Summary
Este artigo descreve a administração de
Abstract
Este vídeo descreve o uso de todo o corpo bioluminesce imaging (BLI) para o estudo de tráfico bacteriana em ratos vivos, com ênfase no uso de bactérias na terapia génica e celular para o cancro. As bactérias presentes uma classe atraente de vetor para terapia de câncer, possuindo uma capacidade natural de crescer preferencialmente dentro de tumores após a administração sistêmica. As bactérias manipuladas para expressar o gene lux cassete autorização BLI detecção das bactérias e simultaneamente locais tumorais. A localização e níveis de bactérias ao longo do tempo dentro de tumores pode ser facilmente examinado, visualizado em duas ou três dimensões. O método é aplicável a uma ampla variedade de espécies bacterianas e tipos de xenoenxertos de tumor. Este artigo descreve o protocolo para a análise de bactérias bioluminescentes dentro ratinhos portadores de tumores subcutâneos. A visualização das bactérias comensais no tracto gastrointestinal (TGI) por BLI é também descrito. Este poderoso e barato, em tempo real representação estratégia de imagemts um método ideal para o estudo da bactéria in vivo no contexto da pesquisa de cancro, em particular, a terapia génica, e doenças infecciosas. Este vídeo descreve o procedimento para estudar lux-marcado E. coli em murganhos vivos, demonstrando a leitura espacial e temporal BLI alcançável utilizando o sistema IVIS.
Protocol
1. Indução de tumores
- Para a indução do tumor de rotina, a dose tumorigénica mínima de células em suspensão em 200 uL de meio isento de soro da cultura foi injectado por via subcutânea (sc) no flanco de infecção livre 6-8 semanas de idade, ratinhos fêmea Balb / C ou atímicos MF1-nu/nu n = 6 (Harlan, Oxfordshire, Reino Unido) (1 x 10 6 células 4T1), utilizando uma agulha de seringa de calibre 21. A viabilidade de células utilizadas para inoculação foi superior a 95%, tal como determinado por contagem visual utilizando um hemocitómetro e Exclusão Trypan Blue Dye (Gibco).
- Seguindo estabelecimento do tumor, os tumores foram deixados crescer e desenvolver e foram monitorados duas vezes por semana. O volume do tumor foi calculado de acordo com a fórmula V = (ab 2) Π / 6, em que a é o diâmetro maior do tumor e b é o maior diâmetro perpendicular ao diâmetro a.
2. Preparação bacteriana
- A estirpe bacteriana utilizada neste protocoEu era E. coli K-12 MG1655, um não-proteína toxina que expressam, estirpe portadora de um plasmídeo que codifica luxABCDE que permite que as bactérias a ser detectada pelo BLI. E. coli MG1655 contendo o luxABCDE integrado foi cultivada aerobicamente a 37 ° C em meio LB (Sigma-Aldrich, Irlanda) suplementado com 300 ug / ml de eritromicina (Em). O derivado de bioluminescente MG1655 foi criada usando o plasmídeo p16S lux que contém a P AJUDA constitutiva luxABCDE operon 1.
- Para a preparação para a administração a ratinhos, as culturas foram incubadas em meio LB a 37 ° C num agitador a 200 rpm a mid-log de fase (densidade óptica a 600 nm). As bactérias foram colhidas por centrifugação (6000 xg durante 5 min), lavadas com PBS (Sigma), diluído em PBS e 1 x 10 7 unidades formadoras de colónias (ufc) / ml para administração IV, ou 1 x 10 10 por meio de sonda.
3. Administração bacterianação
- Os ratos foram aleatoriamente divididos em grupos experimentais quando os tumores atingiram cerca de 100 mm 3 em volume. Para administração intravenosa, os ratos receberam cada conteve 10 6 células em 100 uL, injectado directamente para dentro da veia lateral da cauda utilizando uma agulha de seringa de 28G. A contagem de viáveis de cada inoculo foi determinada por plaqueamento retrospectiva.
- Para os estudos de colonização GIT, 10 9 células bacterianas foram administradas oralmente em 100 ul por rato por gavagem, em três dias consecutivos. Pré-existentes comensais níveis bacterianos foram reduzidos, antes da alimentação, por adição de 5 mg de estreptomicina / ml, em água potável rato durante 7 dias antes do início de uma sonda oral.
4. Imagem de bioluminescência
- 2D in vivo BLI imagem foi realizado usando o IVIS100 (Caliper). No tempo definido após a administração pontos bacteriana, os ratos foram anestesiados usando XGI-8 Caliper Anestesia GasSistema com Isofluorano 3%, e em todo o corpo a análise de imagens foi realizada nos 100 IVIS sistema para 2-5 min com uma sensibilidade elevada.
- Para imagens em 3D, os ratos anestesiados foram colocados em um ônibus de imagem do rato dentro do sistema de imagem óptico para imagens dorsal (IVIS Spectrum, Caliper). Para a aquisição de imagens do sinal de luciferase bacteriana para a reconstrução 3D óptica, comprimentos de onda de emissão de filtro que variam 500-580 nm foram utilizados com caixa 16 tempos de aquisição de 3-4 min por filtro para maximizar a relação sinal-ruído. Como parte desta sequência de aquisição de imagem, uma imagem de luz estruturada foi obtida para definir um mapa de altura. Este mapa foi difuso de luz de entrada de imagem de tomografia (DLIT) reconstruções algoritmos que foram utilizados para formar uma imagem 3D óptico usando um não-negativo, pelo menos optimização quadrados 2.
- Análise de Imagem: Regiões de interesse foram identificados e quantificados utilizando software imagem viva (Caliper).
5. RepresentanteResultados
Neste estudo, as bactérias não patogénicas de E. coli comensal K-12 MG1655 expressando o operão luxABCDE IV foi administrada a ratos portadores de tumores de xenoenxerto sc 4T1. Bacterial lux sinal foi detectado especificamente em tumores de ratos pós-administração IV (Figura 2). Recuperação da cultura de bactérias a partir de ratinhos de amostra valida a existência de uma relação linear entre o número de bactérias viáveis bem como a quantidade de luz detectada (Figura 3). In vivo imaging-administrados por via oral de bactérias comensais na GIT é também conseguida utilizando 3D BLI.
Figura 1. Protocolo Timeline. Tumores subcutâneos são induzidas em ratos, e as bactérias administrado mediante o desenvolvimento de tumores (100 mm 3). Camundongos vivos são BLI imenvelhecido a administração pós vários pontos temporais bacteriana (setas exibir vezes típicas).
Figura 2. A administração de E. luxABCDE coli MG1655 a ratinhos portadores de tumor. tumores subcutâneos 4T1 foram induzidos em MF1 nu / nu e E. luxABCDE coli MG1655 administrado mediante o desenvolvimento de tumores. Cada animal recebeu 10 6 células injectadas directamente na veia lateral da cauda. Ratos foram fotografadas em quatro momentos durante o estudo (pontos pretos eixo z e imagens) com subsequente recuperação de células viáveis (cfu) de tumores de ratinhos sacrificados amostra (gráfico de barras). Aumento no número de bactérias e expressão gênica plasmídeo especificamente nos tumores foi observada ao longo do tempo (mouse representante ilustrado por ponto de tempo). Clique aqui para ver maior figura .
Figura 3. Relação entre intratumoral Números bacteriana e Bioluminescência. Bactérias viáveis em tumores foram enumerados pelo ex vivo cultura bacteriana de tumores após a BLI em vários pontos temporais pós administração IV. Os valores de log de números bacterianas (cfu) em relação a unidades vivo bioluminesce estão representados graficamente. Uma correlação estreita entre as contagens bacterianas e sinais de bioluminescência é observada R 2 = 0,9717 1.
Figura 4. Imagem 3D IVIS do trato gastrointestinal Murino colonizada por E. coli MG1655. O GIT de ratinhos foi colonizada por administração oral de 10 9 CFU de E. coli durante três dias consecutivos. A imagem de amostra isolada de tomografia 3D do mouse colonizado é mostrado.Imagens em 3D mostram um atlas do mouse digital do esqueleto para fornecer registro anatômico. E. bioluminescência coli MG1655 é visível em verde na inferior, e roxo em níveis mais elevados.
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Discussion
No contexto da terapia genética, o uso de agentes biológicos para a entrega de genes terapêuticos para pacientes mostrou uma grande promessa 3-5. Como vírus, as propriedades biológicas de bactérias inatas permitir a entrega eficiente do ADN a células ou tecidos, em particular no contexto do cancro. Tem sido demonstrado que as bactérias são naturalmente capazes de homing para tumores quando administrados sistemicamente, resultando em níveis elevados de replicação localmente, quer externas (para não-invasivos espécie) ou no interior das células tumorais (patógenos). Câncer específico de replicação bacteriana foi inicialmente atribuído à natureza hipóxica dos tumores sólidos (baixos níveis de O 2), com a natureza anaeróbia de regiões hipóxicas / necrose nos tumores que promovem o crescimento de bactérias anaeróbicas e anaeróbios facultativos. Mais recentemente, os factores, tais como o fornecimento de sangue irregular, permeável e a supressão imunitária local nos tumores têm sido propostas para desempenhar um papel. A maioria dos estudos pré-clínicos utilizaram xenograft modelos de tumor para investigar a colonização bacteriana tumor vector. Modelos murinos de tumores que surgem espontaneamente mais se assemelham a realidade clínica em termos de vasculatura (um potencial variável de colonização bacteriana de tumores), e as bactérias têm também demonstrado que tais modelos colonizar 6. Vários estudos pré-clínicos e clínicos têm demonstrado a capacidade de diferentes estirpes de bactérias para o transporte e amplificar os genes que codificam factores, tais como pró-fármaco de conversão de enzimas, toxinas, inibidores de angiogénese, e de citoquinas, especificamente em tumores 4,7. Embora a colonização bacteriana tumor tem sido mostrado para ser independente da estirpe bacteriana e do tipo de tumor 6, a escolha da estirpe óptima para um determinado modelo pode variar - por exemplo, anaeróbios estritos podem ser mais adequados para grandes tumores necróticos.
Temos concebido um certo número de estirpes para expressar o cassete luxABCDE 1,8-11. O protocolo apresentado no vídeoanimação usa lux-marcado E. coli como um exemplo. E. coli faz parte da flora do GIT humana. Vários estudos têm descrito a segurança de administração IV de não-patogênico E. coli para ratos, e sua capacidade de crescer dentro de tumores especificamente 4,12. E. coli MG1655 (tal como utilizado no presente estudo) também coloniza o GIT rato para níveis elevados 13.
O estudo de bactérias em modelos animais de pequeno porte é de grande importância para uma série de campos de pesquisa médica, incluindo doenças infecciosas, saúde intestinal e terapia gênica. Por exemplo, adaptações deste protocolo pode ser aplicado a estudos de acompanhamento de infecção bacteriana, de formação de biofilme, etc Outros genes baseados em sistemas de repórter também foram examinadas, incluindo Topografia de Emissão de Positrões (PET) de digitalização, em combinação com a expressão bacteriana de timidina-quinase (tk ), seja a expressão endógena de E. coli ou S. Typhimurium engineered para expressar o gene tk do vírus Herpes Simplex (HSVtk) 14. Ambos fluorescente (Green Fluorescent Protein e suas variantes) e luminescentes (lux) genes estão disponíveis para as bactérias. Uma vantagem de utilizar a luciferase bacteriana é a de que a cassete de lux codifica as enzimas necessárias para a biosíntese do substrato, resultando em um agente directamente imagable 15. BLI é baseado na detecção de luz bioluminescente do sujeito através da utilização de um dispositivo de acoplamento por carga refrigerado câmara (CCD). A instrumentação relativamente simples e à falta de necessidade de radioactividade coloca a tecnologia bem dentro do alcance do laboratório média. BLI apresenta muitas vantagens quando comparado com o outro em modalidades in vivo. É fácil de utilizar, de baixo custo, rápida e facilita imagiologia de animais simultaneamente, produzindo pouco fundo com alta sensibilidade.
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Disclosures
Não há conflitos de interesse declarados.
Acknowledgments
Os autores gostariam de agradecer o apoio relevante para este manuscrito da Comissão Europeia Sétimo Programa-Quadro (PIOF-GA-2009-255466) e do Conselho de Pesquisa irlandês Saúde (HRA_POR/2010/138). Lux-marcado E. coli foi um presente tipo de Dr. Cormac Gahan, Universidade College Cork.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 4T1 cell line | ATCC | CRL-2539 | Syngeneic breast cancer model derived from a spontaneously arising BALB/c mammary tumor |
| DMEM | Sigma-Aldrich | D6429 | Dulbecco's Modified Eagle's Medium |
| PBS | Sigma-Aldrich | D8537 | Phosphate Buffered Saline |
| Xenogen IVIS | Caliper Life Sciences | IVIS 100 for 2D imaging; IVIS Spectrum for 3D. | |
| Luria Broth Miller (LB) | Sigma-Aldrich | L2542 | Growth medium for E. coli |
| Erythromycin | Sigma-Aldrich | E5389 | Antibiotic |
| Streptomycin | Sigma-Aldrich | S9137 | Antibiotic |
| MF1nu/nu mice | Harlan (UK) | 069(nu)/070(nu/+) | Hsd:Athymic Nude-Foxn1nu |
| Balb/c mice | Harlan (UK) | 066 | Haplotype:H-2d |
| Gavage needle | Vet-tech Solutions (UK) | DE009 | 22G x 38mm straight gavage needle |
| Syringe for IV injection | BD BioSciences | 309309 - 1 ml | Insulin syringe with 28 G x ½ inch micro-fine IV needle. |
| Syringe for tumor inoculation | Braun | 9161376V | Omnifix 26 G x ½ inch needle |
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