Summary
В этой статье описывается управление
Abstract
Это видео описывает использование всего тела bioluminesce томография (BLI) для изучения бактериальных торговле живыми мышами, с акцентом на использовании бактерий в генной и клеточной терапии рака. Бактерии, присутствующие привлекательной класс вектор для лечения рака, обладающие природной способностью расти преимущественно в опухоли после системного введения. Бактерии инженерии, чтобы выразить кассеты люкс гена разрешения BLI обнаружения бактерий и одновременно опухоли сайтов. Расположение и уровень бактерий в опухоли с течением времени могут быть легко рассмотрены, визуализировали в двух или трех измерениях. Метод применим для широкого спектра бактериальных видов и типов опухолей ксенотрансплантата. В данной статье описывается протокол для анализа биолюминесцентного бактерий в подкожной опухоли мышей подшипника. Визуализация синантропных бактерий в желудочно-кишечном тракте (ЖКТ) от BLI также описан. Это мощный и дешевый, изображений в реальном времени стратегия предTS идеальный метод для изучения бактерий в естественных условиях в контексте исследования рака, в частности генной терапии и инфекционных заболеваний. Это видео описывает процедуру для изучения люкс с метками E. палочки в живых мышей, что свидетельствует о пространственной и временной отсчет достижимо использованием BLI с системой ИВИС.
Protocol
1. Опухоль индукционные
- Для обычных индукции опухоли, минимальная доза онкогенных клеток суспендируют в 200 мкл бессывороточной культуральной среде вводили подкожно (п) во фланг инфекцию бесплатный 6-8 недельных самок BALB / C или бестимусным MF1-nu/nu мышей п = 6 (Harlan, Оксфордшир, Великобритания) (1 х 10 6 клеток 4T1) с использованием 21-калибровочного иглы шприца. Жизнеспособность клеток, используемых для посева было больше, чем на 95%, как это определено количество визуальных использованием гемоцитометра и Трипановый Синяя краска исключения (Gibco).
- После создания опухоли, опухоли было позволено расти и развиваться и наблюдали дважды в неделю. Объем опухоли вычисляли по формуле V = (AB 2) Π / 6, где находится самый большой диаметр опухоли и B является самой длинной диаметра, перпендикулярного диаметра.
2. Бактериального препарата
- Бактериальный штамм, используемый в этом protocoЯ был E. соН К-12 MG1655, небелковой-токсин, экспрессирующих штамм, укрывательство luxABCDE кодирования плазмиды, которая позволяет бактериям быть обнаружены BLI. E. палочки MG1655 содержащие интегрированный luxABCDE был выращен в аэробных условиях при 37 ° С в среде LB (Sigma-Aldrich, Ирландия) с добавлением 300 мкг / мл эритромицина (Em). Биолюминесцентного производной MG1655 был создан с помощью плазмиды p16S люкс, который содержит учредительные HELP P luxABCDE оперона 1.
- Для подготовки введения мышам, культуры инкубировали в среде LB при 37 ° C в шейкере со скоростью 200 оборотов в минуту до середины логарифмической фазы (оптической плотности при 600 нм). Бактерии собирают центрифугированием (6000 х г в течение 5 мин), промывают PBS (Sigma), и разводят в PBS 1 × 10 7 колониеобразующих единиц (КОЕ) / мл для внутривенного введения, или 1 х 10 10 для принудительного кормления.
3. Бактериальные администрацииния
- Мыши были произвольно разделены на экспериментальные группы, когда опухоль достигает примерно 100 мм 3 объема. Для внутривенного введения, сдержанный мышей каждый получил 10 6 клеток в 100 мкл, вводится непосредственно в латеральную хвостовую вену помощью 28G иглу шприца. Количество жизнеспособных каждой посевной определяется ретроспективным покрытием.
- Для исследования желудочно-кишечного тракта колонизации, 10 9 бактериальных клеток вводили перорально в 100 мкл на мышь через желудочный зонд, три дня подряд. Ранее существовавшие комменсальной бактериальной уровни снизились до подачи добавлением 5 мг / мл стрептомицина в мышь питьевой воды в течение 7 дней до начала желудочный зонд 1.
4. Биолюминесценции изображений
- 2D в естественных условиях BLI изображений проводили с использованием IVIS100 (суппорт). В определенных временных точках сообщение бактериальной администрации, мышей анестезировали использованием XGI-8 суппорт газа анестезииСистема с 3% Isofluorane, и все тело изображение анализ был проведен в ИВИС 100 система в течение 2-5 мин при высокой чувствительности.
- Для визуализации 3D, анестезированных мышей были помещены в трансфера мыши изображений внутри оптической системы визуализации для спины томография (ИВИС Spectrum, суппорт). Для получения изображения бактериальной люциферазы сигнала для 3D-оптических реконструкции, фильтр твердых диапазоне длин волн 500-580 нм были использованы с бен приобретение 16 раз по 3-4 мин на фильтр, чтобы максимизировать отношение сигнал-шум. В рамках этой последовательности захвата изображений, структурированные изображения света было получено для определения высоты карте. Эта карта была введена рассеянный свет томографии (DLIT) реконструкций алгоритмов, которые были использованы для формирования 3D-изображения с помощью оптического неотрицательных наименьших квадратов оптимизации 2.
- Анализ изображений: Регионы интересов были определены и количественно, используя программное обеспечение Живые изображения (суппорт).
5. ПредставительРезультаты
В этом исследовании, непатогенные синантропных бактерий E.coli K-12 MG1655 выражения luxABCDE оперона была IV вводили мышам подкожно опухолями 4T1 ксенотрансплантата. Бактериальные люкс сигнал был обнаружен в частности, в опухоли мышей сообщению IV-администрирования (рис. 2). Культура восстановления бактерий из образцов мышей подтверждает существование линейной зависимости между жизнеспособных бактерий номера и количество света обнаружено (рис. 3). В естественных изображений перорального синантропных бактерий в ЖКТ достигается также с помощью 3D BLI.
Рисунок 1. Протокол Timeline. Подкожные опухоли индуцированные у мышей и бактерий вводили при развитии опухоли (100 мм 3). Онлайн мышей BLI имв возрасте в различных временных точках сообщение бактериальной администрации (стрелки отображения типичных раза).
Рисунок 2. Администрация E. палочки MG1655 luxABCDE опухоли мышей подшипника. Подкожный 4T1 опухоли индуцированные в MF1 Nu / Nu мышей и E. палочки MG1655 luxABCDE вводить на развитие опухоли. Каждое животное получало 10 6 клеток вводится непосредственно в боковую хвостовую вену. Мыши были обследованы в четырех временных точках в ходе исследования (черные точки оси и изображения) с последующей восстановление жизнеспособных бактерий (КОЕ) из опухолей образца жертву мышей (гистограмма). Увеличение числа и бактериальные плазмиды экспрессии генов, в частности, в опухолях наблюдалась в течение долгого времени (представительных мышей показано на момент времени). Нажмите, чтобы увеличить показатель .
Рисунок 3. Отношения между внутриопухолевые бактериального числа и биолюминесценции. Жизнеспособных бактерий в опухоли были перечислены экс естественных условиях бактериальные культуры от опухоли после BLI в различные моменты времени пост IV администрации. Вход значения бактериального числа (КОЕ) по отношению к bioluminesce в естественных единицах на графике. Надежная корреляция между бактерий и бактериальных сигналы биолюминесценции наблюдаются R 2 = 0,9717 1.
Рисунок 4. 3D ИВИС изображения мышиного желудочно-кишечного тракта колонизирована E. палочки MG1655. GIT мышей была колонизирована перорального введения 10 9 КОЕ E. палочки в течение трех дней подряд. Пример изолированного изображения с 3D-томографии колонизировали мышь показано на рисунке.3D-изображения показывают цифровой атлас мыши скелета обеспечить анатомическую регистрации. E. палочки MG1655 биолюминесценции видна в зеленый при более низких, и фиолетовый на более высоких уровнях.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
В контексте генной терапии, использование биологических агентов для доставки терапевтических генов для пациентов показало большие надежды 3-5. Подобно вирусам, врожденные биологические свойства бактерий условия для эффективной доставки ДНК в клетки или ткани, особенно в контексте рака. Было показано, что бактерии способны естественным возвращение к опухоли при системном введении в результате высокого уровня репликации на местном уровне, либо на внешнем (не-инвазивных видов) или в опухолевых клетках (патогенов). Рак конкретных бактериальных репликации первоначально было связано с гипоксического характера солидных опухолей (низкий O 2 уровня), с анаэробного характера гипоксических / некротических областей внутри опухоли, способствующих росту анаэробные и факультативно анаэробных бактерий. В последнее время такие факторы, как нерегулярный, вытекающей кровоснабжение и местной иммунной подавления опухоли было предложено сыграть свою роль. Большинство доклинических исследованиях использовали xenogrкормовая опухоли моделей для исследования бактериальной колонизации опухолей вектор. Мышиной модели спонтанно возникающих опухолей больше напоминают клинической реальности в терминах сосудистую (потенциал переменной в бактериальной колонизации опухолей), и бактерии также были показаны, чтобы колонизировать такие модели 6. Различные доклинические и клинические испытания показали способность различных бактериальных штаммов для транспортировки и усиления генов, кодирующих факторы, такие как пролекарства-превращающего ферментов, токсинов, ингибиторов ангиогенеза, и цитокины, в частности в опухоли 4,7. В то время как бактериальная колонизация опухоли было показано, быть независимым от штамма бактерий и типа опухоли 6, выбор оптимального штамма для конкретной модели может отличаться - например, строгие анаэробы может быть более подходящим для больших некротических опухолях.
Мы разработан ряд штаммов, чтобы выразить luxABCDE кассеты 1,8-11. В протоколе говорится в видеоанимация использует люкс с метками E. палочки в качестве примера. E. палочка является частью флоры желудочно-кишечного тракта человека. Несколько исследований, изложенные безопасность внутривенного введения непатогенные Е. штаммов мышей, и их способность расти конкретно в опухоли 4,12. E. палочки MG1655 (как в данном исследовании), также колонизирует ЖКТ мышь с высоким уровнем 13.
Изучение бактерий в небольших моделях на животных имеет большое значение для целого ряда медицинских научных направлений, в том числе инфекционных заболеваний, хорошее здоровье и генной терапии. Например, адаптация этого протокола могут быть применимы к изучению бактериальных инфекций слежения, образование биопленки и т.д. Другой ген-систем репортер Также были рассмотрены, в том числе позитронно Топография выбросов (ПЭТ) в сочетании с бактериальным выражение тимидинкиназы (TK ), будь то эндогенной экспрессии в E. палочки или S. Typhimurium engineereD, чтобы выразить ген TK от Вирус простого герпеса (HSVtk) 14. Оба флуоресцентные (зеленый флуоресцентный белок и его варианты) и люминесцентные (люкс) гены доступны для бактерий. Преимущество использования бактериальной люциферазы в том, что люкс кассеты кодирует ферменты, необходимые для биосинтеза подложке, в результате чего непосредственно imagable агента 15. BLI основана на обнаружении биолюминесцентного света от объекта за счет использования охлаждением с зарядовой связью (ПЗС) камеры. Относительно простых измерительных приборов и отсутствие требований на предмет радиоактивности ставит технологии в пределах досягаемости среднего лаборатории. BLI отображает множество преимуществ по сравнению с другими в естественных условиях. Это простой в использовании, недорогой, быстрый и облегчает съемку нескольких животных одновременно, создавая небольшой фон с высокой чувствительностью.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Нет конфликта интересов объявлены.
Acknowledgments
Авторы хотели бы отметить поддержку, относящиеся к этой рукописи от Европейской комиссии Седьмой Рамочной Программы (PIOF-GA-2009-255466) и Ирландский совет по исследованиям в области здравоохранения (HRA_POR/2010/138). Lux-отмеченных E. палочка была своего рода подарок от доктора Кормак Гаан, University College Cork.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 4T1 cell line | ATCC | CRL-2539 | Syngeneic breast cancer model derived from a spontaneously arising BALB/c mammary tumor |
| DMEM | Sigma-Aldrich | D6429 | Dulbecco's Modified Eagle's Medium |
| PBS | Sigma-Aldrich | D8537 | Phosphate Buffered Saline |
| Xenogen IVIS | Caliper Life Sciences | IVIS 100 for 2D imaging; IVIS Spectrum for 3D. | |
| Luria Broth Miller (LB) | Sigma-Aldrich | L2542 | Growth medium for E. coli |
| Erythromycin | Sigma-Aldrich | E5389 | Antibiotic |
| Streptomycin | Sigma-Aldrich | S9137 | Antibiotic |
| MF1nu/nu mice | Harlan (UK) | 069(nu)/070(nu/+) | Hsd:Athymic Nude-Foxn1nu |
| Balb/c mice | Harlan (UK) | 066 | Haplotype:H-2d |
| Gavage needle | Vet-tech Solutions (UK) | DE009 | 22G x 38mm straight gavage needle |
| Syringe for IV injection | BD BioSciences | 309309 - 1 ml | Insulin syringe with 28 G x ½ inch micro-fine IV needle. |
| Syringe for tumor inoculation | Braun | 9161376V | Omnifix 26 G x ½ inch needle |
References
- Cronin, M., et al. High resolution in vivo bioluminescent imaging for the study of bacterial tumour targeting. PLoS One. 7, e30940 (2012).
- Kuo, C., Coquoz, O., Troy, T. L., Xu, H., Rice, B. W. Three-dimensional reconstruction of in vivo bioluminescent sources based on multispectral imaging. J. Biomed. Opt. 12, 024007 (2007).
- Tangney, M., Ahmad, S., Collins, S. A., O'Sullivan, G. C. Gene therapy for prostate cancer. Postgrad Med. 122, 166-180 (2010).
- Morrissey, D., O'Sullivan, G. C., Tangney, M. Tumour targeting with systemically administered bacteria. Curr. Gene Ther. 10, 3-14 (2010).
- Collins, S. A., et al. Viral vectors in cancer immunotherapy: which vector for which strategy. Curr. Gene Ther. 8, 66-78 (2008).
- Yu, Y. A., Zhang, Q., Szalay, A. A. Establishment and characterization of conditions required for tumor colonization by intravenously delivered bacteria. Biotechnol. Bioeng. 100, 567-578 (2008).
- Baban, C. K., Cronin, M., O'Hanlon, D., O'Sullivan, G. C., Tangney, M. Bacteria as vectors for gene therapy of cancer. Bioeng. Bugs. 1, 385-394 (2010).
- Cronin, M., et al. Orally administered bifidobacteria as vehicles for delivery of agents to systemic tumors. Mol. Ther. 18, 1397-1407 (2010).
- van Pijkeren, J. P., et al. A novel Listeria monocytogenes-based DNA delivery system for cancer gene therapy. Hum. Gene Ther. 21, 405-416 (2010).
- Ahmad, S., et al. Induction of effective antitumor response after mucosal bacterial vector mediated DNA vaccination with endogenous prostate cancer specific antigen. J. Urol. 186, 687-693 (2011).
- Riedel, C. U., et al. Improved luciferase tagging system for Listeria monocytogenes allows real-time monitoring in vivo and in vitro. Appl Environ Microbiol. 73, 3091-3094 (2007).
- Cheng, C. M., et al. Tumor-targeting prodrug-activating bacteria for cancer therapy. Cancer Gene Ther. 15, 393-401 (2008).
- Foucault, M. L., Thomas, L., Goussard, S., Branchini, B. R., Grillot-Courvalin, C. In vivo bioluminescence imaging for the study of intestinal colonization by Escherichia coli in mice. Appl. Environ. Microbiol. 76, 264-274 (2010).
- Collins, S. A., Hiraoka, K., Inagaki, A., Kasahara, N., Tangney, M. PET Imaging For Gene & Cell Therapy. Curr. Gene Ther. , (2012).
- Tangney, M., Francis, K. P. In vivo Optical Imaging in Gene & Cell Therapy. Curr. Gene Ther. , (2012).
