Summary
हाल ही में विकसित इमेजिंग निकट अवरक्त प्रतिदीप्ति (NIRF) तकनीक का उपयोग कर भूमिका लसीका प्रणाली कैंसर मेटास्टेसिस में खेलता है, प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया, घाव की मरम्मत, और अन्य लसीका जुड़े रोगों स्पष्ट करने में मदद कर सकते हैं.
Protocol
सभी जानवरों के अध्ययन टेक्सास स्वास्थ्य विज्ञान केंद्र (ह्यूस्टन, TX), तुलनात्मक चिकित्सा विभाग, और समीक्षा और उनके संबंधित संस्थागत पशु की देखभाल द्वारा प्रोटोकॉल के अनुमोदन के बाद आण्विक इमेजिंग के लिए केंद्र के विश्वविद्यालय के मानकों के अनुसार में प्रदर्शन किया गया और समिति का प्रयोग करें (IACUC) या पशु कल्याण समिति (AWC).
1. 24 Hr पशु इमेजिंग से पहले की तैयारी
नीचे कदम के रूप में की जरूरत दिन किया जाना चाहिए लसीका इमेजिंग से पहले जगह लेता है.
- एक प्रेरण बॉक्स में जगह जानवर और isoflurane साथ शांत.
- एक बार पशु गहरा संज्ञाहरण (पैर की अंगुली - चुटकी पैंतरेबाज़ी के साथ निगरानी), जगह एक डायपर / फुलाना और isoflurane गैस से जुड़े एक नाक शंकु में स्थिति नाक पैड पर बेहोश पशु के एक राज्य में है.
- क्लिप / imaged किया जा के आसपास के क्षेत्र बाल फर (यदि कोई हो).
- काटा क्षेत्र लोमनाशक एजेंट (नायर) लागू करते हैं और इसे छोड़ ओn 3 मिनट के लिए त्वचा.
- धीरे गर्म, नम धुंध या कागज तौलिया के साथ सभी लोमनाशक एजेंट पोंछ.
- धीरे गर्म पानी से त्वचा कुल्ला और धीरे धुंध या कागज तौलिया के साथ क्षेत्र सूखे.
- पशुओं के लिए एक हीटिंग पैड पर या एक गर्मी दीपक के तहत ठीक करने के लिए, और उनके पिंजरे में लौटने की अनुमति दें.
2. इमेजिंग के दिन
- Reconstitute बाँझ पानी के साथ इमेजिंग एजेंट, तो बाँझ सामान्य नमक (0.85%) का उपयोग करने के लिए भारतीय तट रक्षक या CABD - IRDye800 के लिए 200 सुक्ष्ममापी (6.8 μl μg/10) के लिए 645 सुक्ष्ममापी (5 μg/10 μl) को प्राप्त करने के अंधेरे में समाधान जलमिश्रित रखें. शर्तों और पुनर्गठन के 6 घंटे के भीतर उपयोग.
- एक प्रेरण बॉक्स में जगह जानवर और isoflurane साथ शांत.
- एक बार पशु गहरा (पैर की अंगुली - चुटकी पैंतरेबाज़ी साथ निगरानी) संज्ञाहरण, जगह एक डायपर / फुलाना और isoflurane गैस से जुड़े एक नाक शंकु में स्थिति नाक पैड पर अपने पक्ष पर बेहोश पशु के एक राज्य में है.
- लाइट बंद (ताकि कमरा हैअंधेरे). यदि आवश्यक हो, एक छोटी सी मेज हलोजन प्रकाश इंजेक्शन देख प्रकाश की एक छोटी राशि के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है.
- एक 31 गेज सुई के साथ एक इंसुलिन सिरिंज का उपयोग करना, प्रत्येक हिंद पंजा और / के पृष्ठीय पहलू में भारतीय तट रक्षक या CABD - IRDye800 50 μl आईडी या पूंछ के आधार के बाएँ और दाएँ पक्ष पर 5 μl पर निर्भर करता है इंजेक्षन, ब्याज की क्षेत्र (चर्चा देखने के लिए). प्रत्येक इंजेक्शन खुराक 0.083 से 1.25 मिलीग्राम / किग्रा (भारतीय तट रक्षक) या ०.११३ 1.7 मिलीग्राम / किलो (CABD IRDye800) लेकर कर सकते हैं. इंजेक्शन मात्रा पशु तनाव और इंजेक्शन साइट के साथ अलग अलग होंगे. Athymic चूहों के लिए इंजेक्शन की मात्रा 5 μl (हिंद पंजा) या 10 μl (पूंछ के आधार) हो सकता है यदि पशु इमेजिंग प्रणाली के तहत इंजेक्शन (ओं) के लिए नहीं है, के बाद इमेजिंग प्रणाली के तहत पशु तुरंत जगह कर सकते हैं. इंजेक्शन (ओं).
- यदि कोई डाई तेज lymphatics में देखा जाता है, 2,5 कदम के लिए दोहराया जाना चाहिए के रूप में पशु प्रोटोकॉल के अनुसार जरूरत होगी.
- एक बार lymphatics देखा जाता है, काला बिजली के टेप या काले देहात के साथ इंजेक्शन साइट को कवरप्रति.
- 1 का उपयोग घंटा लसीका छवियों मोल वी + + सॉफ्टवेयर और एक छोटे जानवर, इमेजिंग प्रणाली के NIRF. (पशु isoflurane साथ बेहोश कर रहे हैं और respirations जबकि छवियों को प्राप्त कर रहे हैं की निगरानी कर रहे हैं.) जबकि छोटे जानवर, NIRF imagers व्यावसायिक रूप से उपलब्ध हैं, हम एक स्वनिर्धारित, छोटे जानवर NIRF इमेजिंग एक 785 एनएम लेजर डायोड से मिलकर प्रणाली (1005-9mm 78,503 का उपयोग , तीव्र, North Brunswick, न्यू जर्सी) एक aspheric लेंस (-B के C24TME, Thorlabs, न्यूटन, NJ), विसारक (ED1-C20, Thorlabs) के साथ outfitted, और फिल्टर (LD01-785/10-25, Semrock, Rochester, NY ) कि वर्ग 10 सेंटीमीटर प्रति 1.4 मेगावाट से भी कम की एक घटना fluence दर पर पशु illuminates एक वर्दी उत्तेजना क्षेत्र बनाने के लिए. एक इलेक्ट्रॉन चार्ज किया युग्मित डिवाइस (EMCCD, PhotonMax512, प्रिंसटन उपकरण, Trenton, न्यू जर्सी) कैमरा प्रणाली गुणा दो 830 एनएम (AND11333, Andover कार्पोरेशन, सेलम, NH) फिल्टर और एक 28 मिमी Nikkor लेंस (1992, Nikon के साथ, Melville, NY) एकीकरण टिम के साथ लसीका छवियों पर कब्जा करने के लिए प्रयोग किया जाता है200 मिसे के गतिशील इमेजिंग और 800 मिसे के लिए के लिए स्थिर इमेजिंग 5 तों. सिस्टम विन्यास, प्रत्येक घटक की अतिरिक्त जानकारी के लिए टेबल, और प्रमुख imager संपत्तियों की एक संक्षिप्त चर्चा के लिए चर्चा के लिए 1 आंकड़ा देखें.
- एक हीटिंग पैड पर या एक गर्मी दीपक के तहत ठीक करने के लिए जानवरों और उनके पिंजरे में लौटने, या euthanize दें.
- ImageJ या MATLAB सॉफ्टवेयर का उपयोग कर छवियों का विश्लेषण. चित्रा 6 देखें.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
चूहों में लसीका NIRF इमेजिंग के उदाहरण
जब भारतीय तट रक्षक या CABD - IRDye800 आईडी एक सामान्य माउस की पूंछ के आधार पर इंजेक्ट किया जाता है, पूंछ के आधार पर इंजेक्शन साइट और वंक्षण लिम्फ नोड (LN) के बीच लसीका वाहिका संरचना तुरंत visualized होना चाहिए. इंजेक्शन के फौरन बाद (एक कुछ सेकंड मिनट के लिए), वंक्षण LN और कक्षा LN के बीच लसीका वाहिका visualized किया जा के रूप में चित्रा 2 में देखा जाना चाहिए. चूंकि चूहों में lymphatics जानवर से जानवर को भिन्न रूप में वे मनुष्यों में, जानवरों के बीच संरचना में परिवर्तन के रूप में 3 चित्र में दिखाया देखा जा सकता है. जब भारतीय तट रक्षक या NIRF - CABD आईडी एक सामान्य माउस के हिंद पंजा का पृष्ठीय पहलू पर इंजेक्ट किया जाता है, दो लसीका वाहिकाओं जानुपृष्ठीय LN draining कल्पना के रूप में 4 चित्र में दिखाया जा सकता है. कुछ मामलों में, यह मुश्किल है कि एक दूसरे के साथ उनके करीबी निकटता की वजह से दोनों जहाजों भेद.
कई बार, lymphatics के दृश्य में देरी है, सबसे subcutaneously प्रशासित किया जा रहा है आईडी के बजाय इंजेक्शन (SC) के कारण सामान्यतः. जब अनुसूचित जाति इंजेक्शन दिया जाता है, लसीका परिवहन तुरंत कल्पना के रूप में चित्रा 5 में देखा (क) डाई के लिए आवश्यक तक पहुँचने और लसीका केशिकाओं के द्वारा त्वचा में लिया अतिरिक्त समय की वजह से नहीं हो सकता है. यही कारण है कि यह महत्वपूर्ण है कि अनुसूचित जाति के बजाय आईडी इंजेक्षन. इस अवसर पर, असामान्य लसीका वाहिकाओं मनाया रहे हैं, के रूप में चित्रा 5 (ख) में देखा या बाल / फर कतरनी से काटने में कटौती के रूप में एक घाव के क्षेत्र में. पशु के शरीर का तापमान सामान्य सीमा के भीतर बनाए रखा जाना चाहिए, क्योंकि शरीर के तापमान को बदलने असंगत लसीका समारोह में परिणाम कर सकते हैं. तकनीक की सीमाओं फ्लोरोसेंट लसीका वाहिकाओं की त्वचा pigmentation द्वारा तमसावृतीकरण, छवि अक्षमता गहरी वक्ष लसीका कारण नलिकाओंऊतक में बिखरने प्रकाश, और लसीका समारोह पर अज्ञात संज्ञाहरण के प्रभाव.
आम तौर पर, यह 2 दिनों के भारतीय तट रक्षक या CABD - IRDye800 आईडी डिपो लेता जिगर और मूत्राशय स्पष्ट है, और ऊपर से 3 दिनों के लिए इंजेक्शन साइट स्पष्ट. जब अवशिष्ट फ्लोरोसेंट संकेत को मंजूरी दे दी है, इमेजिंग प्रोटोकॉल, दोहराया जा सकता है अनुदैर्ध्य लसीका इमेजिंग कुछ हस्तक्षेप के बाद वास्तुकला या लिम्फ समारोह में परिवर्तन का मूल्यांकन करने के लिए अनुमति देता है.
लिम्फेटिक समारोह का विश्लेषण
अधिग्रहीत छवियों ImageJ या MATLAB में डेटा विश्लेषण के लिए लोड किया जा सकता है. लगातार क्षेत्र, परिपत्र ROIs चयनित या फ्लोरोसेंट लसीका पोत की पूरी लंबाई के रूप में 10 मानव और पशु 5 लसीका इमेजिंग के लिए किया है के आंकड़े 6 (क) और 6 चित्रा (घ) के रूप में दिखाया गया साथ तैयार कर रहे हैं. ROIs में चयन कर रहे हैं कि उनके व्यास लगभग प्रतिदीप्ति की छवि का व्यासNT के पोत. प्रत्येक ROI ज़्यादा से ज़्यादा के भीतर मतलब प्रतिदीप्ति तीव्रता इमेजिंग के लिए आगे बढ़नेवाला और डाई से लदी लसीका के "पैकेट" की आवृत्ति के वेग का आकलन करने के लिए समय के एक समारोह के रूप में साजिश रची है लसीका वाहिकाओं साथ चालित आंकड़े 6 (ख) और चित्रा 6 में दिखाया के रूप में (ई ). के लसीका प्रसार और लसीका प्रणोदन के वेग आवृत्ति का आकलन करने के लिए, दो आरओआई स्पष्ट रूप से परिभाषित मॅक्सिमा minima या फ्लोरोसेंट तीव्रता लसीका के पैकेट के प्रसार का प्रतिनिधित्व विविधताओं के साथ, चयनित कर रहे हैं और अपने फ्लोरोसेंट तीव्रता प्रोफाइल प्लॉट किए जाते हैं के रूप में 6 आंकड़े (ग) में दिखाया गया है और 6 (च). प्रचार वेग लसीका के एक पैकेट के लिए दो आरओआई और पारगमन समय के बीच दूरी के अनुपात के लिए उन दोनों के बीच प्रचार लेने के द्वारा की जाती है. फ्लोरोसेंट दालों या "पैकेट" समय प्रति एक एकल रॉय पर पहुंचने की संख्या का आकलन करके, सिकुड़ा आवृत्ति गणना है. हालांकि इस तकनीक केवल विधि asse प्रदान करता हैएस एस प्रणोदन आवृत्ति और एक प्रोपेल्ड लसीका के वेग दूसरों पैकेट "," परोक्ष रूप से एक इमेजिंग एजेंट के डिपो मंजूरी मापने के द्वारा लसीका परिवहन का मूल्यांकन किया और इस तरह से हटाने की दर 11 स्थिरांक की गणना. कैंसर 10 और जल्दी संक्रमण metastases में, हम जानवरों में लसीका प्रणोदन के नुकसान लगता है. अन्य 12 गठिया के जवाब में सिकुड़ना में परिवर्तन की रिपोर्ट. मनुष्यों में, हम वायवीय संपीड़न 13 जल निकासी और मैनुअल लसीका जल निकासी (मालिश) 14 सहित lymphedema उपचार के बाद बढ़ प्रणोदन रिपोर्ट.
चित्रा 1 NIRF इमेजिंग प्रणाली छोटे पशु लसीका इमेजिंग के लिए कस्टम निर्मित है. डिवाइस एक 785 एनएम लेजर डायोड एक aspheric लेंस, diffus साथ outfitted के होते हैंएर, और एक वर्दी उत्तेजना क्षेत्र है कि जानवर और एक EMCCD कैमरे illuminates फिल्टर, ध्यान केंद्रित लेंस, और ऑप्टिकल फिल्टर फ्लोरोसेंट 10 लसीका की छवियों पर कब्जा करने के लिए.
चित्रा 2. जब एक 31-गेज सुई, पूंछ के आधार पर इंजेक्शन साइट और वंक्षण लसीका LN के बीच लसीका वाहिका संरचना का उपयोग कर एक सामान्य माउस की पूंछ के आधार पर भारतीय तट रक्षक के 10 μl या CABD IRDye800 आईडी इंजेक्ट किया जाता है तुरंत देखे होना चाहिए. गतिशील प्रतिदीप्ति छवियों और 20 मिनट निम्नलिखित इंजेक्शन के लिए इंजेक्शन के तुरंत बाद हासिल किया है. इंजेक्शन के फौरन बाद (एक कुछ सेकंड मिनट के लिए), इंजेक्शन साइट और वंक्षण LN और बाद में कक्षा LN क्षेत्र के बीच लसीका वाहिकाओं पार्श्व दृश्य पर देखे हैं. चित्रा 2 में दिखाया छवि 5 मिनट से लिया गया था. इंजेक्शन वाई के बादवें आईडी पूंछ के आधार पर भारतीय तट रक्षक के 10 μl. वंक्षण और कक्षा क्षेत्रों के बीच उज्ज्वल हाजिर जिगर है.
चित्रा 3. चूंकि चूहों में lymphatics जानवर से जानवर को भिन्न रूप में वे मनुष्यों में, जानवरों के बीच संरचना में परिवर्तन और देखा जा सकता है समय के साथ स्थिर है. # 124 माउस पूंछ के आधार पर भारतीय तट रक्षक इंजेक्शन के साथ किया गया था और 1 दिन पर तुरंत imaged. शीर्ष पैनल में 1 दिन के रूप में के रूप में अच्छी तरह से एक 2 दिन बाद प्राप्त छवि (3 दिन) ही माउस और इंजेक्शन / इमेजिंग प्रोटोकॉल का उपयोग पर प्राप्त छवि है. नीचे के पैनल में एक और (127 #) भारतीय तट रक्षक और तुरंत imaged 1 दिन और बाद में 3 दिन पर imaged इंजेक्शन के साथ माउस से प्राप्त छवियों शामिल है. जबकि लसीका वास्तुकला (लसीका वाहिकाओं के पैटर्न) मो बीच बदलता है124 और # 127 का उपयोग करने के लिए, छवियों NIRF का उपयोग कर प्राप्त 1 दिन और 3 पर प्रत्येक माउस के लिए संगत कर रहे हैं.
चित्रा 4. जब भारतीय तट रक्षक या NIRF CABD 5-10 μl आईडी एक सामान्य माउस के हिंद पंजा का पृष्ठीय पहलू पर इंजेक्ट किया जाता है, दो लसीका वाहिकाओं जानुपृष्ठीय LN draining visualized किया जाना चाहिए. गतिशील प्रतिदीप्ति छवियों और 20 मिनट निम्नलिखित इंजेक्शन के लिए इंजेक्शन के तुरंत बाद हासिल किया है. कुछ मामलों में यह मुश्किल है क्योंकि उनकी निकटता के दोनों जहाजों भेद के रूप में बढ़े छवि धराशायी बॉक्स द्वारा प्रतिनिधित्व में सचित्र है. प्रतिनिधि माउस यहाँ दिखाया, भारतीय तट रक्षक के 10 μl बाएँ, हिंद पंजा (1 इंजेक्शन साइट) के पृष्ठीय पहलू में इंजेक्ट किया गया था और पूंछ आधार (2 इंजेक्शन साइट) के पक्ष में छोड़ दिया. इस छवि caपहले इंजेक्शन के बाद 3 मिनट और लगभग 30 सेकंड - 1 मिनट के बाद दूसरा इंजेक्शन लगभग 2 ptured.
चित्रा 5 (क) lymphatics के दृश्य कभी कभी देरी या बिगड़ा, सबसे आईडी के बजाय अनुसूचित जाति प्रशासित इंजेक्शन की वजह से आमतौर पर. जब भारतीय तट रक्षक के 10 μl या CABD IRDye800 अनुसूचित जाति के एक सामान्य 31-गेज एक सुई का उपयोग माउस की पूंछ के आधार पर इंजेक्ट किया जाता है, परिवहन लसीका तुरंत visualized अतिरिक्त डाई के लिए आवश्यक समय की वजह से नहीं हो पहुँचने के लिए और किया जाएगा लिया त्वचा में लसीका केशिकाओं द्वारा. इसके अलावा, अपेक्षाकृत गहरी SC इंजेक्शन के कारण, वहाँ कोई लसीका तेज और इसलिए वाहिकाओं और लिम्फ नोड्स का कोई दृश्य हो सकता है. चित्रा 5 (एक), एक माउस पूंछ अनुसूचित जाति और छवियों के आधार पर भारतीय तट रक्षक थे इंजेक्शन के बाद 5 मिनट का अधिग्रहण के 10 μl के साथ इंजेक्शन था. इंजेक्शन स्थल पर डाई देखे जा सकता है और कोई लसीका वाहिकाओं या लिम्फ नोड्स देखे जा सकते हैं कर सकते हैं. यह कारण आईडी इंजेक्शन महत्वपूर्ण हैं है (ख) पशु न्यायपालिका लसीका वाहिकाओं के एक घाव से उत्पन्न उदर पक्ष से विज़ुअलाइज़ेशन कतरनी के साथ फर हटाने (ऊतक चोट साइट पशु के दाईं ओर पर नोट) के दौरान एक दिन पहले का सामना करना पड़ा. छवि भारतीय तट रक्षक के 10 μl के बाद लगभग 5 मिनट पर कब्जा कर लिया गया था प्रत्येक बाएँ और दाएँ पक्ष पर पूंछ के आधार पर पहचान दिलाई. गैर घायल पक्ष (पशु बाईं), वंक्षण LN के रूप में के रूप में अच्छी तरह से अपेक्षाकृत सीधे अपवाही लसीका कक्षा LNS ओर draining पोत देखे जा सकते हैं. माउस के सही पक्ष पर, तथापि, सामान्य लसीका vasculature घायल के कारण बाधित किया गया था और ऊतकों की मरम्मत (गद्दारी) की वजह से न्यायपालिका प्रकट होता है.
चित्रा 6 लसीका सिकुड़ा समारोह के मात्रात्मक विश्लेषण लसीका वाहिकाओं (क) कक्षा LN वंक्षण LN और (घ) जानुपृष्ठीय LN पंजा के पृष्ठीय पहलू पर इंजेक्शन साइट से draining साथ ROIs के चयन के होते हैं. लाल धराशायी आयत के एक बढ़ाया छवि ((एक) में इनसेट) फ्लोरोसेंट पोत के साथ ROIs के चयन को दिखाता है. सभी ROIs के लिए समय के एक समारोह के रूप में (क) और (घ) (ख) और (ई), क्रमशः में छद्म रंग दिखाया साजिश द्वारा प्रतिनिधित्व किया है से औसत प्रतिदीप्ति तीव्रता का एक संकलन. पिक्सल भर में प्रतिदीप्ति तीव्रता में perturbations एक लसीका "पल्स" ROIs और गिरफ्तारी के माध्यम से प्रचार का प्रतिनिधित्व करते हैंतीर समानांतर ई. औसत प्रतिदीप्ति तीव्रता (ख) से एकल ROIs 22 और 45 के लिए (ग) और एकल ROIs 18 और 34 के लिए औसत से प्रतिदीप्ति तीव्रता (ङ) (च) में दिखाया जाता है में दिखाए जाते हैं. समय के एक समारोह के प्रचार लसीका और पारगमन और ROIs दो के बीच के समय दूरी की निकासी के पैकेट की पहचान की सुविधा (के रूप में (ग) और (च) में दिखाया गया है) के रूप में प्रतिदीप्ति तीव्रता प्रोफाइल. दो ROIs और स्पष्टता के साथ जो मॅक्सिमा और minima का प्रतिनिधित्व लसीका प्रचार दिखाए जाते हैं लसीका पोत के साथ अपने स्थान पर भाग में स्थित का चयन कर रहे हैं. वेग ROIs दो और पारगमन समय है कि शिखर प्रतिदीप्ति तीव्रता के बीच में ले लिया है के बीच की दूरी के अनुपात के रूप में की जाती है. बड़ा आंकड़ा देखने के लिए यहाँ क्लिक करें
7 चित्रा वंक्षण क्षेत्र से कक्षा क्षेत्र draining lymphatics कल्पना, पूंछ के आधार के बाईं या दाईं ओर इंजेक्षन. सामान्य में, बाईं ओर कल्पना, स्थान 5, 6, 9, या 10 में इंजेक्षन, और सही पक्ष कल्पना, 7 स्थान में सुई, 8, 11, या 12. 4 के माध्यम से एक स्थान भी इष्टतम तेज कक्षा क्षेत्र वंक्षण क्षेत्र से लसीका जल निकासी कल्पना के लिए पूंछ पर अवर हो सकता है.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
हम एक रिवाज है, छोटे जानवर NIRF इमेजिंग प्रणाली का उपयोग करने के लिए लेबल चूहों में लसीका वाहिकाओं की छवियों पर कब्जा. लसीका आंदोलन की फिल्मों का निर्माण करने के लिए, 300 या अधिक छवियों को एकत्र कर रहे हैं. फिल्मों से lymphatics के कार्यात्मक विश्लेषण के लिए, दो या दो से अधिक ROIs स्वयं एक लसीका पोत के साथ तैयार कर रहे हैं. ROIs के आयामों प्रत्येक पोत के लिए स्थिर रखा जाता है और लगभग पोत के व्यास हैं. जबकि पूरे पशु स्थानिक संकल्प 100 या उससे कम माइक्रोन फ्लोरोसेंट लसीका वाहिकाओं का वर्णन कर सकते हैं, बेहतर संकल्प छवियों के लिए एक macrolens 10 नियोजित किया जा सकता है. संरचनात्मक संदर्भ के लिए सफेद प्रकाश छवियों को भी एक दीपक कम शक्ति का उपयोग कर प्राप्त किया जा सकता है. यह ध्यान दिया जाना चाहिए कि अगर इमेजिंग एजेंट अलग उत्तेजना / प्रतिदीप्ति उत्सर्जन स्पेक्ट्रा, तो ऊपर वर्णित फिल्टर के साथ अन्य फ्लोरोसेंट रंगों के शामिल हैं इमेजिंग प्रदर्शन को बनाए रखने बदल किया जाना चाहिए, खुराक और एजेंट के रूप में अच्छी तरह से समायोजित करने की आवश्यकता हो सकती है. इसके अलावा, अगर उत्तेजना तरंग दैर्ध्य ले रहा हैएस एस 750 एनएम से, तो autofluorescence परिणाम, पृष्ठभूमि संकेत में वृद्धि होगी, हो सकता है और इमेजिंग संवेदनशीलता में कमी होगी. इसके अलावा, समाधान में एजेंट की अस्थिरता जैसे कुछ 7 Cyanine (Cy7) NIRF रंजक, के प्रयोग को रोकना हो सकता है.
उचित इंजेक्शन साइट का चयन जो लसीका वाहिकाओं का अध्ययन किया जा रहा है पर निर्भर करेगा. वंक्षण क्षेत्र से कक्षा क्षेत्र draining lymphatics कल्पना करने के लिए, आप पूंछ के आधार के बाईं या दाईं ओर इंजेक्षन की जरूरत है, के रूप में 7 चित्रा में दिखाया जाएगा. महलनुमा क्षेत्र से draining lymphatics कल्पना, आप हिंद पंजा के पृष्ठीय पहलू इंजेक्षन की आवश्यकता होगी. यह पशु के शरीर का तापमान सामान्य सीमा के भीतर रखने के लिए आवश्यक है, के रूप में शरीर के तापमान को बदलने असंगत लसीका समारोह में परिणाम कर सकते हैं. इसके अलावा, ज्यादातर ccds के सीमित गतिशील रेंज की वजह से, इंजेक्शन साइटों काले कागज के साथ कवर किया जाना चाहिए फ्लोरोसेंट रोशनी thereb ब्लॉकy लसीका वाहिकाओं draining dimmer के दृश्य को सक्षम. अवांछित पृष्ठभूमि कमरे में रोशनी से प्रतिदीप्ति बैंड में प्रकाश का उत्सर्जन के कारण संकेतों को कम इमेजिंग एक अंधेरे कमरे में किया जाना चाहिए. जानवर भी एक काले रंग की पृष्ठभूमि पर झूठ बोल रही है किया जाना चाहिए, जबकि इमेजिंग प्रकाश backscatter को कम करने के लिए प्रदर्शन किया जा रहा है.
NIRF लसीका इमेजिंग लसीका रोगों और बीमारी या चोट करने के लिए सम्मान के साथ लसीका वास्तुकला और समारोह कैसे परिवर्तन की एक बेहतर समझ के लिए सक्षम हो सकता है. उदाहरण के लिए, अनुसंधान टीम NIRF इमेजिंग छोटे जानवरों में इस्तेमाल किया गया है 6,15 जानवरों के लसीका phenotyping प्रदान और लसीका और कैंसर 10 metastases के साथ समारोह वास्तुकला में परिवर्तन का पता लगाने के. मनुष्यों में, तकनीक lymphedema 2 के प्रारंभिक लक्षण का पता लगाने के, lymphedema 13,14,16 चिकित्सा, और phenotype वंशानुगत लसीका विकारों के साथ परिवार के सदस्यों के जवाब का आकलन करने के लिए इस्तेमाल किया गया है. हालांकि, गैर इनवेसिव वीमनुष्यों में गहरी lymphatics (> 3 सेमी) isualization ऊतकों में प्रकाश की तितर बितर द्वारा सीमित है. लसीका संरचनाओं की गहराई में 3 सेमी छवियाँ 9 सूअर और मानव इमेजिंग में अधिग्रहण किया गया है. मनुष्यों में, एमआरआई और गतिशील lymphoscintigraphy विपरीत इंजेक्शन साइट से रोग में लिम्फ नोड्स के लिए एजेंट के पारगमन समय यों इस्तेमाल किया गया है. हालांकि, वे पर्याप्त अस्थायी और स्थानिक लसीका प्रणोदन घटनाओं तत्काल NIRF साथ imaged कल्पना संकल्प की कमी है. इसके अलावा, स्वस्थ lymphatics एमआरआई विपरीत की कमी के कारण के साथ कल्पना नहीं कर रहे हैं. NIRF गैर इनवेसिव इमेजिंग confocal multiphoton माइक्रोस्कोपी और intravital इमेजिंग के विपरीत है. आमतौर पर confocal multiphoton और माइक्रोस्कोपी तकनीक आंशिक रूप से या पूरी तरह से resected ऊतक का उपयोग. इस Scintographic तरीकों radionuclides और कभी कभी मामूली पोत केन्युलेशन का उपयोग की जरूरत है. एक अन्य विधि lymphatics कल्पना intravital इमेजिंग के दौरान जो माउस है शामिलeuthanized dermis और वापस आईडी इवांस ब्लू डाई के इंजेक्शन के बाद खींच लिया है. हालांकि, इस पद्धति कार्यात्मक या अनुदैर्ध्य इमेजिंग 17,18 प्रदान नहीं करता है. LN metastases एक सीमेंस Inveon पीईटी / सीटी उपयोग imaged किया जा सकता है, लेकिन इस तकनीक लसीका संरचना या समारोह 19 के दृश्य नहीं की अनुमति नहीं है.
जबकि लेखकों की सिफारिश नहीं है और न ही किसी भी विशिष्ट वाणिज्यिक इमेजिंग डिवाइस का समर्थन करते हैं, हमारे अनुभव से पता चलता है कि प्रकाश स्रोत और ऑप्टिकल फिल्टर के चुनाव सबसे महत्वपूर्ण कारक है जो युक्ति की संवेदनशीलता को निर्धारित करता है हो सकता है. झू एट अल द्वारा वर्णित, डाई की कम मात्रा के सफल इमेजिंग के लिए, प्रकाश स्रोत और ऑप्टिकल 20 फिल्टर की ट्रांसमिशन स्पेक्ट्रम के उत्सर्जन स्पेक्ट्रम के बीच न्यूनतम ओवरलैप होना चाहिए. एक अन्य महत्वपूर्ण विचार अवशोषण और उत्सर्जन स्पेक्ट्रम NIRF डाई का प्रयोग किया जाता है. इस कागज भारतीय तट रक्षक और CABD IRDye800 में इसी तरह के विशेष हैCtra और इतने वर्णित लेजर डायोड तरंग दैर्ध्य और फिल्टर संयोजनों प्रत्येक के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, लेकिन, अगर एक और डाई करने के लिए इस्तेमाल किया जा रहा है जो और को अवशोषित नहीं करता है / या इन तरंगदैर्य पर प्रतिदीप्ति, प्रकाश स्रोत के तरंगदैर्ध्य और ऑप्टिकल फिल्टर होना चाहिए तदनुसार समायोजित भारतीय तट रक्षक कई अनुप्रयोगों के लिए पर्याप्त हो सकता है, और पहले से ही है एफडीए को मंजूरी दी है. NIRF CABD मानव में इस्तेमाल के लिए एफडीए को मंजूरी दे दी है, लेकिन पशु इमेजिंग के लिए उपयोगी हो सकता है. भारतीय तट रक्षक रासायनिक लक्ष्यीकरण moieties संलग्न करने के लिए अवशेषों को जोड़ने नहीं है, तो अन्य फ्लोरोसेंट एजेंटों, NIRF CABD के रूप में विकसित किया जा रहा है.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
लेखक खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है, लेकिन कुछ लेखकों एक पेटेंट पर सूचीबद्ध हैं.
Acknowledgments
NIH R01 CA128919 और NIH R01 HL092923: यह काम ईवा Sevick निम्नलिखित अनुदान द्वारा समर्थित किया गया.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Indocyanine green (ICG) | Patheon Italia S.P.A. | NDC 25431-424-02 | Reconstitute to 645 μM (5 μg/10 μL) |
| Cyclic Albumin Binding Domain(cABD) | Bachem | Custom | Reconstitute to 200 μM (6.8 μg/10 μL) |
| IRDye800 | Li-COR | IRDye 800CW | Reconstitute according to manufacture's instructions; conjugate with cABD at equilmolar concentrations |
| Sterile Water | Hospira, Inc., Lake Forest, IL | NDC 0409-4887-10 | |
| NAIR | Church Dwight Co., Inc. | Local Stores | www.nairlikeneverbefore.com |
| Imaging System (components below) | Center for Molecular Imaging | N/A | Custom-built in our laboratories. |
| Electron-multiplying charge-coupled device (EMCCD) camera | Princeton Instruments, Trenton, NJ | Photon Max 512 | |
| Nikon camera lens | Nikon Inc., Melville, NY | Model No. 1992, Nikkor 28mm | |
| Optical filter | Andover Corp., Salem,NH | ANDV11333 | Two 830.0/10.0 nm bandpass filters are used in front of lens |
| 785-nm laser diode | Intense Ltd, North Brunswick, NJ | 1005-9MM-78503 | 500 mW of optical output |
| Collimating optics | Thorlabs, Newton, NJ | C240TME-B | Collimates laser output prior to cleanup filter |
| Clean-up filter | Semrock, Inc., Rochester, NY | LD01-785/10-25 | Removes laser emission in fluorescence band |
| Optical diffuser | Thorlabs, Newton, NJ | ED1-C20 | Diffuses the laser over the animal |
| V++ | Digital Optics, Browns Bay, Auckland, New Zealand | Version 5.0 | Software used to control camera system and save images to computer. http://digitaloptics.net/ |
| Analytic Software Either of the following software packages can be used for image analysis | |||
| ImageJ | National Institutes of Health, Bethesda, MD | Most current version available | Freeware available at http://rsbweb.nih.gov/ij/ |
| MATLAB | MathWorks, Natick, MA | Version 2008a or later | http://www.mathworks.com/ |
References
- Alitalo, K. The lymphatic vasculature in disease. Nat. Med. 17, 1371-1380 (2011).
- Rasmussen, J. C., Tan, I. C., Marshall, M. V., Fife, C. E., Sevick-Muraca, E. M. Lymphatic imaging in humans with near-infrared fluorescence. Curr. Opin. Biotechnol. 20, 74-82 (2009).
- Rasmussen, J. C., et al. Human Lymphatic Architecture and Dynamic Transport Imaged Using Near-infrared Fluorescence. Transl. Oncol. 3, 362-372 (2010).
- Sevick-Muraca, E. M. Translation of near-infrared fluorescence imaging technologies: emerging clinical applications. Annu. Rev. Med. 63, 217-231 (2012).
- Kwon, S., Sevick-Muraca, E. M. Noninvasive quantitative imaging of lymph function in mice. Lymphat. Res. Biol. 5, 219-231 (2007).
- Kwon, S., Sevick-Muraca, E. M. Mouse phenotyping with near-infrared fluorescence lymphatic imaging. Biomed Opt Express. 2, 1403-1411 (2011).
- Marshall, M. V., et al. Near-infrared fluorescence imaging in humans with indocyanine green: a review and update. The Open Surgical Oncology Journal. 2, 12-25 (2010).
- Davies-Venn, C. A., et al. Albumin-Binding Domain Conjugate for Near-Infrared Fluorescence Lymphatic Imaging. Mol. Imaging Biol. , (2011).
- Sharma, R. Quantitative imaging of lymph function. Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 292, 3109-3118 (2007).
- Kwon, S., Sevick-Muraca, E. M. Functional lymphatic imaging in tumor-bearing mice. J. Immunol. Methods. 360, 167-172 (2010).
- Karlsen, T. V., McCormack, E., Mujic, M., Tenstad, O., Wiig, H. Minimally invasive quantification of lymph flow in mice and rats by imaging depot clearance of near-infrared albumin. Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 302, 391-401 (2012).
- Zhou, Q., Wood, R., Schwarz, E. M., Wang, Y. J., Xing, L. Near-infrared lymphatic imaging demonstrates the dynamics of lymph flow and lymphangiogenesis during the acute versus chronic phases of arthritis in mice. Arthritis Rheum. 62, 1881-1889 (2010).
- Adams, K. E., et al. Direct evidence of lymphatic function improvement after advanced pneumatic compression device treatment of lymphedema. Biomed. Opt. Express. 1, 114-125 (2010).
- Tan, I. C., et al. Assessment of lymphatic contractile function after manual lymphatic drainage using near-infrared fluorescence imaging. Arch. Phys. Med. Rehabil. 92, 756-764 (2011).
- Lapinski, P. E., et al. RASA1 maintains the lymphatic vasculature in a quiescent functional state in mice. J. Clin. Invest. 122, 733-747 (2012).
- Maus, E. A., et al. Near-infrared fluorescence imaging of lymphatics in head and neck lymphedema. Head Neck. 34, 448-453 (2012).
- Galanzha, E. I., Tuchin, V. V., Zharov, V. P. Advances in small animal mesentery models for in vivo flow cytometry, dynamic microscopy, and drug screening. World J. Gastroenterol. 13, 192-218 (2007).
- Schramm, R., et al. The cervical lymph node preparation: a novel approach to study lymphocyte homing by intravital microscopy. Inflammation research : official journal of the European Histamine Research Society. 55, 160-167 (2006).
- Hall, M. A., et al. Imaging prostate cancer lymph node metastases with a multimodality contrast agent. Prostate. 72, 129-146 (2012).
- Zhu, B., Sevick-Muraca, E. M. Minimizing excitation leakage and maximizing measurement sensitivity for molecular imaging with near-infrared fluorescence. J. Innovat. Opt. Health Sci. 4, 301-307 (2011).
