 각 28G 주사기 바늘을 사용하여 측면 꼬리 정맥에 직접 주입, 100 μl에 10 6 세포를 받았다. 각 inoculum의 가능한 개수는 회고 도금에 의해 결정되었다.
- GIT의 식민지 연구를 들어, 10 9 박테리아 세포는 구두 세 번 일에 gavage에 마우스 당 100 μl으로 시행되었다. 기존의 공생 박테리아 수준은 이전의 구두 gavage 1 개시 7 일 동안 마우스 식수 5 MG / ML 스트렙토 마이신의 추가에 의해 공급 이전에 감소했다.
4. BioLuminescence 영상
- 생체 BLI 영상의 2D는 IVIS100 (캘리퍼)를 사용하여 수행되었습니다. 정의 시간 포인트 후 세균 관리에서, 쥐 캘리퍼스의 XGI-8 가스 마취를 사용하여 anesthetized했다3 % Isofluorane, 그리고 전체 - 신체 이미지 분석 시스템은 고감도에서 2-5 분 동안 IVIS 100 시스템에 수행되었다.
- 3D 영상의 경우, anesthetized 마우스는 등쪽의 이미징을위한 광학 이미징 시스템 (IVIS 스펙트럼, 캘리퍼스)의 내부에 마우스 이미징 셔틀에 배치되었습니다. 3D 광학 재건을위한 세균 루시 페라 신호의 이미지를 취득하려면 500-580 nm의에 이르기까지 방출 필터 파장은 소음 비율에 신호를 극대화 할 수 필터 당 3-4 분 빈 16 수집 시간으로 사용되었습니다. 이 이미지 수집 과정의 일환으로, 구조화 된 빛이 이미지는 높이 맵을 정의하기 위해 얻은 것입니다. 이지도는 입력 확산 광 단층 촬영 영상 (DLIT) 음수가 아닌 최소 제곱 최적화 2를 사용 3D 광학 이미지를 형성하는 데 사용 된 reconstructions 알고리즘했다.
- 이미지 분석 : 관심 지역을 파악하고 생활 이미지 소프트웨어 (캘리퍼)를 사용하여 정량 하였다.
5. 대표하는결과
본 연구에서는 비 병원성 세균 공생 E.coli K-12 MG1655 luxABCDE 오페론을 표현하는 IV는 SC 4T1의 이종 이식 종양을 간직한 생쥐에 투여했다. 세균 룩스 신호는 마우스의 종양에 구체적으로 발견 된 후 IV-행정 (그림 2). 샘플 마우스에서 박테리아의 문화 복구 가능한 박테리아 숫자와 감지 빛의 양 (그림 3) 사이의 선형 관계의 존재를 확인합니다. GIT에 구두 - 관리 공생 박테리아의 생체 이미징에서 또한 3D BLI를 사용하여 달성된다.
1 그림. 프로토콜 타임 라인. 피하 종양은 마우스에서 유도하고, 박테리아는 종양 개발 (100mm 3)에 따라 관리됩니다. 라이브 쥐 BLI 인스턴트 메신저 아르여러 시간 지점 게시물 세균 관리 (화살표가 일반적인 시간을 표시)에 세.
그림 2. E.의 관리 종양 베어링 마우스에 대장균 MG1655 luxABCDE. 피하 4T1 종양은 MF1 뉴 / 뉴 마우스와 E.에서 유도 된 대장균 MG1655 luxABCDE는 종양 개발에 실시. 각 동물은 측면 꼬리 정맥에 직접 주사 10 6 세포를 받았습니다. 마우스는 샘플 희생 마우스 종양에서 가능한 박테리아의 후속 복구 (CFU)로 연구 기간 동안 4 개의 시간대 포인트 (검은 점 Z-축 및 이미지) (막대 그래프)에서 이미징되었다. 세균 번호와 특히 종양에 시간 (대표 마우스 시점에 따라 그림)을 통해 관찰 된 플라스미드 유전자 발현에 향상시킬 수 있습니다. 큰 그림을 보려면 여기를 클릭하십시오 .
그림 3. Intratumoral 세균 번호와 Bioluminescence 관계. 가능한 박테리아는 종양의는 다양한 시간 포인트 이후 IV 관리에서 BLI에 다음 종양에서 예 생체 박테리아 문화가 열거되었다. 생체 bioluminesce 단위를 기준으로 세균의 숫자 값 (CFU)를 로그하는 것은 그래프로 나타납니다. 세균 수와 세균 bioluminescence 신호 사이의 강력한 상관 관계가 관찰 R 2 = 0.9717 1.
4 그림. 손쥐 위장관의 3D IVIS 이미지 E.하여 식민지 대장균 MG1655은. 마우스의 GIT는 E.의 10 9 CFU의 구두 행정부에 의해 개척했고 세 번 일 대장균. 식민지 마우스의 3D 단층 촬영에서 샘플 격리 된 이미지가 표시됩니다.3D 이미지는 해부학 등록을 제공하는 해골의 디지털 마우스 아틀라스를 보여줍니다. E.는 대장균 MG1655 bioluminescence는 낮은에서 녹색으로 표시하고, 높은 수준의 보라색입니다.
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Discussion
유전자 치료의 맥락에서 환자에게 치료 유전자 전달을위한 생화학 제제의 사용은 큰 약속 3-5 나타났습니다. 바이러스처럼, 박테리아의 본래 생물학적 특성은 특히 암의 맥락에서, 셀이나 조직에 효율적으로 DNA 전달을 허용합니다. 그것은 박테리아가의 자연스럽게 할 수있는 것으로 표시되었습니다 체계적으로 중 외부 로컬 복제 높은 수준의 (비 침습적 종) 또는 종양 세포 (병원균)에 발생하는 종양으로 관리 들어가고. 암 특정 박테리아 복제는 초기 혐기성 및 facultatively 혐기성 균의 성장을 촉진 종양 내에서 hypoxic / 괴사 영역의 혐기성 자연과, 고체 종양의 hypoxic 성격 (낮은 O 2 층)로 표시되었습니다. 최근에는 불규칙, 새는 혈액 공급 및 종양의 현지 면역 억제 등의 요인이 역할을 제안했습니다. 대부분의 잠복기 연구 xenogr를 활용 한고물 종양 모델은 박테리아 벡터 종양의 식민지를 조사합니다. 자발적으로 발생하는 종양의 손쥐 모델은 밀접하게 vasculature (종양의 박테리아 식민지에서 잠재적 인 변수)의 관점에서 임상 현실과 유사하고, 박테리아는 또한 모델에게 6 식민지화 표시되었습니다. 다양한 잠복기 및 임상 실험은 prodrug - 변환 효소, 독소, 혈관 신생 억제제, 특히 종양 4,7 내에서 크린 시토 킨과 같은 유전자를 인코딩 요소를 운송하고 증폭하는 다른 박테리아 균의 능력을 보여 주었다. 박테리아 종양 식민지가 세균 변형 및 종양 유형 6 독립적으로 표시되어 있지만, 특정 모델에 대한 최적의 스트레인의 선택은 다를 수 있습니다 - 예를 들어 엄격한 anaerobes 대형 괴사 종양이 더 적당 할 수 있습니다.
우리는 luxABCDE 카세트에게 1,8-11을 표현하기 위해 변종의 수를 설계했습니다. 동영상에 설명 프로토콜애니메이션 룩스 태그 E.를 사용 예를 들어 같은 대장균. E. 대장균은 인간의 GIT의 식물의 일부입니다. 여러 연구 비 병원성 E.의 IV 관리의 안전을 설명했습니다 대장균 마우스로 변종이 있으며, 종양 4,12에서 구체적으로 성장할 수있는 능력. E. 대장균 MG1655은 (이 연구에 사용)도 높은 수준의 13 마우스 GIT를 colonizes.
작은 동물 모델에서 박테리아의 연구는 의료 연구 분야의 범위에 높은 중요하다, 전염성 질환, 내장 건강과 유전자 치료 포함합니다. 예를 들어,이 프로토콜의 적응 세균 감염 추적 연구에 적용 할 수 있습니다, biofilm 형성 등 다른 유전자 기반 기자 시스템은 thymidine 키나제의 세균 표현과 함께 스캔 양전자 방출 지형 (PET) (TK를 포함하여 검사 한 ), E. 속에 내생 표현 대장균이나 S. Typhimurium engineered는 헤르페스 심플 바이러스 (HSVtk) 14에서 TK 유전자를 표현합니다. 형광 (녹색 형광 단백질 및 그 변종) 및 발광 (룩스) 유전자 모두 박테리아 사용할 수 있습니다. 박테리아 루시 페라 제를 사용의 장점은 럭스 카세트가 직접 imagable 요원 15 결과, 기판 생합성에 필요한 효소를 인코딩한다는 것입니다. BLI는 냉각의 사용을 통해 대상에서 발광 생물 빛의 감지를 기반으로 결합 소자 (CCD) 카메라가 청구했습니다. 비교적 간단한 계측 및 방사능에 대한 요구 사항의 부족은 잘 평균 실험실의 범위 내에서이 기술을 넣습니다. 생체 modalities의 다른과 비교하면 BLI는 많은 혜택을 표시합니다. 그것은 사용하기 쉽고 저렴, 빠른이며, 높은 감도와 약간의 배경을 생산, 동시에 여러 동물의 이미지를 용이하게한다.
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Disclosures
관심 없음 충돌이 선언 없습니다.
Acknowledgments
저자는 유럽위원회 (European Commission) 일곱 번째 프레임 워크 프로그램 (PIOF-GA-2009-255466)와 아일랜드 보건 연구위원회 (HRA_POR/2010/138)에서이 원고에 관련된 지원을 인정하고 싶습니다. 럭스 태그 E. 대장균 박사 코르 막 Gahan, 대학 대학 코르크에서 일종의 선물이었다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 4T1 cell line | ATCC | CRL-2539 | Syngeneic breast cancer model derived from a spontaneously arising BALB/c mammary tumor |
| DMEM | Sigma-Aldrich | D6429 | Dulbecco's Modified Eagle's Medium |
| PBS | Sigma-Aldrich | D8537 | Phosphate Buffered Saline |
| Xenogen IVIS | Caliper Life Sciences | IVIS 100 for 2D imaging; IVIS Spectrum for 3D. | |
| Luria Broth Miller (LB) | Sigma-Aldrich | L2542 | Growth medium for E. coli |
| Erythromycin | Sigma-Aldrich | E5389 | Antibiotic |
| Streptomycin | Sigma-Aldrich | S9137 | Antibiotic |
| MF1nu/nu mice | Harlan (UK) | 069(nu)/070(nu/+) | Hsd:Athymic Nude-Foxn1nu |
| Balb/c mice | Harlan (UK) | 066 | Haplotype:H-2d |
| Gavage needle | Vet-tech Solutions (UK) | DE009 | 22G x 38mm straight gavage needle |
| Syringe for IV injection | BD BioSciences | 309309 - 1 ml | Insulin syringe with 28 G x ½ inch micro-fine IV needle. |
| Syringe for tumor inoculation | Braun | 9161376V | Omnifix 26 G x ½ inch needle |
References
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