Summary
Denne artikkelen beskriver administrasjon av
Abstract
Denne videoen beskriver bruken av hele kroppen bioluminesce imaging (BLI) for studiet av bakteriell handel levende mus, med vekt på bruk av bakterier i genet og celle terapi for kreft. Bakterier presentere en attraktiv klasse av vektor for kreftbehandling, som har en naturlig evne til å vokse fortrinnsvis innen svulster etter systemisk administrasjon. Bakterier konstruert for å uttrykke lux genet kassett tillatelse BLI påvisning av bakterier og samtidig tumor nettsteder. Plasseringen og nivåer av bakterier i tumorer over tid kan lett undersøkes, visualisert i to eller tre dimensjoner. Metoden er egnet for et bredt spekter av bakteriearter og tumor xenograft typer. Denne artikkelen beskriver protokollen for analyse av selvlysende bakterier i subkutane tumor bærende mus. Visualisering av commensal bakterier i mage-tarmkanalen (GIT) av BLI er også beskrevet. Denne kraftige og billige, real-time imaging strategi representanterts en ideell metode for studiet av bakterier in vivo i forbindelse med kreft forskning, spesielt genterapi og smittsomme sykdommer. Denne videoen beskriver prosedyren for å studere lux-merket E. coli i levende mus, som viser at romlig og tidsmessig avlesning oppnåelig utnytte BLI med IVIS systemet.
Protocol
1. Tumorfremkallelse
- For rutinemessig tumorfremkallelse, ble minimum svulstfremkallende dosen av celler suspendert i 200 ul serumfritt kulturmedium injisert subkutant (SC) i flanken av infeksjon gratis 6-8 uke gamle kvinnelige Balb / C eller atymiske MF1-nu/nu mus n = 6 (Harlan, Oxfordshire, UK) (1 x 10 6 4T1 celler) ved hjelp av en 21-gauge sprøytenålen. Levedyktigheten til celler brukes for inokulering var større enn 95% som bestemt ved visuell telling ved hjelp av en haemocytometer og Trypan blått fargestoff Exclusion (Gibco).
- Etter svulst etablering, ble svulster lov til å vokse og utvikle og ble overvåket to ganger ukentlig. Tumorvolum ble beregnet i henhold til formelen V = (AB 2) Π / 6, hvor a er den lengste diameter av tumoren og b er den lengste diameter vinkelrett diameter en.
2. Bakteriell Forberedelse
- Bakteriestammen brukes i denne protocoJeg var E. coli K-12 MG1655, en ikke-protein-toksin-uttrykkende stamme, skjule en luxABCDE-kodende plasmid som gjør at bakterier som skal påvises av BLI. E. coli MG1655 inneholdende integrerte luxABCDE ble dyrket aerobt ved 37 ° C i LB-medium (Sigma-Aldrich, Irland) supplert med 300 ug / ml erytromycin (Em). Bioluminescent derivat av MG1655 ble opprettet ved hjelp av plasmid p16S lux som inneholder den konstitutive P HJELP luxABCDE operon en.
- For forberedelse for administrering til mus, ble kulturer inkubert i LB medium ved 37 ° C i en rister ved 200 rpm til midt-log fase (optisk densitet ved 600 nm). Bakterier ble høstet ved sentrifugering (6000 x g i 5 min), vasket med PBS (Sigma), og fortynnet i PBS 1 × 10 7 kolonidannende enheter (cfu) / ml for intravenøs administrasjon, eller 1 x 10 10 for gavage.
3. Bakteriell Administrasjon
- Mus ble tilfeldig delt inn i eksperimentelle grupper når tumorer nådde ca 100 mm 3 i volum. For intravenøs administrering, mottok fastholdte mus hver 10 6 celler i 100 pl, injiseres direkte inn i den laterale halevenen med en 28g sprøytenålen. Den levedyktige telling av hver inokulat ble bestemt ved tilbakevirkende platekledning.
- For GIT kolonisering studiene ble 10 9 bakterieceller administreres oralt i 100 pl per mus ved gavage, på tre påfølgende dager. Eksisterende commensal bakterielle nivåer ble redusert før mating ved tilsetning av 5 mg / ml streptomycin i mus drikkevann for 7 dager før påbegynnelse av oral gavage en.
4. Bioluminescens Imaging
- 2D in vivo BLI bildebehandling ble utført ved hjelp av IVIS100 (Caliper). På definerte tid poeng etter bakteriell administrasjon, var mus bedøvet med Caliper er XGI-8 gassanestesiSystem med 3% Isofluorane og helkropps bildeanalyse ble utført i IVIS 100 systemet for 2-5 minutter ved høy sensitivitet.
- For 3D avbildning, ble bedøvet mus plassert i en mus avbildning shuttle innsiden av optiske avbildningssystem for dorsal avbildning (IVIS Spectrum, Caliper). Å skaffe bilder av den bakterielle luciferase signal for 3D optiske gjenoppbygging, ble utslipp filter bølgelengder 500-580 nm brukes med bin 16 innhentingstider på 3-4 min per filter for å maksimere signal til støyforhold. Som en del av dette bildet oppkjøpet sekvensen, ble en strukturert lys bildet innhentet for å definere en høyde kart. Dette kartet ble lagt inn diffust lys bildebehandling tomografi (DLIT) rekonstruksjoner algoritmer som ble brukt til å danne en 3D optisk bilde ved hjelp av en ikke-negativ minste kvadraters optimalisering 2.
- Bildeanalyse: Regioner av interesse ble identifisert og kvantifisert ved hjelp av levende bilde-programvare (Caliper).
5. RepresentantResultater
I denne studien, ikke-sykdomsfremkallende commensal bakterier E.coli K-12 MG1655 uttrykker luxABCDE operon var IV administrert til mus peiling sc 4T1 xenograft svulster. Bakteriell lux signal ble detektert spesifikt i tumorer av mus etter IV-administrering (figur 2). Kultur utvinning av bakterier fra sample mus validerer eksistensen av et lineært forhold mellom levedyktige kimtall og mengde av lys detektert (Figur 3). In vivo avbildning av oralt administrerte commensal bakterier i GIT er også oppnådd ved hjelp av 3D BLI.
Figur 1. Protokoll Timeline. Subkutane svulster forårsaket i mus, og bakterier administreres ved tumor utvikling (100 mm 3). Levende mus er BLI imalderen på ulike tidspunkter etter bakteriell administrasjon (piler viser typiske ganger).
Figur 2. Administrasjon av E. coli MG1655 luxABCDE til tumor bærende mus. Subkutane 4T1 svulster ble indusert i MF1 nu / nu mus og E. coli MG1655 luxABCDE administreres ved tumor utvikling. Hvert dyr mottok 10 6 celler injiseres direkte inn i den laterale halevenen. Mus ble fotografert ved fire tidspunkter under studien (svarte prikker z-aksen og bilder) med påfølgende gjenvinning av levedyktige bakterier (cfu) fra svulster i sample ofret mus (søylediagram). Økning i bakterielle tall og plasmid genekspresjon spesielt i svulster ble observert over tid (representant mus illustrert per tidspunkt). Klikk her for å se større figur .
Figur 3. Forholdet mellom intratumoral Bakterielle tall og bioluminesens. Levedyktige bakterier i svulster ble nummerert av ex vivo bakteriekultur fra svulster i etterkant BLI på ulike tidspunkter etter intravenøs administrering. Logge verdier av kimtall (cfu) i forhold til in vivo bioluminesce enheter grafisk. En robust sammenheng mellom bakterieveksten og bakterielle bioluminesens signaler er observert R 2 = 0,9717 1.
Figur 4. 3D IVIS bilde av Murine Gastrointestinal Tract kolonisert av E. coli MG1655. Den GIT av mus ble kolonisert av oral administrasjon av 10 9 cfu av E. coli i tre påfølgende dager. En prøve isolert bilde fra 3D tomografi av de koloniserte musen vises.3D-bilder viser en digital mus atlas av skjelettet for å gi anatomisk registrering. E. coli MG1655 Bioluminescens er synlig i grønt lavere, og lilla på et høyere nivå.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
I sammenheng med genterapi, har bruken av biologiske midler for levering av terapeutiske gener til pasienter vist store løftet 3-5. Som virus, det medfødte biologiske egenskapene bakterier muliggjøre effektiv DNA produksjonstid til celler eller vev, særlig i sammenheng med kreft. Det har blitt vist at bakterier er i stand til homing naturlig til svulster når systemisk administrert resulterer i høye nivåer av replikasjon lokalt, enten eksterne for (ikke-invasive arter) eller innenfor tumorceller (patogener). Kreftspesifikk bakteriell replikasjon ble opprinnelig tilskrevet hypoksisk natur av solide tumorer (lav o 2 nivåer), med den anaerobe natur hypoksiske / nekrotisk regioner i tumorer fremme vekst av anaerobe og facultatively anaerobe bakterier. Mer nylig har faktorer som uregelmessig, utett blodtilførsel og lokal immunsuppresjon i tumorer blitt foreslått å spille en rolle. Mest prekliniske studier har benyttet xenograkterut tumormodeller å undersøke bakteriell vektor svulst kolonisering. Murine modeller av spontant oppstår svulster nærmere likne klinisk virkelighet gjelder vaskulaturen (en potensiell variabel i bakteriell kolonisering av svulster) og bakterier har også vist seg å kolonisere slike modeller 6. Ulike prekliniske og kliniske forsøk har vist evne ulike bakteriestammer å transportere og forsterke gener som koder faktorer som prodrug-konverterende enzymer, toksiner, angigenesehemmere, og cytokiner spesifikt innenfor svulster 4,7. Mens bakteriell tumor kolonisering har vist seg å være uavhengig av bakteriestammen og tumor type 6, kan valg av stamme optimalt for en bestemt modell variere - f.eks strenge anaerober kan være mer egnet for store nekrotiske svulster.
Vi har utviklet en rekke stammer å uttrykke luxABCDE kassetten 1,8-11. Protokollen beskrevet i videoenanimasjon bruker lux-merket E. coli som et eksempel. E. coli er en del av floraen av den menneskelige GIT. Flere studier har skissert sikkerheten IV administrasjon av ikke-sykdomsfremkallende E. coli stammer til mus, og deres evne til å vokse spesielt innen svulster 4,12. E. coli MG1655 (som brukt i denne studien) koloniserer også musen GIT til høye nivåer 13.
Studiet av bakterier i små dyremodeller er av stor betydning for en rekke medisinske forskningsområder, inkludert smittsomme sykdommer, gut helse og genterapi. For eksempel kan tilpasninger av denne protokollen være gjeldende for studier av bakteriell infeksjon sporing, har biofilmdannelse osv. Andre gen-baserte reporter systemer også blitt undersøkt, herunder Positron Emission Topography (PET) skanning i kombinasjon med bakteriell uttrykk for tymidinkinase (tk ), det være seg endogene uttrykk i E. coli eller S. Typhimurium engineered å uttrykke tk genet fra Herpes simplex virus (HSVtk) 14. Både fluoriserende (grønt fluorescerende protein og dets varianter) og selvlysende (lux) gener er tilgjengelig for bakterier. En fordel med å bruke bakteriell luciferase er at LUX kassetten koder enzymer som er nødvendige for substrat biosyntese, som resulterer i en direkte imagable middel 15. BLI er basert på deteksjon av bioluminescent lys fra emnet ved bruk av en avkjølt Charged Coupled Device (CCD)-kamera. Den relativt enkel instrumentering og mangel på krav til radioaktivitet setter teknologien godt innenfor rekkevidden av den gjennomsnittlige laboratoriet. BLI viser mange fordeler sammenlignet med andre in vivo modaliteter. Det er lett å bruke, billig, rask og letter avbildning av flere dyr samtidig, produserer lite bakgrunn med høy følsomhet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Ingen interessekonflikter erklært.
Acknowledgments
Forfatterne ønsker å erkjenne støtte relevant for dette manuskriptet fra EU-kommisjonen sjuende rammeprogram (PIOF-GA-2009-255466) og den irske Health Research Board (HRA_POR/2010/138). Lux-merket E. coli var en slags gave fra Dr. Cormac Gahan, University College Cork.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 4T1 cell line | ATCC | CRL-2539 | Syngeneic breast cancer model derived from a spontaneously arising BALB/c mammary tumor |
| DMEM | Sigma-Aldrich | D6429 | Dulbecco's Modified Eagle's Medium |
| PBS | Sigma-Aldrich | D8537 | Phosphate Buffered Saline |
| Xenogen IVIS | Caliper Life Sciences | IVIS 100 for 2D imaging; IVIS Spectrum for 3D. | |
| Luria Broth Miller (LB) | Sigma-Aldrich | L2542 | Growth medium for E. coli |
| Erythromycin | Sigma-Aldrich | E5389 | Antibiotic |
| Streptomycin | Sigma-Aldrich | S9137 | Antibiotic |
| MF1nu/nu mice | Harlan (UK) | 069(nu)/070(nu/+) | Hsd:Athymic Nude-Foxn1nu |
| Balb/c mice | Harlan (UK) | 066 | Haplotype:H-2d |
| Gavage needle | Vet-tech Solutions (UK) | DE009 | 22G x 38mm straight gavage needle |
| Syringe for IV injection | BD BioSciences | 309309 - 1 ml | Insulin syringe with 28 G x ½ inch micro-fine IV needle. |
| Syringe for tumor inoculation | Braun | 9161376V | Omnifix 26 G x ½ inch needle |
References
- Cronin, M., et al. High resolution in vivo bioluminescent imaging for the study of bacterial tumour targeting. PLoS One. 7, e30940 (2012).
- Kuo, C., Coquoz, O., Troy, T. L., Xu, H., Rice, B. W. Three-dimensional reconstruction of in vivo bioluminescent sources based on multispectral imaging. J. Biomed. Opt. 12, 024007 (2007).
- Tangney, M., Ahmad, S., Collins, S. A., O'Sullivan, G. C. Gene therapy for prostate cancer. Postgrad Med. 122, 166-180 (2010).
- Morrissey, D., O'Sullivan, G. C., Tangney, M. Tumour targeting with systemically administered bacteria. Curr. Gene Ther. 10, 3-14 (2010).
- Collins, S. A., et al. Viral vectors in cancer immunotherapy: which vector for which strategy. Curr. Gene Ther. 8, 66-78 (2008).
- Yu, Y. A., Zhang, Q., Szalay, A. A. Establishment and characterization of conditions required for tumor colonization by intravenously delivered bacteria. Biotechnol. Bioeng. 100, 567-578 (2008).
- Baban, C. K., Cronin, M., O'Hanlon, D., O'Sullivan, G. C., Tangney, M. Bacteria as vectors for gene therapy of cancer. Bioeng. Bugs. 1, 385-394 (2010).
- Cronin, M., et al. Orally administered bifidobacteria as vehicles for delivery of agents to systemic tumors. Mol. Ther. 18, 1397-1407 (2010).
- van Pijkeren, J. P., et al. A novel Listeria monocytogenes-based DNA delivery system for cancer gene therapy. Hum. Gene Ther. 21, 405-416 (2010).
- Ahmad, S., et al. Induction of effective antitumor response after mucosal bacterial vector mediated DNA vaccination with endogenous prostate cancer specific antigen. J. Urol. 186, 687-693 (2011).
- Riedel, C. U., et al. Improved luciferase tagging system for Listeria monocytogenes allows real-time monitoring in vivo and in vitro. Appl Environ Microbiol. 73, 3091-3094 (2007).
- Cheng, C. M., et al. Tumor-targeting prodrug-activating bacteria for cancer therapy. Cancer Gene Ther. 15, 393-401 (2008).
- Foucault, M. L., Thomas, L., Goussard, S., Branchini, B. R., Grillot-Courvalin, C. In vivo bioluminescence imaging for the study of intestinal colonization by Escherichia coli in mice. Appl. Environ. Microbiol. 76, 264-274 (2010).
- Collins, S. A., Hiraoka, K., Inagaki, A., Kasahara, N., Tangney, M. PET Imaging For Gene & Cell Therapy. Curr. Gene Ther. , (2012).
- Tangney, M., Francis, K. P. In vivo Optical Imaging in Gene & Cell Therapy. Curr. Gene Ther. , (2012).
